基于適體的多重測(cè)定的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)描述了用于檢測(cè)測(cè)試樣品中可能存在的一種或多種靶分子的方法、裝置、試劑和試劑盒。所描述的方法、裝置、試劑盒和試劑有助于通過(guò)對(duì)核酸(即，適體)進(jìn)行檢測(cè)和定量來(lái)對(duì)測(cè)試樣品中的非核酸靶標(biāo)(例如，蛋白質(zhì)靶標(biāo))進(jìn)行檢測(cè)和定量，其中顯著減少或消除適體-適體相互作用，同時(shí)維持適體-靶標(biāo)相互作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于適體的多重測(cè)定
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年6月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/656,956的權(quán)益， 所述臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般涉及經(jīng)設(shè)計(jì)以改良基于適體的多重測(cè)定的性能的方法、裝置、試劑和 試劑盒。此類(lèi)方法在診斷應(yīng)用以及生物標(biāo)記物探索和研宄工具的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)及基于適體的 治療劑的開(kāi)發(fā)中具有廣泛效用。具體地說(shuō)，提供了用于減少或消除背景信號(hào)的材料和方法。
[0004] 背景
[0005] 以下描述提供了與本公開(kāi)相關(guān)的信息的匯總，而不是承認(rèn)本文中所提供的任何信 息或所參考的任何出版物是在要求保護(hù)的本發(fā)明之前的技術(shù)。
[0006] 針對(duì)生物樣品和其它樣品中的生理學(xué)上重要的分子的檢測(cè)和定量的諸多測(cè)定在 科學(xué)研宄和衛(wèi)生保健領(lǐng)域是重要的工具。一類(lèi)所述測(cè)定涉及使用包括一個(gè)或多個(gè)被固定在 固體支持物上的適體的微陣列。所述適體各自能夠以高特異性方式且以極高親和力結(jié)合 靶分子。參見(jiàn)例如標(biāo)題為"NucleicAcidLigands"的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 475, 096,還參見(jiàn)例如 美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 242, 246、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 458, 543和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 503, 715,各專(zhuān)利的標(biāo)題為 "NucleicAcidLigandDiagnosticBiochip"。一旦微陣列與樣品接觸，適體就結(jié)合樣品中 所存在的其各自的靶分子，且從而能夠測(cè)定靶分子在樣品中不存在、存在、量和/或濃度。
[0007] 還描述了多重適體測(cè)定，所述測(cè)定提供了經(jīng)設(shè)計(jì)以去除測(cè)定混合物的特定組分的 基于溶液的靶相互作用和分離步驟，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 855, 054和7, 964, 356及美國(guó)公布 號(hào)US/2011/0136099和US/2012/0115752。所描述的適體測(cè)定方法使用一個(gè)或多個(gè)特異性 捕獲步驟從欲檢測(cè)的靶標(biāo)分離測(cè)試樣品的組分，同時(shí)分離適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物。
[0008] 許多測(cè)定形式的敏感性和特異性因檢測(cè)方法在測(cè)定期間從由于非特異性締合產(chǎn) 生的信號(hào)中解析真信號(hào)且產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的能力而受到限制。這對(duì)基于適體的多重測(cè)定尤 其如此。已經(jīng)觀(guān)察到，此類(lèi)型測(cè)定中的非特異性結(jié)合的主要來(lái)源之一是非預(yù)期適體-適體 相互作用的功能。由于靶標(biāo)/適體相互作用取決于維持靶特異性適體的結(jié)構(gòu)特征，所以減 少適體-適體相互作用的任何方法都需要受到制衡，以便不減少特異性/靶適體相互作用。 本公開(kāi)描述了消除單一或多重適體測(cè)定中的背景同時(shí)維持靶標(biāo)/適體特異性相互作用的 方法。 發(fā)明概要
[0009] 本公開(kāi)提供了經(jīng)設(shè)計(jì)以改良單一分析物和基于適體的多重測(cè)定的性能的方法、裝 置、試劑和試劑盒。具體地說(shuō)，提供了用于減少或消除背景信號(hào)的材料和方法。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了對(duì)靶分子和第一可釋放標(biāo)簽具有高親和力和特異性的 適體。在一些實(shí)施方案中，適體是光適體。在一些實(shí)施方案中，這種第一可釋放標(biāo)簽是可光 裂解生物素。描述了其它標(biāo)簽和可裂解部分及含有所述標(biāo)簽和可裂解部分的適體。
[0011] 在與測(cè)試樣品進(jìn)行平衡結(jié)合之前，在溶液中將包含對(duì)靶分子具有特異性親和力的 第一可釋放第一標(biāo)簽的適體固定在固體支持物上。適體與固體支持物的連接是通過(guò)使第一 固體支持物與適體接觸并且允許適體上所包括的可釋放第一標(biāo)簽直接或間接地與連接到 第一固體支持物或?yàn)榈谝还腆w支持物一部分的適當(dāng)?shù)谝徊东@劑締合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在連接之后， 利用被緩沖到pH11的溶液進(jìn)行洗滌，以去除適體/適體聚集物，從而減少測(cè)定背景（下文 定義的"Catch-0"固定）
[0012] 然后制備測(cè)試樣品并且與對(duì)其各自靶分子具有特異性親和力的固定的適體接觸。 如果測(cè)試樣品含有靶分子，則適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物將在與測(cè)試樣品的混合物中形成。注 意，除適體-靶標(biāo)復(fù)合物以外，未復(fù)合的適體也將連接到第一固體支持物上。然后將適 體-靶標(biāo)親和復(fù)合物和已經(jīng)與固體支持物上的探針締合的未復(fù)合適體與混合物的其余部 分分隔開(kāi)，從而去除測(cè)試樣品（樣品基質(zhì)）中的游離靶標(biāo)和所有其它未復(fù)合物質(zhì)，即，混合 物中未與第一固體支持物締合的組分。這個(gè)分隔步驟在本文中稱(chēng)為Catch-1分隔（參見(jiàn)以 下定義）。在分隔之后，使用適用于所采用的特定可釋放第一標(biāo)簽的方法從第一固體支持物 釋放適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物以及任何未復(fù)合適體。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用將第二標(biāo)簽引入到適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的靶分子組分的 試劑來(lái)處理與固體支持物結(jié)合的適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)是蛋白 質(zhì)或肽，并且通過(guò)用NHS-PE04-生物素處理靶標(biāo)而將其生物素化。引入到靶分子中的第二 標(biāo)簽可以與適體捕獲標(biāo)簽相同或不同。如果第二標(biāo)簽與第一標(biāo)簽或適體捕獲標(biāo)簽相同，則 可能在這個(gè)標(biāo)記步驟起始之前，第一固體支持物上的游離捕獲位點(diǎn)被封閉。在該示例性實(shí) 施方案中，在靶標(biāo)標(biāo)記起始之前用游離生物素洗滌第一固體支持物。標(biāo)記方法，且確切地 說(shuō)，諸如肽和蛋白質(zhì)的靶標(biāo)的標(biāo)記描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 855, 054中。
