專利名稱：一種抗昆蟲血細胞免疫的蛋白及基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種具有抗昆蟲血細胞免疫功能的來自格式線蟲(Steinernema glaseri)的表皮蛋白Enol。本發(fā)明還涉及該蛋白的氨基酸序列及編碼此蛋 白的核苷酸序列。
背景技術：
昆蟲病原線蟲是一類自然存在于土壤中的昆蟲天敵，以感染期線蟲通過昆蟲的氣 孔、口腔和肛門等自然孔口或通過昆蟲表皮節(jié)間膜進入血腔，將腸道內(nèi)攜帶的共生細菌釋 放到昆蟲血腔，共同抵抗寄主的免疫系統(tǒng)，快速殺死寄主。線蟲-共生菌雖然具有抵抗昆蟲 免疫系統(tǒng)的能力，但寄主血細胞的快速包被和免疫反應仍然能夠殺死線蟲和共生菌，特別 是在線蟲釋放其共生菌之前。因此線蟲能否抑制昆蟲血細胞免疫并在昆蟲體腔中存活，是 決定線蟲成功致死昆蟲的關鍵。目前，國內(nèi)外關于格式線蟲表皮蛋白抑制昆蟲血細胞免疫 的研究很少，只有Wang and Gaugler發(fā)現(xiàn)來源于格式線蟲表皮的蛋白能顯著提高線蟲抗昆 蟲血細胞的免疫力，但該研究小組沒有獲得純化蛋白及其編碼基因。分離純化昆蟲病原線 蟲表皮蛋白、克隆編碼基因的研究將有助于闡明線蟲抵抗昆蟲血細胞免疫的作用機制，為 開拓抗昆蟲免疫蛋白在害蟲生物防治上的應用奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗昆蟲血細胞免疫的線蟲表皮蛋白及其編碼基因，從而 拓展其在農(nóng)業(yè)害蟲防治上的應用。本發(fā)明的主要技術方案是提取純化格式線蟲(Steinernema glaseri)的表皮蛋 白，測定其肽段序列，再根據(jù)肽段序列克隆表皮蛋白的編碼基因。本發(fā)明的線蟲表皮蛋白具有抗昆蟲血細胞免疫的作用。具體技術方案如下(1)收集人工培養(yǎng)的格式線蟲，先后用0. 5%次氯酸鈉和35%乙醇處理線蟲，提取 獲得線蟲表皮蛋白粗品；用8%制備型Native-PAGE和Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad) 獲得純化的表皮蛋白。(2)通過大蠟螟血細胞ROS水平檢測等方法確定表皮蛋白的生物活性。(3)采用液譜-電噴霧-質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)獲得表皮蛋白的肽段序列。(4)根據(jù)肽段序列設計簡并引物，PCR擴增獲得DNA片段，通過5’和3’ -RACE獲 得表皮蛋白全長基因enol。(5)原核表達enol，確定表達蛋白抗昆蟲血細胞免疫的功能。
具體實施例方式下面通過具體實例進一步說明本發(fā)明特點。實施例1線蟲的培養(yǎng)與收集
采用人工培養(yǎng)基(主要含豆粉、面粉、雞蛋、動物肝臟等)培養(yǎng)格氏線蟲NC品系 [Steinernema glaseri (NC strain)]，培養(yǎng)時在500ml錐形瓶盛入80g以海綿做載體的人 工培養(yǎng)基，在25°C恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)21天。在自來水中反復通氣清洗線蟲lh，收集的線蟲 用終濃度0. 5%次氯酸鈉處理15min，自來水反復清洗去除次氯酸鈉后用蒸餾水通氣處理 48h，最后用細紗布過濾收集線蟲。實施例2線蟲表皮蛋白的提取與純化將線蟲在預冷的35%乙醇中浸提30min，細紗布過濾收集的濾液為蛋白粗提液。 將蛋白粗提液冷凍干燥成干粉。取干粉溶于Mi 11 iQ水至蛋白終濃度2mg/ml，用8 %制備型 Native-PAGE 分離(80V 20min, 180V lh30min)，隨后在 Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad) 上進行電洗脫(100mA25min)，分別收集洗脫組分，用12 % SDS-PAGE分析各組分純度，并用 BCA assay kit (Pierce)測定各組分濃度，將各組分的蛋白濃度用MilliQ水調(diào)整為20μ g/ml。實施例3大蠟螟血細胞活性氧(ROS)水平檢測表皮蛋白活性用75%的酒精對大蠟螟五齡幼蟲進行表面消毒，剪斷幼蟲前足，用移液器從斷口 處吸取10 μ 1血淋巴(約含100，000個血細胞)，迅速加入到含0. 1 %的DCFH-DA的格氏昆 蟲培養(yǎng)基(Grace insect culture medium, Sigma G-9771)中，室溫孵育 30min。用格氏昆 蟲培養(yǎng)基洗滌孵育后的血細胞3次，以除去細胞外的DCFH-DA，隨后在含有10 μ g/ml LPS和 20 μ g/ml表皮蛋白組分的格氏昆蟲培養(yǎng)基中37°C孵育30min，并以含有10 μ g/ml LPS和 20 μ g/ml BSA(Merck-Calbiochem)的格氏昆蟲培養(yǎng)基為對照。用移液槍輕柔洗打吹散細胞 團，取樣觀察。細胞的熒光定性觀察在01ympUsBX51熒光顯微鏡(Olympus)下進行，定量檢 測則在FACS Vantage流式細胞儀(Beeton Dickinson)中進行。