[0014] 分隔是通過(guò)從第一固體支持物釋放未復(fù)合的適體和適體_靶標(biāo)親和復(fù)合物來(lái)完 成的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一可釋放標(biāo)簽為通過(guò)在可裂解多90%第一可釋放標(biāo)簽的條件 下用紫外燈輻照而裂解的可光裂解部分。在其它實(shí)施方案中，釋放是通過(guò)適用于第一可釋 放標(biāo)簽中的選定可釋放部分的方法來(lái)完成的。適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物可以經(jīng)過(guò)洗脫和收集 以進(jìn)一步用于測(cè)定，或可與另一種固體支持物接觸以進(jìn)行測(cè)定的其余步驟。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行第二分隔（在本文中稱(chēng)為Catch-2分隔，參見(jiàn)以下定義） 以去除游離適體。如上文所描述，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將用于Catch-2分隔的第二標(biāo)簽 加入到靶標(biāo)，同時(shí)適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物仍與用于Catch-0捕獲的固體支持物接觸。在其它 實(shí)施方案中，可以在Catch-2分隔起始之前，在測(cè)定中的另一個(gè)點(diǎn)將第二標(biāo)簽加入到靶標(biāo)。 使混合物與固體支持物接觸，該固體支持物具有粘附于其表面的捕獲元件（第二），該捕獲 元件能夠優(yōu)選地以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)捕獲標(biāo)簽（第二標(biāo)簽）。在一個(gè)實(shí)施方案中， 固體支持物為微量滴定板的孔內(nèi)所含有的磁性珠（諸如DynaBeadsMyOneStreptavidin Cl)，且捕獲元件（第二捕獲元件）為鏈霉親和素。磁性珠為分離經(jīng)過(guò)分隔的混合物組分提 供了便利的方法?；旌衔镏兴械倪m體-靶標(biāo)親和復(fù)合物從而通過(guò)靶標(biāo)（第二）捕獲標(biāo) 簽與第二固體支持物上的第二捕獲元件的結(jié)合相互作用而結(jié)合到固體支持物。然后將適 體-靶標(biāo)親和復(fù)合物與混合物的其余部分分隔開(kāi)，例如通過(guò)用緩沖溶液洗滌支持物，所述 緩沖溶液包括包含有機(jī)溶劑的緩沖液，所述有機(jī)溶劑包括但不限于甘油。
[0016] 然后用包含離液鹽的緩沖液從適體-靶標(biāo)復(fù)合物選擇性地洗脫適體，所述離液鹽 包括但不限于高氯酸鈉、氯化鋰、氯化鈉和氯化鎂。此處理不洗脫憑借適體/適體相互作用 保留在Catch-2珠上的適體。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)任何合適的核酸檢測(cè)方法，諸如例如DNA微陣列雜交、 Q-PCR、質(zhì)譜法、侵入測(cè)定、下一代測(cè)序等，對(duì)由Catch-2分隔釋放的適體進(jìn)行檢測(cè)并且任選 地定量。以下更詳細(xì)地描述了這些檢測(cè)方法。
[0018] 本文中所描述的任何方法都可以用于對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行單分析物測(cè)試或多重分析。 例如，任何多重分析都可以包括使用兩種、數(shù)十種、數(shù)百種或數(shù)千種適體同時(shí)測(cè)定諸如生物 樣品的測(cè)試樣品中的相等數(shù)目的靶分子。在這些實(shí)施方案中，將多種適體引入到測(cè)試樣品 中，并且可以進(jìn)行任何上述測(cè)定。在釋放適體之后，可以采用任何合適的多重核酸檢測(cè)方法 來(lái)獨(dú)立地測(cè)量所釋放的不同的適體。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以通過(guò)與單獨(dú)地排列在固體 表面上的互補(bǔ)探針進(jìn)行雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用質(zhì)譜法基于分子量來(lái) 檢測(cè)不同的適體中的每一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以基于諸如，例如毛細(xì)管電泳中凝膠 中的電泳迀移率或通過(guò)液相色譜法來(lái)檢測(cè)不同的適體中的每一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 使用Q-PCR，可使用獨(dú)特PCR探針來(lái)檢測(cè)并且任選地定量不同的適體中的每一種。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，可以使用下一代測(cè)序法來(lái)檢測(cè)并且任選地定量不同的適體中的每一種。
[0019] 在本文中所公開(kāi)的各測(cè)定中，可以使用動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)來(lái)增加測(cè)定的特異性和減少非 特異性結(jié)合。在可以任選地用于本文中所描述的各測(cè)定中的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)將 競(jìng)爭(zhēng)物與測(cè)試樣品一起預(yù)孵育或通過(guò)在平衡結(jié)合期間向混合物中加入競(jìng)爭(zhēng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)非特 異性結(jié)合的額外減少。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)稀釋進(jìn)行動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)。
[0020] 另一個(gè)實(shí)施方案描述了一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中可能存在的靶分子的方法，該方 法包括：將對(duì)靶分子具有特異性親和力且攜帶對(duì)第一捕獲元件具有特異性親和力的第一標(biāo) 簽的適體暴露于包含第一捕獲元件的第一固體支持物，并且允許第一標(biāo)簽與第一捕獲元件 締合；用一種或多種解離聚集的適體的緩沖溶液來(lái)洗滌所述固體支持物；和用一種或多種 包含破壞適體/分析物相互作用但支持適體/適體相互作用和DNA雜交的離液鹽的緩沖溶 液從所述固體支持物洗脫適體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離液鹽選自高氯酸鈉、氯化鋰、氯 化鈉和氯化鎂，并且所述解離聚集的適體的緩沖溶液包含有機(jī)溶劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述有機(jī)溶劑是甘油。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 圖1以圖表描繪了適體依賴(lài)性滯留和隨后從Catch-2珠洗脫適體。將不攜帶生物 素的經(jīng)過(guò)放射標(biāo)記的適體與攜帶增加量的未經(jīng)放射標(biāo)記的生物素化的適體的磁性鏈霉親 和素珠一起孵育并且洗滌。然后用含1M氯化鈉的CAPS緩沖液（pH10)洗脫留存的材料。 所洗脫的經(jīng)放射標(biāo)記的適體的量與Catch-2珠所吸附的冷適體的量成比例。
[0023] 圖2A-2F說(shuō)明了當(dāng)在用測(cè)試樣品平衡之前未對(duì)適體進(jìn)行預(yù)固定時(shí)血漿濃度對(duì)測(cè) 定的影響。參考圖2,從0%v/v至25%v/v對(duì)血漿進(jìn)行滴定。如可見(jiàn)，大部分分析物的信 號(hào)在10%與20%之間進(jìn)入平臺(tái)期。
[0024] 圖3A-3F以圖表描繪了當(dāng)在用測(cè)試樣品平衡之前未對(duì)適體進(jìn)行預(yù)固定時(shí)光裂解 洗脫物中的適體回收率作為血漿濃度的函數(shù)。Catch-1光裂解（回收洗脫物并且通過(guò)雜交 進(jìn)行定量（Y軸，相對(duì)熒光單位）。如可見(jiàn)，隨著血漿濃度增加，適體回收率顯著下降，其中 即使在5%血漿時(shí)也可見(jiàn)顯著效果。分析物結(jié)合是否影響適體結(jié)合珠是未知的，然而，應(yīng)注 意，優(yōu)先損失復(fù)合的適體將產(chǎn)生甚至更大的血漿依賴(lài)性效果。
[0025] 圖4A-4D以圖表描繪了標(biāo)準(zhǔn)（黑色曲線(xiàn)）與預(yù)固定（虛線(xiàn)曲線(xiàn)）測(cè)定中的血漿滴 定的比較。
[0026] 圖5A-5D以圖表描繪了使用本文中所描述的預(yù)固定測(cè)定形式的1MNaCl/CAPSO洗 脫與1.8MNaC104/PIPES洗脫的比較。以預(yù)固定測(cè)定形式運(yùn)作在緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（下 面的曲線(xiàn)）和在40%血漿中的加標(biāo)（spike)(上面的曲線(xiàn)）。
[0027] 圖6描繪了使用高氯酸鹽洗脫和預(yù)固定適體對(duì)僅存在緩沖液的孔進(jìn)行8次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)的CV(變異系數(shù)）。
[0028] 圖7說(shuō)明了針對(duì)300種分析物測(cè)量的加標(biāo)和回收率。加標(biāo)回收率被定義為（分析 物信號(hào)加標(biāo)至jM^Wicipm分析物信號(hào)血《)/分析物信號(hào) 10pM緩沖液加標(biāo))0
[0029] 圖8說(shuō)明了針對(duì)蛋白ERBB2的固定形式的左移緩沖液劑量-響應(yīng)。所測(cè)量的內(nèi)源 水平低十倍以上且非常接近所報(bào)告的內(nèi)源水平。
[0030] 圖9說(shuō)明了對(duì)于蛋白質(zhì)激活素A來(lái)說(shuō)，在緩沖液中的蛋白質(zhì)滴定有所改良、加標(biāo)和 回收特性更好、血漿滴定特性更具線(xiàn)性和血漿中的預(yù)測(cè)內(nèi)源蛋白水平更穩(wěn)定。
[0031] 詳述
[0032] 現(xiàn)在將詳細(xì)參考本發(fā)明的代表性實(shí)施方案。盡管將結(jié)合所列舉的實(shí)施方案來(lái)描述 本發(fā)明，但應(yīng)理解本發(fā)明并不旨在局限于那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明旨在涵蓋所有的替代 方案、修改和等效物，它們可以被包括在如由權(quán)利要求書(shū)界定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0033] 除非另外指示，否則采用本領(lǐng)域技術(shù)人員水平內(nèi)的化學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和 重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明。文獻(xiàn)中充分說(shuō)明了此類(lèi)技術(shù)。參見(jiàn)例如，Sambrook 等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(現(xiàn)行版本）；DNACloning:APractical Approach,第I卷和第II卷（D.Glover編輯）；01igonucleotideSynthesis(N.Gait編 輯，現(xiàn)行版本）；NucleicAcidHybridization(B.Hames和S.Higgins編輯，現(xiàn)行版本）； TranscriptionandTranslation(B.Hames和S.Higgins編輯，現(xiàn)行版本）。
[0034] 除非另外限定，否則本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與本文中所描 述的那些方法、裝置和材料相似或相等的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、 裝置和材料。
[0035] 本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有出版物、公開(kāi)專(zhuān)利文件和專(zhuān)利申請(qǐng)指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的技術(shù)水平。本文中所引用的所有出版物、公開(kāi)專(zhuān)利文件和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘砸玫姆绞讲?入，其程度如同每個(gè)單獨(dú)出版物、公開(kāi)專(zhuān)利文件或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地指出是以引 用的方式并入那樣。
[0036] 所引用的出版物中的實(shí)施例和與其相關(guān)的限制意在為說(shuō)明性的而非排他性的。在 閱讀本說(shuō)明書(shū)和研宄附圖后，對(duì)所引用的出版物的其它限制對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易 見(jiàn)。
[0037] 本公開(kāi)包括經(jīng)設(shè)計(jì)以改良基于適體的多重測(cè)定的性能的方法、裝置、試劑和試劑 盒。所公開(kāi)的方法、裝置、試劑和試劑盒通過(guò)減少或消除背景信號(hào)而提供了用于對(duì)測(cè)試樣品 中的靶分子進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的高敏感度測(cè)定。
[0038] 值得注意的是，除非特定實(shí)施方案中另外規(guī)定，否則本文中所描述的用于對(duì)靶分 子進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的方法不依賴(lài)于描述步驟的具體順序。出于說(shuō)明的目的，將方法描 述為步驟的具體順序；然而，應(yīng)理解，所說(shuō)明的步驟順序的任何排列編號(hào)都是可能的，只要 能實(shí)現(xiàn)所描述的特定測(cè)定的目的即可。換句話(huà)說(shuō)，可以按照任何可行的順序來(lái)進(jìn)行所公開(kāi) 的任何方法中所敘述的步驟，且本發(fā)明的方法不限于所描述的任何實(shí)施方案、實(shí)施例或所 附權(quán)利要求書(shū)中所提供的任何特定順序。此外，為便于和易于呈現(xiàn)，參考單一靶分子和單一 適體描述了各種方法。然而，應(yīng)理解，所描述的任何方法都能以可使用多種適體同時(shí)檢測(cè)和 /或定量多種靶標(biāo)的多重形式進(jìn)行，從而，舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)使測(cè)試樣品與多種適體接觸 來(lái)檢測(cè)和/或定量測(cè)試樣品中的多種靶分子，其中各適體對(duì)特定的靶分子具有特異性親和 力（即，呈多重形式）。
[0039] 如包括所附權(quán)利要求書(shū)的本公開(kāi)中所使用，除非內(nèi)容另外明確指示，否則單數(shù)形 式"一個(gè)/種（a，an) "和"所述/該"包括多個(gè)指示物，并且可與"至少一個(gè)/種"和"一個(gè) /種或多個(gè)/種"互換使用。因而，提到"一個(gè)適體"包括適體的混合物等。
[0040] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"約"表示使得與數(shù)值相關(guān)的項(xiàng)目的基本功能不變的數(shù)值的 不重要修改或變化。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"各"當(dāng)在本文中用于指多個(gè)項(xiàng)目時(shí)意在指所述項(xiàng)目中的至少兩個(gè)。無(wú)需要 求形成復(fù)數(shù)的所有項(xiàng)目都滿(mǎn)足相關(guān)額外限制。
[0042] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"包含（comprises,comprising) "、"包括 (includes,including) "、"含有（contains,containing) "及其任何變型意在涵蓋非排他性 包括，從而包含、包括或含有要素或要素列表的工藝、方法、工藝衍生產(chǎn)品或物質(zhì)組合物不 僅包括那些要素，而且可以包括未明確列出的或所述工藝、方法、工藝衍生產(chǎn)品或物質(zhì)組合 物所固有的其它要素。
[0043] 如本文中所使用，"締合（associate,associates) "及其任何變型是指標(biāo)簽與探針 之間的相互作用或復(fù)合，所述相互作用或復(fù)合在給定復(fù)合或反應(yīng)條件下產(chǎn)生充分穩(wěn)定的復(fù) 合物，以便允許從標(biāo)簽-探針復(fù)合物中分離"未締合"或未結(jié)合材料（諸如，例如測(cè)試樣品 的未結(jié)合組分）。標(biāo)簽和探針可以通過(guò)彼此特異性地相互作用和結(jié)合而彼此直接締合。標(biāo) 簽和探針還可以彼此間接締合，諸如當(dāng)其復(fù)合是由接頭分子介導(dǎo)時(shí)。
[0044] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"核苷酸"是指核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，或其經(jīng)修飾 形式以及其類(lèi)似物。核苷酸所包括的物質(zhì)包括嘌呤（例如，腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤及其 衍生物和類(lèi)似物）以及嘧啶（例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和類(lèi)似物）。
[0045] 如本文中所使用，"核酸"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"可互換用于指核苷酸的聚合 物，并且包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交物及這些核酸種類(lèi)的修飾物、寡核苷酸和多核苷酸，其 中包括不同的實(shí)體或部分在任何位置處連接于核苷酸單元。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸" 和"核酸"包括雙鏈或單鏈分子以及多鏈（即，三螺旋）分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸 是比術(shù)語(yǔ)適體更廣泛的術(shù)語(yǔ)，并且因而，術(shù)語(yǔ)核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作為適體的核 苷酸的聚合物，但術(shù)語(yǔ)核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于適體。