熒光圖像和數(shù)據(jù)采集使用 的激發(fā)波長是488nm，發(fā)射波長是535nm。結(jié)果表明，表觀分子量為47kD的表皮蛋白組分其 活性氧水平比BSA的明顯低，說明該組分具有抗昆蟲血細胞免疫活性。實施例4大蠟螟體內(nèi)血細胞吞噬分析檢測表皮蛋白活性首先將表皮蛋白與熒光微球交聯(lián)，將純化的表皮蛋白和BSA分別溶于MES緩沖液 (50mM,pH6. 0)中，調(diào)整蛋白終濃度為0. lmg/ml。取2 μ 1羧基修飾的微球珠(3. 6 X IO7/μ 1， F — 8821，Invitrogen)加入20 μ 1的蛋白溶液中，混勻后室溫孵育15min。隨后加入20 μ 1 1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)-碳化二亞胺(EDAC)，室溫孵育2h。向混合物中加入甘 氨酸至終濃度IOOmM,室溫孵育30min以終止反應。將微球在4000g離心30min，盡除上清， 然后用PBS清洗3次(每次5min)，最后重懸于PBS中并調(diào)至熒光微球濃度為2. OX IO5個 /μ 1。進行體內(nèi)血細胞吞噬分析時，向5齡大蠟螟幼蟲體內(nèi)注入5μ 1交聯(lián)了蛋白的微球珠 (每只幼蟲含1 X IO6個微球珠)。注射12h后取幼蟲血淋巴5 μ 1與50 μ 1的格氏昆蟲培養(yǎng) 基混合，滴加到凹面載玻片上，37°C靜置5min。用500 μ 1含2 μ g/ml DAPI (6-聯(lián)脒-2-苯 基吲哚)的甲醇清洗載玻片一次，再加入100 μ 1的2μ g/mlDAPI，37°C孵育15min，棄去染 色液，甲醇清洗一次，滴加10(^1 83保存。熒光觀察在017111 115^(51熒光顯微鏡(Olympus) 下進行，激發(fā)波長350nm。觀察結(jié)果表明，表觀分子量為47kD的表皮蛋白組分被大蠟螟血細 胞吞噬吸附明顯少于BSA，說明該組分具有抗吞噬作用。 實施例5液譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析獲得表皮蛋白的肽段序列
將電洗脫所得的47kD表皮蛋白進行蛋白雙向電泳，挖取蛋白斑點，經(jīng)胰蛋白酶、 凝乳蛋白酶、V8酶分別酶解后，采用液譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)獲得該蛋白的2段肽段序列，其序列為 YGLDATAVGDEGGFAPNIQDNK 和 AAVPSGASTGIHEALELR。實施例6表皮蛋白基因克隆用生物信息學方法分析，發(fā)現(xiàn)以上2個肽段與多個物種的烯醇化酶高度同源，包括秀麗隱桿線蟲、單一異尖線蟲、旋毛線蟲、擬南芥、番茄和油菜等，根據(jù)以上 物種相應蛋白保守區(qū)域的保守序列設計引物5，-GAYTCMCGYGGMAAYCCAACYGTTGA-3， 禾口 5，-GTSACKGAWCCRATTTGRTT-3，，PCR(94 "C 3min ；94 "C 60s, 50 "C 30s, 72 "C 70s, 35cycles ；72 V IOmin ；4 °C ^ )獲得1071bp的陽性片段；然后再使用TaKaRa公司 的試劑盒進行RACE實驗以獲得包括完整ORF 的DNA片段，3，RACE設計的引物為 5，-TACCGGACTGGTGTCCATCGGCAT-3，和 5，-AGTCGTTCATCAAGGACTATCCCGT-3，，5，RACE 設計的 引物為 OUTER :5，-ACGACGGGATAGTCCTTGATG-3，和 INNER :5，-AGCTTGATAGCGGTGTTGAGG-3，。 將上述實驗得到的核苷酸片段進行拼接后獲得一個大小為1311bp的完整閱讀框的核苷酸 序列，將其命名為enol基因(SEQ ID NO 1)，其推測的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中包含實 施例5中獲得的2個肽段，確認獲得的enol基因正確。通過GenBank比對，獲知此種蛋白 與多個物種的烯醇化酶具有較高的同源性，其中和秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)烯 醇化酶的相似性為86%。提取格式線蟲的RNA，根據(jù)enol基因序列設計引物進行RT-PCR，克隆到全長的格 式線蟲enol基因。實施例7格式線蟲enol基因的表達、蛋白純化及功能驗證通過PCR反應在enol基因兩端分別引入EcoR I和Xho I兩個酶切位點，雙酶切 后與同樣雙酶切的載體PGEX-6P-1連接；篩選陽性克隆，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株 BL21，IPTG誘導表達；收集細胞，超聲破碎，離心取上清液在AKTA EXPL0ER 10上進行純化， 依次使用GSTrap FF、HiTrap Desalting和Mono Q三種層析柱純化，再經(jīng)PreScission酶 切得到高純度表達蛋白Enol，其表觀分子量為47kD。