[0046] 如本文中所使用，"核酸配體"、"適體"、"SOMAmer"和"克隆"可互換用于指對(duì)靶分 子具有所需要的作用的非天然存在的核酸。所需要的作用包括但不限于結(jié)合靶標(biāo)、催化地 改變靶標(biāo)、以修改或改變靶標(biāo)或靶標(biāo)功能活性的方式與靶標(biāo)反應(yīng)、共價(jià)連接于靶標(biāo)（如在 自殺性抑制劑中）和促進(jìn)靶標(biāo)與另一個(gè)分子之間的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該作用是針 對(duì)革El分子的特異性結(jié)合親和力，所述祀分子是通過(guò)與沃森/克里克（Watson/Crick)堿基 配對(duì)或三螺旋形成無(wú)關(guān)的機(jī)制結(jié)合核酸配體的除多核苷酸以外的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中適體 不是被靶分子正在結(jié)合的具有已知生理功能的核酸。針對(duì)給定靶標(biāo)的適體包括通過(guò)以下 方法從候選核酸混合物中鑒別的核酸，其中適體是靶標(biāo)的配體，該方法包括：(a)使候選混 合物與靶標(biāo)接觸，其中可從候選混合物中的其余物質(zhì)分隔出相對(duì)于候選混合物中的其它核 酸來(lái)說(shuō)對(duì)靶標(biāo)具有較高親和力的核酸；(b)從候選混合物的其余物質(zhì)分隔出較高親和力核 酸；和（c)對(duì)較高親和力核酸進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生配體富集的核酸混合物，借此鑒別靶分子的 適體。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，親和力相互作用是一個(gè)程度問(wèn)題；然而，在本文中，適體對(duì)其靶標(biāo)的"特 異性結(jié)合親和力"意指適體以比其結(jié)合混合物或樣品中的其它非靶標(biāo)組分高得多的親和力 程度結(jié)合其靶標(biāo)。適體可以包括任何合適數(shù)目的核苷酸。"適體"是指一個(gè)以上這樣的分子 集合。不同的適體可以具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。適體可以是DNA或RNA，并且可以是 單鏈、雙鏈或者含有雙鏈或三鏈區(qū)域。適體可用所需要的堿基經(jīng)修飾核苷酸的任何組合來(lái) 設(shè)計(jì)。
[0047] 如本文中所使用，"SOMAmer"或低解離速率經(jīng)修飾的適體是指解離速率 (t1/2)多30分鐘的適體（包括包含至少一個(gè)具有疏水性修飾的核苷酸的適體）。在一些實(shí) 施方案中，使用標(biāo)題為"MethodforGeneratingAptamerswithImprovedOff-Rates"的 美國(guó)專(zhuān)利7, 947, 447中所描述的改良的SELEX方法來(lái)產(chǎn)生SOMAmer。
[0048] 可以使用任何已知的方法，包括SELEX方法來(lái)鑒別適體。參見(jiàn)例如，標(biāo)題為 "NucleicAcidLigands"的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 475, 096。在鑒別后，可以根據(jù)任何已知的方法， 包括化學(xué)合成方法和酶促合成方法，來(lái)制備或合成適體。
[0049] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"適體_靶標(biāo)親和復(fù)合物"、"適體親和復(fù)合物"或"適體復(fù)合 物"是指通過(guò)適體與其靶分子的相互作用形成的非共價(jià)復(fù)合物。"適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物"、 "適體親和復(fù)合物"或"適體復(fù)合物"是指一個(gè)以上這樣的復(fù)合物集。適體_靶標(biāo)親和復(fù)合 物、適體親和復(fù)合物或適體復(fù)合物一般可以通過(guò)環(huán)境條件變化，例如溫度增加、鹽濃度增加 或加入變性劑來(lái)逆轉(zhuǎn)或解離。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，提供了適體與其靶標(biāo)的非共價(jià)復(fù)合物，其中適體對(duì)靶標(biāo)的Kd 為約100nM或更低，其中適體從靶標(biāo)解離的速率（以復(fù)合物半衰期給出；t1/2)大于或等于 約30分鐘；和/或其中適體的核酸序列中的一個(gè)、若干個(gè)或所有嘧啶在堿基的5-位上被修 飾。
[0051] 如本文中所使用，"非特異性復(fù)合物"是指兩個(gè)或更多個(gè)除適體以外的分子與其靶 分子的非共價(jià)締合。因?yàn)榉翘禺愋詮?fù)合物不是基于其組成分子之間的親和力相互作用加以 選擇，而是代表幾類(lèi)分子之間的相互作用，所以非特異性復(fù)合物中所締合的分子將對(duì)彼此 展現(xiàn)平均起來(lái)低得多的親和力，并且所具有的解離速率將對(duì)應(yīng)地高于適體與其靶分子。非 特異性復(fù)合物包括適體與非靶分子、適體與另一個(gè)適體、競(jìng)爭(zhēng)物與非靶分子、競(jìng)爭(zhēng)物與靶分 子、適體與競(jìng)爭(zhēng)物、和靶分子與非靶分子之間形成的復(fù)合物，以及適體、靶分子、非靶分子、 表面與競(jìng)爭(zhēng)物的高級(jí)聚集物。
[0052] 如本文中所使用，"靶分子"、"分析物"和"靶標(biāo)"可互換用于指適體能以高親和力 和特異性與其結(jié)合并且可以存在于測(cè)試樣品中的任何目標(biāo)分子。"目標(biāo)分子"包括特定分子 的任何細(xì)微變化，諸如在蛋白質(zhì)的情況下，例如氨基酸序列中的細(xì)微變化、二硫鍵形成、糖 基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化，或任何其它操作或修飾（諸如與基本上不改變分子特性的 標(biāo)記組分綴合）。示例性靶分子包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、多糖、糖蛋白、 激素、受體、抗原、抗體、親和體、抗體模擬物、病毒、病原體、毒性物質(zhì)、底物、代謝物、過(guò)渡態(tài) 類(lèi)似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞、組織和任何上述物質(zhì)的任何 片段或部分?？蓪?duì)于任何尺寸的幾乎任何化學(xué)或生物學(xué)分子鑒別適體，并且因而，任何尺 寸的幾乎任何化學(xué)或生物學(xué)分子都可以是合適的靶標(biāo)。靶標(biāo)還可以經(jīng)過(guò)修飾以提高靶標(biāo) 與適體之間的相互作用的可能性或強(qiáng)度。靶標(biāo)還可以經(jīng)過(guò)修飾以包括如上文所定義的標(biāo) 簽。在示例性實(shí)施方案中，靶分子是蛋白質(zhì)。關(guān)于其中SELEX靶標(biāo)為肽的方法，參見(jiàn)標(biāo)題為 "ModifiedSELEXProcessesWithoutPurifiedProtein" 的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6, 376, 190〇
[0053] "多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可在本文中互換用于指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。聚合 物可以是直鏈或支鏈，其可以包含經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸，并且其可以間雜非氨基酸。這些術(shù)語(yǔ) 還涵蓋已被天然修飾或通過(guò)介入修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、 乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎棧ㄖT如與標(biāo)記組分綴合）。該定義中還包括，例如，含 有氨基酸（包括例如，非天然氨基酸等）的一種或多種類(lèi)似物以及本領(lǐng)域中已知的其它修 飾的多肽。多肽可以是單鏈或締合鏈。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"測(cè)試樣品"在本文中是指含有多種分子且可能包括至少一種靶分子的任何 材料、溶液或混合物。術(shù)語(yǔ)測(cè)試樣品包括如下文所定義的生物樣品和可用于環(huán)境或毒理學(xué) 測(cè)試的樣品，舉例來(lái)說(shuō)，諸如被污染或可能被污染的水和工業(yè)流出物。測(cè)試樣品還可以是制 備工藝（例如制造工藝）的最終產(chǎn)物、中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。測(cè)試樣品可以包括已添加到獲 自生物體或一些其它來(lái)源（例如，環(huán)境或工業(yè)來(lái)源）的材料、溶液或混合物的任何合適的測(cè) 定介質(zhì)、緩沖液或稀釋劑。
[0055] 術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指獲自生物體的任何材料、溶液或混合物。這包括血液（包括 全血、白細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、血漿和血清）、痰液、呼氣、尿液、精液、唾液、腦膜液、羊水、 腺液、淋巴液、乳頭抽吸液、支氣管抽吸液、滑液、關(guān)節(jié)抽吸液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物和腦脊髓 液。這還包括所有前述物質(zhì)的用實(shí)驗(yàn)分離的部分。術(shù)語(yǔ)"生物樣品"還包括例如含有均質(zhì)化 固體材料（諸如來(lái)自于糞便樣品、組織樣品或組織活檢）的材料、溶液或混合物。術(shù)語(yǔ)"生 物樣品"還包括來(lái)源于細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)菌培養(yǎng)物、病毒培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞 生物系統(tǒng)（例如，IVTT)的材料、溶液或混合物。
[0056] 在本文中所公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，可以對(duì)測(cè)試樣品與參考樣品進(jìn)行比較。術(shù)語(yǔ) "參考樣品"在本文中是指含有多種分子且已知包括至少一種靶分子的任何材料、溶液或混 合物。參考樣品中存在的任何靶分子的確切量或濃度也可能是已知的。術(shù)語(yǔ)參考樣品包括 如本文中所定義的生物樣品和可用于環(huán)境或毒理學(xué)測(cè)試的樣品，舉例來(lái)說(shuō)，諸如被污染或 可能被污染的水和工業(yè)流出物。參考樣品還可以是制備工藝（例如制造工藝）的最終產(chǎn)物、 中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。參考樣品可以包括已添加到獲自生物體或一些其它來(lái)源（例如，環(huán)境 或工業(yè)來(lái)源）的材料、溶液或混合物的任何合適的測(cè)定介質(zhì)、緩沖液或稀釋劑。
[0057] 如本文中所使用，"非靶分子"和"非靶標(biāo)"可互換用于指測(cè)試樣品中所含有的能與 適體形成非特異性復(fù)合物的分子。應(yīng)了解，作為第一適體的非靶標(biāo)的分子可能是第二適體 的靶標(biāo)。同樣，作為第一適體的靶標(biāo)的分子可能是第二適體的非靶標(biāo)。
[0058] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"分隔"是指分離、濃縮或去除測(cè)試樣品中的一種或多種分 子物質(zhì)或測(cè)試樣品中的其它分子。分隔可用于增加敏感度和/或減少背景。分隔在適體復(fù) 合物形成之后或當(dāng)適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物由于交聯(lián)期間引入的共價(jià)鍵而變得不可逆轉(zhuǎn)時(shí) 最有效。可以在對(duì)適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物進(jìn)行固定的任何步驟或每一步驟之后引入分隔步 驟。分隔還可能依賴(lài)于尺寸差異性或適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物與測(cè)試樣品的其它組分之間差 異性地存在的其它特有性質(zhì)。還可以通過(guò)與適體或靶標(biāo)的特異性相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)分隔。分 隔還可以基于適體、靶標(biāo)、適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物或適體-靶標(biāo)共價(jià)復(fù)合物的物理或生物化 學(xué)性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0059] 在單分析物和多重適體測(cè)定中，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多步驟以從可能導(dǎo)致混淆性背景信 號(hào)的樣品中的材料或測(cè)定試劑中分離特異性適體/親和復(fù)合物。盡管實(shí)施了這些步驟，但 在這些類(lèi)型的測(cè)定中，背景仍然是一個(gè)問(wèn)題。分析方法中的背景可以憑經(jīng)驗(yàn)解決，或較好的 方法是鑒別背景來(lái)源并且消除導(dǎo)致背景的相互作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，適體-適體相互作用是多 重適體方法中的一個(gè)背景來(lái)源。能減少DNA-DNA和RNA-RNA相互作用的試劑，包括基于序 列的那些試劑，是已知的。由于適體的內(nèi)部相互作用決定了適體的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，所以將 不會(huì)期望這些類(lèi)型的試劑能在不影響適體折疊及因此不影響與其相應(yīng)靶標(biāo)的結(jié)合的情況 下大幅減少多重測(cè)定中的背景信號(hào)。描述了能在減少背景的需要與維持適體結(jié)構(gòu)之間取得 平衡的材料和方法。
[0060] 本公開(kāi)描述了進(jìn)行基于適體和光適體的多重測(cè)定以便對(duì)測(cè)試樣品中可能存在的 一種或多種靶分子進(jìn)行定量的改良型方法，其中可以使用任何合適的核酸檢測(cè)方法來(lái)分離 適體（或光適體）與適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物（或光適體-靶標(biāo)共價(jià)復(fù)合物）以便進(jìn)行最終 檢測(cè)，因?yàn)楸疚闹兴枋龅牟牧虾头椒梢杂糜诟牧颊w測(cè)定性能。光適體是包含使適體 能夠共價(jià)結(jié)合或"光交聯(lián)"其靶分子的光反應(yīng)性官能團(tuán)的適體。
[0061] 兩個(gè)意料之外的限制出現(xiàn)在先前描述的用于進(jìn)行基于適體的單一和多重測(cè)定 (包括多重蛋白質(zhì)組適體親和力測(cè)定）的詳細(xì)檢查中。首先，適體/適體相互作用被鑒 別為測(cè)定背景的主要來(lái)源且可能限制多路復(fù)用能力（multiplexcapacity)。其次，發(fā)現(xiàn) 樣品基質(zhì)（主要是血清和血漿）抑制生物素化的適體在經(jīng)鏈霉親和素取代的基質(zhì)上的固 定。本文中描述了能減少和/或消除該方法中的這些限制的三項(xiàng)主要?jiǎng)?chuàng)新。兩項(xiàng)是本文 中所描述的改良型方法所獨(dú)有的（在本文中稱(chēng)為多重測(cè)定的"版本3"）；一項(xiàng)按照如Gold 等，（2010 年 12 月）"Aptamer-basedmultiplexedproteomictechnologyforbiomarker discovery",PLoS0ne5(12) :el5005)中所描述的稍早期版本實(shí)施。版本3是本文中所描 述的發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
[0062] 對(duì)如Gold等，（PLoSOne(2010)5 (12):el5005)中所描沭的測(cè)宙的第一個(gè)改自包 括在Catch-2步驟的一些洗滌緩沖液中使用有機(jī)溶劑來(lái)減小介質(zhì)的介電常數(shù)。加入這些洗 滌緩沖液有效地強(qiáng)化了適體的相鄰磷酸二酯骨架的同種電荷排斥力，因而促進(jìn)引起背景的 相互作用適體的解離。
[0063] 如本文所描述的方法中的第二個(gè)改良提供了雙重優(yōu)勢(shì)。首先，如在向測(cè)定的 Catch-2步驟中所使用的一些洗滌緩沖液中加入有機(jī)溶劑情況下，還能抵消適體相互作用 的傾向，并且因而減少背景且增加多路復(fù)用能力。然而，其主要優(yōu)勢(shì)在于抵消生物素化的適 體對(duì)鏈霉親和素基質(zhì)吸附的基質(zhì)依賴(lài)性抑制。此類(lèi)抑制即使在5%v/v血漿或血清下也能 容易地檢測(cè)，并且將可行的測(cè)定濃度限制為5-10%血漿或血清濃度。這個(gè)限制繼而限制了 測(cè)定敏感性。
[0064] 如本文中所描述，對(duì)多重測(cè)定的第二個(gè)改良包括在用測(cè)試溶液平衡之前對(duì)固體支 持物基質(zhì)上的經(jīng)標(biāo)記適體進(jìn)行預(yù)固定（稱(chēng)為"Catch-0"）。然后與結(jié)合的適體一起在它們 自身的處理容器中進(jìn)行用測(cè)試溶液的平衡。如本文中僅出于說(shuō)明目的所描述，將生物素化 的適體預(yù)固定在鏈霉親和素珠基質(zhì)上，并且與珠結(jié)合的適體一起進(jìn)行用測(cè)試溶液的平衡。 這個(gè)預(yù)固定步驟使得能夠在適體相互作用趨勢(shì)被減小的條件下進(jìn)行固定，并且還使得能夠 在平衡之前進(jìn)行非常嚴(yán)格的洗滌（用堿和用離液鹽），從而破壞相互作用適體并且通過(guò)非 常強(qiáng)的生物素-鏈霉親和素相互作用去除所有未結(jié)合的適體。這就減少了橫貫所述測(cè)定的 適體"簇"-即在一定的可檢測(cè)頻率下保留生物素部分或在測(cè)定中被生物素化的簇的數(shù)目。 值得注意的是，輻照裂解適體的大部分但并非所有的可光裂解生物素部分，同時(shí)，一些適體 經(jīng)由意在"標(biāo)記"蛋白質(zhì)的NHS-生物素處理變得生物素化。在Catch-2步驟捕獲的生物素 化的適體通過(guò)與本體光裂解適體相互作用產(chǎn)生背景，然后在洗脫后被釋放（圖1)。還應(yīng)注 意，預(yù)固定形式將有可能支持非常高的多路復(fù)用能力，因?yàn)檫m體小組可以被單獨(dú)地固定，然 后以珠結(jié)合形式組合，因而避免了適體可能相互作用并且成簇的條件。
[0065] 因而，預(yù)固定避免了在存在分析物溶液的情況下對(duì)適體吸附的需要，因而即使在 測(cè)定分析物溶液的抑制濃度時(shí)也能確保定量固定。這使得能夠使用高得多的濃度，高達(dá)且 包括至少40%v/v血漿或血清，而不是如先前所述方法的10 %最高濃度（Gold等，（2010 年12月）PLoSOne5(12) :el5005)或該方法的最近版本中所使用的5%最高濃度，從而使 敏感性增加大約4到8倍，以及增加測(cè)定的總體穩(wěn)健性。