將60頭生長均一的5齡大蠟螟幼蟲分為三組，分別從腹腔注入10μ 1 PBS、 BSAdOOy g/ml)和表達蛋白(100 μ g/ml)，室溫孵育20小時；用75%酒精表面消毒后剪前 足取血淋巴，每只幼蟲取20 μ 1血淋巴并加入到180 μ 1 PBS中混勻，用血細胞計數(shù)器計數(shù) 血細胞數(shù)目。結(jié)果表明，enol基因的表達產(chǎn)物具有裂解血細胞活性，能降低大蠟螟幼蟲血 細胞數(shù)量達60%。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所<120> 一種抗昆蟲血細胞免疫的蛋白及基因序列<130>05-01<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1311<212>DNA<213> 格式線蟲(Steinemema glaseri)<400>1
ATGCCTATCA CTCGCATCCA CGCTCGTCAG ATCTACGACT CCCGTGGCM CCCCACCGTC 60GMGTCGACC TCCACACCGA GMGGGTGTG TTCCGTGCTG CTGTCCCCAG CGGAGCCTCC 120ACTGGCATCC ATGAGGCTCT GGMCTCCGC GACCAGGACA AGGCTGTCCA CCACGGAMG 180GGAGTCGAGA AGGCCGTCGC CMCGTCATC GAGMGATCG CGCCGGCCCT CATCGCCMG 240MCTTCGATG TGACCGACCA AGTCGCCATC GACMGTTCA TGATCGAGCT TGACGGMCC 300GAGMCMGT CGAGCCTCGG AGCCMCGCC ATCCTCGGCG TGTCGCTCGC CGTCGCCMG 360GCTGGTGCCG TGCACMGGG AGTGCCCCTC TACMGCACT TGGCCGATCT CGCCGGAGTG 420AGCMGGTTG TCCTCCCCGT TCCTGCCTTC MCGTCATCA ACGGAGGCTC GCACGCCGGA 480MCMGCTCG CCATGCAGGA GTTCATGATC CTCCCCGTCG GAGCCMGAG CTTCMGGAG 540GCCATGCGCA TGGGATCCGA GATCTACCAC CACCTCMGG CCGAGATCM GMGCGCTAC 600GGACTCGACG CCACCGCCGT CGGAGATGAG GGAGGATTCG CCCCCMCAT CCAGGACMC 660MGGAGGGTC TTGACCTCCT CMCACCGCT ATCMGCTTG CCGGATATAC CGGACTGGTG 720TCCATCGGCA TGGACGTCGC CGCCTCCGAG TTCTACMGG AGMCGAGM GMGTACGAC 780TTGGACTTCA AGMCCCCM CTCCGACCCC AGCMGTGGA TCMCGGAGA CGAGCTCGCC 840GCGCTCTACC AGTCGTTCAT CMGGACTAT CCCGTCGTCT CCATCGAGGA CGCCTTCGAC 900CAGGACGACT GGGCGMCTG GAGCMGCTG ATGGGCMCA CCTCCATCCA GCTCGTCGGA 960GATGATCTCA CCGTCACCM CCCCMGCGC ATCCAGATGG CCGTCGACCA GMGGCGTGC 1020MCTGCCTTC TCCTCAAGGT CMCCAGATC GGATCCATCA CCGAGTCCAT CGAGGCCGCC 1080MGCTGTCCC GCGCCAACGG ATGGGGCGTC ATGGTTTCCC ACCGTTCTGG AGAAACCGAA 1140GACTGCTTCA TCGCTGATCT TGTTGTTGGC CTCGCTACTG GACAGATCM GACCGGAGCC 1200CCTTGCCGAT CTGAGCGTCT CGCCMGTAC MCCAGCTTC TTCGCATCGA GGAGGAGCTC 1260GGAGCCGATG CCGTGTACGC CGGAGAGMC TTCCGCMCC CCCAGATCTA A1311Met Pro lie Thr Arg lie His Ala Arg Gln lie Tyr Asp Ser Arg Gly151015Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu His Thr Glu Lys Gly Val Phe Arg202530Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly lie His Glu Ala Leu Glu354045Leu Arg Asp Gln Asp Lys Ala Val His His Gly Lys Gly Val Glu Lys505560Ala Val Ala Asn Val lie Glu Lys lie Ala Pro Ala Leu lie Ala Lys65707580Asn Phe Asp Val Thr Asp Gln Val Ala lie Asp Lys Phe Met lie Glu859095Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Ser Leu Gly Ala Asn Ala lie Leu10005110Gly Val Ser Leu Ala Val Ala Lys Ala Gly Ala Val His Lys Gly Val11512025
Pro Leu Tyr Lys His Leu Ala Asp Leu Ala Gly Val Ser Lys Val Val
130135140Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val lie Asn Gly Gly Ser His Ala Gly145150155160Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met lie Leu Pro Val Gly Ala Lys165170175Ser Phe Lys Glu Ala Met Arg Met Gly Ser Glu lie Tyr His His Leu180185190Lys Ala Glu lie Lys Lys Arg Tyr Gly Leu Asp Ala Thr Ala Val Gly195200205Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn lie Gln Asp Asn Lys Glu Gly Leu210215220Asp Leu Leu Asn Thr Ala lie Lys Leu Ala Gly Tyr Thr Gly Leu Val225230235240Ser lie Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Glu Asn Glu245250255Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asn Ser Asp Pro Ser Lys260265270Trp lie Asn Gly Asp Glu Leu Ala Ala Leu Tyr Gln Ser Phe lie Lys275280285Asp Tyr Pro Val Val Ser lie Glu Asp Ala Phe Asp Gln Asp Asp Trp290295300Ala Asn Trp Ser Lys Leu Met Gly Asn Thr Ser lie Gln Leu Val Gly305310315320Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg lie Gln Met Ala Val Asp325330335Gln Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln lie Gly Ser340345350lie Thr Glu Ser lie Glu Ala Ala Lys Leu Ser Arg Ala Asn Gly Trp355360365Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Cys Phe lie370375380Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Ala Thr Gly Gln lie Lys Thr Gly Ala385390395400Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg lie405410415Glu Glu Glu Leu Gly Ala Asp Ala Val Tyr Ala Gly Glu Asn Phe Arg420425430Asn Pro Gln lie43權利要求
一種編碼線蟲表皮蛋白的基因enol，其特征在于它是由格式線蟲(Steinernema glaseri)產(chǎn)生的，其核苷酸序列為 1 ATGCCTATCA CTCGCATCCA CGCTCGTCAG ATCTACGACT CCCGTGGCAA CCCCACCGTC 61 GAAGTCGACC TCCACACCGA GAAGGGTGTG TTCCGTGCTG CTGTCCCCAG CGGAGCCTCC 121 ACTGGCATCC ATGAGGCTCT GGAACTCCGC GACCAGGACA AGGCTGTCCA CCACGGAAAG 181 GGAGTCGAGA AGGCCGTCGC CAACGTCATC GAGAAGATCG CGCCGGCCCT CATCGCCAAG 241 AACTTCGATG TGACCGACCA AGTCGCCATC GACAAGTTCA TGATCGAGCT TGACGGAACC 301 GAGAACAAGT CGAGCCTCGG AGCCAACGCC ATCCTCGGCG