[0066] 如本文中所描述對(duì)整個(gè)方法的第三個(gè)改良包括在如下文詳細(xì)描述的Catch-2步 驟期間在中性pH值下使用離液鹽進(jìn)行洗脫?，F(xiàn)有方法包括在高pH值（10)下使用氯化鈉， 這會(huì)破壞DNA雜交和適體/適體相互作用以及蛋白質(zhì)/適體相互作用。如上文所指出，DNA 雜交和適體/適體相互作用有助于測(cè)定背景。離液鹽，包括但不限于高氯酸鈉、氯化鋰、氯 化鈉和氯化鎂，在中性pH值下支持DNA雜交和適體/適體相互作用，同時(shí)破壞適體/蛋白 質(zhì)相互作用。凈結(jié)果是顯著減少（約10倍）的背景，伴隨測(cè)定敏感性升高。
[0067] 先前描述的多重適體測(cè)定的概述
[0068] 用測(cè)試樣品（例如，血漿）在溶液中平衡適體。在此期間，分析物與適體（特別是 低解離速率適體）之間形成了長(zhǎng)久有效（中值半衰期約30分鐘）的復(fù)合物。然后將包含 樣品基質(zhì)、適體、蛋白質(zhì)分析物和適體/分析物復(fù)合物的平衡混合物暴露于固定在瓊脂糖 珠上的鏈霉親和素（SA-瓊脂糖）（在用生物素部分標(biāo)記適體的情況下）。經(jīng)由附加的生物 素部分將混合物中的適體捕獲在SA-瓊脂糖上。注意，該測(cè)定依賴(lài)于此步驟的定量適體捕 獲。然后在溫和條件下洗滌經(jīng)過(guò)固定的適體，從而去除游離的和松散結(jié)合的蛋白質(zhì)，但留 下適體和適體/分析物復(fù)合物。這個(gè)步驟稱(chēng)為"Catch-1"，可以被認(rèn)為是蛋白質(zhì)純化步驟。 (參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 947, 447和7, 855, 054)。
[0069] 然后用NHS-生物素處理攜帶適體和分析物/適體復(fù)合物的瓊脂糖珠，將生物素 "標(biāo)簽"留在適體結(jié)合的蛋白質(zhì)分析物上。在進(jìn)一步洗滌之后，經(jīng)由裂解適體與生物素部分 之間的不穩(wěn)定接頭（如以下實(shí)施例中僅出于說(shuō)明目的所描述，使用在暴露于紫外光后裂解 的光不穩(wěn)定接頭），從瓊脂糖珠釋放適體（包括適體/生物素化的分析物復(fù)合物）。然后將 所謂的光裂解洗脫物轉(zhuǎn)移到攜帶磁性鏈霉親和素珠的孔。優(yōu)先吸附適體/生物素化的分析 物復(fù)合物。這個(gè)捕獲步驟稱(chēng)為"Catch-2 "。（參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 947, 447和7, 855)。 在洗滌之后，用高pH值的氯化鈉溶液洗脫現(xiàn)在通過(guò)分析物與珠結(jié)合的適體。然后通過(guò)與市 售微陣列雜交對(duì)所回收的適體進(jìn)行定量。所回收的適體量充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度的替代物，正常 情況下是借助于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定。
[0070] 如上文所指出，已經(jīng)觀(guān)察到即使在不存在來(lái)自于測(cè)試樣品的添加蛋白質(zhì)的情況下 也有大量適體橫貫測(cè)定（即，穿過(guò)分隔步驟）且產(chǎn)生背景。這種與蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)的背景的來(lái) 源可追溯到適體/適體相互作用，如圖1中所說(shuō)明。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了若干種緩解策略來(lái)解決這 個(gè)問(wèn)題，這些策略描述于Gold等，（PLoSOne(2010) 5 (12) :el5005)中。最后，選擇溫甘油 洗滌作為緩解這個(gè)問(wèn)題的有效而又合適的策略。然而，降低水的介電常數(shù)的其它溶劑和試 劑能夠以類(lèi)似方式減少測(cè)定背景。實(shí)例包括但不限于甘油、丙二醇、海藻糖、乙醇等。
[0071] 通過(guò)適體的預(yù)吸附減輕捕獲抑制
[0072] 如上文所指出，確定了血清和血漿降低適體的捕獲效率，從而限制濃度，這可以如 圖2和3中所說(shuō)明地那樣加以測(cè)量。
[0073] 如圖4中所說(shuō)明，如本文中所描述的適體預(yù)固定和隨后的平衡緩解了捕獲抑制問(wèn) 題，且使得能夠使用高得多的血漿濃度。具體地說(shuō)，可以使用高達(dá)且包括至少40 %v/v血漿 或血清的濃度，而不是如Gold等，（PLoSOne(2010年12月)5 (12):el5005)中先前所描沐 的方法的10%最高濃度或最近版本中的5%最高濃度，從而使敏感性增加大約4至8倍，以 及增加測(cè)定的總體穩(wěn)健性。
[0074] 參考圖4可見(jiàn)，可以觀(guān)察到信號(hào)線(xiàn)性增加一直到高達(dá)40%v/v血漿（比較用（□) 標(biāo)記的線(xiàn)（預(yù)固定形式）與用（〇）標(biāo)記的線(xiàn)（標(biāo)準(zhǔn)形式））。注意，針對(duì)Spuriomer觀(guān)察 的信號(hào)（蛋白質(zhì)依賴(lài)性的背景的替代物，下面兩個(gè)圖）在標(biāo)準(zhǔn)形式中相當(dāng)高，表明預(yù)固定可 以減少蛋白質(zhì)依賴(lài)性背景。
[0075] 使用離液鹽進(jìn)行洗脫以減少測(cè)定背景和提高測(cè)定敏感性
[0076] 如圖5中所說(shuō)明，使用離液鹽進(jìn)行洗脫既減少了測(cè)定背景又提高了測(cè)定敏感性。 參考圖5可見(jiàn)，在高氯酸鹽洗脫的情況下，緩沖液中的測(cè)定背景顯著減少（比較圖5A中下 面的曲線(xiàn)與圖5B中下面的曲線(xiàn)）。測(cè)定背景已經(jīng)下降到20-40RFU。對(duì)于IL-11，在高氯酸 鹽洗脫的情況下，表觀(guān)內(nèi)源水平也在一定程度上明顯降低，表明蛋白質(zhì)依賴(lài)性背景有所減 少（大約〇? 2pM對(duì)lpM)。
[0077] 下表總結(jié)了CAPSO/NaCl洗脫與高氯酸鹽洗脫的比較結(jié)果（RFU)。在第1-6行中顯 示了各稀釋組（第2列）中的所有SOMAmer在血衆(zhòng)存在下（對(duì)于5%S0MAmer，5%v/v血 漿；對(duì)于0.316%30麻11161'，0.316%￥八血漿；和對(duì)于0.01%50麻11161'，0.01%血漿）的中值 和平均信號(hào)；在第8行和第9行中顯示了被稱(chēng)為Spuriomer(不具有同類(lèi)分析物的電腦設(shè)計(jì) 的SOMAmer)的所有SOMAmer在5%血漿存在下的中值和平均信號(hào)；及第10行顯示了所有 SOMAmer在所有稀釋度下在僅存在緩沖液的情況下的中值和平均信號(hào)。
[0078]表1
[0079]
【權(quán)利要求】
1. 一種方法，其包括： 將對(duì)靶分子具有特異性結(jié)合親和力且攜帶對(duì)第一捕獲元件具有親和力的第一標(biāo)簽的 適體暴露于包含第一捕獲元件的第一固體支持物，并且允許所述第一標(biāo)簽與所述第一捕獲 元件締合； 用一種或多種解離聚集的適體的溶液來(lái)洗滌所述第一固體支持物； 使所述適體與測(cè)試樣品接觸，其中如果所述測(cè)試樣品中存在所述靶分子，則形成適 體-靶標(biāo)親和復(fù)合物； 去除混合物中未與所述第一固體支持物締合的一種或多種組分； 將對(duì)第二捕獲元件具有親和力的第二標(biāo)簽連接到所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物中的所 述革El分子； 從所述第一固體支持物釋放所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物； 將所述釋放的適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物暴露于包含第二捕獲元件的第二固體支持物，并 且允許所述第二標(biāo)簽與所述第二捕獲元件締合； 去除混合物中未與所述第二固體支持物締合的任何組分；和 用一種或多種包含破壞適體/分析物相互作用的離液鹽的溶液從所述第二固體支持 物洗脫適體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述適體包含至少一種C-5經(jīng)修飾的核苷酸。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述適體包含至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾 包括在一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自核糖位置、脫氧核糖位置、磷酸位置和堿基位置的位置上的 化學(xué)取代。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化學(xué)修飾獨(dú)立地選自2' -位糖修飾、2' -氨基 (2' -NH2)、2' -氟（2' -F)、2' -O-甲基（2' -OMe)、5_位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外 胺上的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脫氧尿苷的取代、5-溴脫氧胞苷的取代、主鏈修飾、 甲基化、3'帽和5'帽。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括引入動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物具有慢解 離速率。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)大于 或等于30分鐘。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)介于 約30分鐘與約240分鐘之間。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)選 自多30分鐘、多60分鐘、多90分鐘、多120分鐘、多150分鐘、多180分鐘、多210分鐘和 多240分鐘。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種緩沖溶液中包含有機(jī)溶劑。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑是甘油。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離液鹽選自高氯酸鈉、氯化鋰、氯化鎂和氯化 鈉。
13. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用選自Q-PCR、MS、下一代測(cè)序和 雜交的方法檢測(cè)并且任選地定量所述適體。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述Q-PCR是使用TaqMaiixPCR、在PCR方法期 間使用插入熒光染料或在PCR方法期間使用分子信標(biāo)來(lái)進(jìn)行。
15. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述適體包含可檢測(cè)部分。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述可檢測(cè)部分選自染料、量子點(diǎn)、放射性標(biāo)記 物、電化學(xué)官能團(tuán)和酶加可檢測(cè)酶底物。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述染料是熒光染料。
18. 如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述適體是單鏈核酸或雙鏈核酸。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述適體包含DNA、RNA或DNA與RNA兩者。
20. 如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶分子選自蛋白質(zhì)、肽、碳水化 合物、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物、輔因子、抑 制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、組織和受控物質(zhì)。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質(zhì)或肽。
22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)試樣品選自生物樣品、環(huán)境樣 品、化學(xué)樣品、藥物樣品、食品樣品、農(nóng)業(yè)樣品和獸醫(yī)樣品。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述測(cè)試樣品是選自血液、全血、白細(xì)胞、外周血 單核細(xì)胞、血漿、血清、痰液、呼氣、尿液、精液、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸 液、支氣管抽吸液、滑液、關(guān)節(jié)抽吸液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、糞便、組織、組織提取物、組織活檢 和腦脊髓液的生物樣品。
24. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)試樣品包括血漿或血清。
25. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽和所述第二標(biāo)簽各自 包含至少一種獨(dú)立地選自以下的組分：多核苷酸、多肽、肽核酸、鎖核酸、寡糖、多糖、抗體、 親和體、抗體模擬物、細(xì)胞受體、配體、脂質(zhì)、生物素、親和素、鏈霉親和素、外親和素、中性親 和素、Traptavidin、金屬、組氨酸和這些結(jié)構(gòu)中任一者的任何部分。
26. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一捕獲元件和所述第二捕獲元件各自包含 至少一種獨(dú)立地選自以下的組分：多核苷酸、多肽、肽核酸、鎖核酸、寡糖、多糖、抗體、親和 體、抗體模擬物、細(xì)胞受體、配體、脂質(zhì)、生物素、親和素、鏈霉親和素、外親和素、中性親和 素、Traptavidin、金屬、組氨酸和這些結(jié)構(gòu)中任一者的任何部分。
27. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽包含可釋放部分。
28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述可釋放部分包含可光裂解部分。
29. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一固體支持物和第二固體支持物各自獨(dú)立 地選自聚合物珠、瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、丙烯酰胺珠、固體核心珠、多孔珠、順磁性珠、玻璃 珠、受控孔隙珠、微量滴定孔、環(huán)烯烴共聚物基板、膜、塑料基板、尼龍、朗繆爾-布勞杰特 膜、玻璃、鍺基板、硅基板、硅晶片芯片、流過(guò)式芯片、微珠、納米顆粒、聚四氟乙烯基板、聚苯 乙烯基板、砷化鎵基板、金基板和銀基板。
30. 如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括通過(guò)對(duì)所述適體進(jìn)行定量來(lái)定量所述靶標(biāo)。
31. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測(cè)所述適體包括使所述適體與第三固體支持物 雜交，其中所述第三固體支持物包括多個(gè)可尋址特征且其中至少一個(gè)所述特征包括至少置 于其上的與所述適體內(nèi)所含有的任何序列互補(bǔ)的捕獲元件。
32. 如權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括通過(guò)檢測(cè)所述適體-靶標(biāo)親和 復(fù)合物的所述適體部分來(lái)檢測(cè)所述靶分子的步驟。
33. -種檢測(cè)樣品中的靶分子的存在或測(cè)定樣品中的靶分子的量的方法，所述方法包 括： 向革巴分子提供多種適體，其中所述多種適體中的每一種包含第一可裂解捕獲標(biāo)簽； 使所述適體與具有粘附于支持物表面的探針的固體支持物接觸，其中所述探針能夠結(jié) 合所述第一標(biāo)簽，從而通過(guò)所述第一標(biāo)簽與所述探針的結(jié)合使適體固定到所述固體支持物 上； 使所述固定的適體與含有靶分子的樣品接觸以形成含有與所述固體支持物結(jié)合的適 體-祀分子復(fù)合物的混合物； 將與所述固體支持物結(jié)合的適體-靶分子復(fù)合物與所述混合物的其余部分分隔開(kāi)； 將第二捕獲標(biāo)簽引入到所述適體-靶分子復(fù)合物的所述靶分子組分中； 通過(guò)裂解所述第一可裂解捕獲標(biāo)簽使所述適體-靶分子復(fù)合物從所述固體支持物表 面解離； 提供具有粘附于支持物表面的探針的第二固體支持物，其中所述探針能夠結(jié)合靶分子 上的第二捕獲標(biāo)簽； 使所述解離的適體-靶分子復(fù)合物與所述第二固體支持物接觸，從而通過(guò)所述第二捕 獲標(biāo)簽與探針的結(jié)合使所述適體-靶分子復(fù)合物與所述第二支持物結(jié)合； 用一種或多種包含破壞適體/分析物相互作用但支持適體/適體相互作用和DNA雜交 的離液鹽的緩沖溶液從所述固體支持物洗脫適體； 解離所述適體_靶分子復(fù)合物以產(chǎn)生游離適體和與所述支持物結(jié)合的靶分子； 檢測(cè)所述游離適體。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述適體包含至少一種C-5經(jīng)修飾的核苷酸。
35. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述適體還包含至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修 飾包括在一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自核糖位置、脫氧核糖位置、磷酸位置和堿基位置的位置上 的化學(xué)取代。
36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述化學(xué)修飾獨(dú)立地選自2' -位糖修飾、2' -氨基 (2' -NH2)、2' -氟（2' -F)、2' -O-甲基（2' -OMe)、5_位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外 胺上的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脫氧尿苷的取代、5-溴脫氧胞苷的取代、主鏈修飾、 甲基化、3'帽和5'帽。
37. 如權(quán)利要求33所述的方法，其還包括引入動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)。
38. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物具有慢解離速率。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)大 于或等于30分鐘。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)介 于約30分鐘與約240分鐘之間。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述適體-靶標(biāo)親和復(fù)合物的解離速率（t1/2)選 自多30分鐘、多60分鐘、多90分鐘、多120分鐘、多150分鐘、多180分鐘、多210分鐘和 多240分鐘。
42. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述緩沖溶液中的一種或多種包含有機(jī)溶劑。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑是甘油。
44. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述離液鹽選自高氯酸鈉、氯化鋰、氯化鈉和氯化 鎂。
45. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中使用選自Q-PCR、MS、下一代測(cè)序和雜交的方法檢 測(cè)并且任選地定量所述適體。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述Q-PCR是使用TaqManuPCR、在PCR方法期 間使用插入熒光染料或在PCR方法期間使用分子信標(biāo)來(lái)進(jìn)行。
47. 如權(quán)利要求33所述的方法，其還包括將可檢測(cè)部分加入所述適體。
48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述可檢測(cè)部分選自染料、量子點(diǎn)、放射性標(biāo)記 物、電化學(xué)官能團(tuán)、酶和酶底物。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述染料是熒光染料。
50. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述適體是單鏈核酸或雙鏈核酸。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述適體包含DNA、RNA或DNA與RNA兩者。
52. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述靶分子選自蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、多糖、糖 蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、底物、代謝物、過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物、輔因子、抑制劑、藥物、染 料、營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子、組織和受控物質(zhì)。
53. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質(zhì)或肽。
54. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述測(cè)試樣品選自生物樣品、環(huán)境樣品、化學(xué)樣 品、藥物樣品、食品樣品、農(nóng)業(yè)樣品和獸醫(yī)樣品。
55. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述測(cè)試樣品是選自血液、全血、白細(xì)胞、外周血 單核細(xì)胞、血漿、血清、痰液、呼氣、尿液、精液、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸 液、支氣管抽吸液、滑液、關(guān)節(jié)抽吸液、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、糞便、組織、組織提取物、組織活檢 和腦脊髓液的生物樣品。
56. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述測(cè)試樣品是血漿或血清。
57. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽和所述第二標(biāo)簽各自包含至少 一種獨(dú)立地選自以下的組分：多核苷酸、多肽、肽核酸、鎖核酸、寡糖、多糖、抗體、親和體、 抗體模擬物、細(xì)胞受體、配體、脂質(zhì)、生物素、親和素、鏈霉親和素、外親和素、中性親和素、 Traptavidin、金屬、組氨酸和這些結(jié)構(gòu)中任一者的任何部分。
58. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第一捕獲元件和所述第二捕獲元件各自包 含至少一種獨(dú)立地選自以下的組分：多核苷酸、多肽、肽核酸、鎖核酸、寡糖、多糖、抗體、親 和體、抗體模擬物、細(xì)胞受體、配體、脂質(zhì)、生物素、親和素、鏈霉親和素、外親和素、中性親和 素、Traptavidin、金屬、組氨酸和這些結(jié)構(gòu)中任一者的任何部分。
59. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽包含可釋放部分。
60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述可釋放部分包含可光裂解部分。
61. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第一固體支持物和第二固體支持物各自獨(dú) 立地選自聚合物珠、瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、丙烯酰胺珠、固體核心珠、多孔珠、順磁性珠、玻 璃珠、受控孔隙珠、微量滴定孔、環(huán)烯烴共聚物基板、膜、塑料基板、尼龍、朗繆爾-布勞杰特 膜、玻璃、鍺基板、硅基板、硅晶片芯片、流過(guò)式芯片、微珠、納米顆粒、聚四氟乙烯基板、聚苯 乙烯基板、砷化鎵基板、金基板和銀基板。
62. 如權(quán)利要求33所述的方法，其還包括通過(guò)對(duì)所述適體進(jìn)行定量來(lái)定量所述靶標(biāo)。
63. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中檢測(cè)所述適體包括使所述適體與第三固體支持物 雜交，其中所述第三固體支持物包括多個(gè)可尋址特征且其中至少一個(gè)所述特征包括至少置 于其上的與所述適體內(nèi)所含有的任何序列互補(bǔ)的捕獲元件。
64. -種試劑盒，其包含： a) 對(duì)一種或多種目標(biāo)靶標(biāo)具有特異性的一種或多種適體； b) -種或多種固體支持物； c) 一種或多種分隔試劑； d) -種或多種用于從所述親和復(fù)合物釋放適體的試劑； (e) -種或多種包含有機(jī)溶劑的緩沖溶液；和 (f) 一種或多種包含離液鹽的緩沖溶液。
65. 如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其中所述有機(jī)溶劑是甘油。
66. 如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其中所述離液鹽是高氯酸鈉。
67. 如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其還包含用于衍生所述一種或多種目標(biāo)靶標(biāo)的試 劑。
68. 如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其還包含用于裂解所述一種或多種適體中的可裂解 部分的試劑。
69. 如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其還包含用于動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)的試劑。
70. -種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中可能存在的靶分子的方法，所述方法包括： 將對(duì)所述靶分子具有特異性親和力且攜帶對(duì)第一捕獲元件具有特異性親和力的第一 標(biāo)簽的適體暴露于包含第一捕獲元件的第一固體支持物，并且允許所述第一標(biāo)簽與所述第 一捕獲元件締合； 用一種或多種解離聚集的適體的緩沖溶液來(lái)洗滌所述固體支持物； 用一種或多種包含破壞適體/分析物相互作用但支持適體/適體相互作用和DNA雜交 的離液鹽的緩沖溶液從所述固體支持物洗脫適體。
71. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述離液鹽選自高氯酸鈉、氯化鋰、氯化鈉和氯化 鎂。
72. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述解離聚集的適體的緩沖溶液包含有機(jī)溶劑。
73. 如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑是甘油。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104508150SQ201380040107
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月7日
【發(fā)明者】G·桑德斯, S·克雷默, E·卡蒂留斯 申請(qǐng)人:私募蛋白質(zhì)體公司