TGTCGCTCGC CGTCGCCAAG 361 GCTGGTGCCG TGCACAAGGG AGTGCCCCTC TACAAGCACT TGGCCGATCT CGCCGGAGTG 421 AGCAAGGTTG TCCTCCCCGT TCCTGCCTTC AACGTCATCA ACGGAGGCTC GCACGCCGGA 481 AACAAGCTCG CCATGCAGGA GTTCATGATC CTCCCCGTCG GAGCCAAGAG CTTCAAGGAG 541 GCCATGCGCA TGGGATCCGA GATCTACCAC CACCTCAAGG CCGAGATCAA GAAGCGCTAC 601 GGACTCGACG CCACCGCCGT CGGAGATGAG GGAGGATTCG CCCCCAACAT CCAGGACAAC 661 AAGGAGGGTC TTGACCTCCT CAACACCGCT ATCAAGCTTG CCGGATATAC CGGACTGGTG 721 TCCATCGGCA TGGACGTCGC CGCCTCCGAG TTCTACAAGG AGAACGAGAA GAAGTACGAC 781 TTGGACTTCA AGAACCCCAA CTCCGACCCC AGCAAGTGGA TCAACGGAGA CGAGCTCGCC 841 GCGCTCTACC AGTCGTTCAT CAAGGACTAT CCCGTCGTCT CCATCGAGGA CGCCTTCGAC 901 CAGGACGACT GGGCGAACTG GAGCAAGCTG ATGGGCAACA CCTCCATCCA GCTCGTCGGA 961 GATGATCTCA CCGTCACCAA CCCCAAGCGC ATCCAGATGG CCGTCGACCA GAAGGCGTGC1021 AACTGCCTTC TCCTCAAGGT CAACCAGATC GGATCCATCA CCGAGTCCAT CGAGGCCGCC1081 AAGCTGTCCC GCGCCAACGG ATGGGGCGTC ATGGTTTCCC ACCGTTCTGG AGAAACCGAA1141 GACTGCTTCA TCGCTGATCT TGTTGTTGGC CTCGCTACTG GACAGATCAA GACCGGAGCC1201 CCTTGCCGAT CTGAGCGTCT CGCCAAGTAC AACCAGCTTC TTCGCATCGA GGAGGAGCTC1261 GGAGCCGATG CCGTGTACGC CGGAGAGAAC TTCCGCAACC CCCAGATCTA A。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因enol編碼的線蟲表皮蛋白Enol，其氨基酸序列為 1 MPITRIHARQ IYDSRGNPTV EVDLHTEKGV FRAAVPSGAS TGIHEALELR DQDKAVHHGK61 GVEKAVANVI EKIAPALIAK NFDVTDQVAI DKFMIELDGT ENKSSLGANA ILGVSLAVAK 121 ENKSSLGANA ILGVSLAVAK SKVVLPVPAF NVINGGSHAG NKLAMQEFMI LPVGAKSFKE 181 AMRMGSEIYH HLKAEIKKRY GLDATAViiDE GGFAPNIQDN KEGLDLLNTA IKLAGYTGLV 241 SIGMDVAASE FYKENEKKYD LDFKNPNSDP SKffINGDELA ALYQSFIKDY PVVSIEDAFD 301 QDDffANWSKL MGNTSIQLVG DDLTVTNPKR IQMAVDQKAC NCLLLKVNQI GSITESIEAA 361 KLSRANGffGV MVSHRSGETE DCFIADLVVG LATGQIKTGA PCRSERLAKY NQLLRIEEEL 421 GADAVYAGEN FRNPQI。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因enol和權力要求2所述的蛋白Enol，抑制昆蟲血細胞 免疫的功能。
4.根據(jù)權利要求1所述的基因enol和權力要求2所述的蛋白Enol，用于抑制昆蟲血 細胞免疫的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白，其特點是根據(jù)格式線蟲(Steinernema glaseri)表皮蛋白Enol的肽段序列克隆到表皮蛋白基因enol，該蛋白具有抗昆蟲血細胞免疫的功能。本發(fā)明還涉及該蛋白及其多核苷酸的制備方法和用途。一種抗昆蟲血細胞免疫的蛋白及基因序列。
文檔編號C12N15/12GK101818153SQ20091011990
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權日2009年2月26日
發(fā)明者劉華, 姚慶, 張雨良, 曾洪梅, 楊懷文, 楊秀芬, 袁京京, 邱德文 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所