專利名稱：基于巨細(xì)胞病毒的免疫原性制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒(CMV)在受試者中產(chǎn)生長期的、永久激活的基于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的方法，例如抗由巨細(xì)胞病毒表達(dá)的異源抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用重組的復(fù)制缺陷型CMV作為抗癌的免疫原制劑的方法。政府支持的聲明本發(fā)明是利用NIH授予的基金號ROlAI 47206和21CA12718和國防部授予的基金號BC084377的政府資助完成的。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
·
雖然腫瘤和病毒免疫學(xué)之間有明顯的相似性(parallel)，但是在其領(lǐng)域它們的差異更加顯著。病毒通常是具有強(qiáng)力的免疫原性的、激活先天免疫“危險(xiǎn)”信號(例如，Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo))和呈現(xiàn)豐富的外來抗原。腫瘤通常最多包含突變的或過表達(dá)的自身蛋白作為抗原，并可能引起免疫耐受而不是免疫激活。因此，腫瘤疫苗的目的之一是誘使免疫系統(tǒng)來治療腫瘤，就好像它是病毒而不是無害的自身組織。鑒于發(fā)現(xiàn)表觀腫瘤根除后腫瘤可以作為微轉(zhuǎn)移或癌癥干細(xì)胞持續(xù)存在，特別希望的是產(chǎn)生穩(wěn)定的和長效的免疫應(yīng)答。這些細(xì)胞自己可能很少分裂，因此在放療和化療中存活。然而，他們的后代是具有致命的腫瘤產(chǎn)生能力的典型的癌細(xì)胞。由于癌癥干細(xì)胞可以保持休眠數(shù)月或數(shù)年，腫瘤疫苗接種的另一個(gè)目的是在消除最初的腫瘤負(fù)荷之后長時(shí)間內(nèi)提供警醒的免疫監(jiān)視。在理想的情況下，這種免疫監(jiān)視涉及⑶8+T細(xì)胞，該細(xì)胞可以巡視組織以檢測微轉(zhuǎn)移，而不是等待腫瘤被傳遞到引流淋巴結(jié)。腫瘤表位的弱免疫原性及免疫系統(tǒng)通常由免疫耐受而非通過啟動(dòng)強(qiáng)力的效應(yīng)子應(yīng)答對他們作出響應(yīng)的事實(shí)阻礙了成功的腫瘤免疫治療。理想的免疫治療腫瘤疫苗會(huì)引發(fā)(a)穩(wěn)定的、(b)有效的、(C)抵抗免疫耐受的發(fā)生、(d)長效的及(e)在最初的腫瘤控制之后對于抗復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的“免疫監(jiān)視”任務(wù)有效的免疫應(yīng)答。由巨細(xì)胞病毒(CMV)感染引發(fā)的穩(wěn)定的終身免疫應(yīng)答和CMV克服自體耐受性的能力表明CMV可以是理想的腫瘤免疫治療的疫苗載體。CMV是皰疹病毒家族β亞類的成員。它是建立終身的潛伏性或持續(xù)性感染的大的(包含230kb基因組)、雙鏈DNA病毒。在發(fā)達(dá)國家如美國，約70%的人口感染了 CMV。與Y皰疹病毒例如Epstein-Barr病毒和卡波濟(jì)氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒相反，CMV為非轉(zhuǎn)化的和非致癌的。減毒的CMV活疫苗(基于缺乏一部分CMV基因組的人類CMVTowne病毒株)已經(jīng)于II期和III期的安全性和有效性臨床試驗(yàn)中通過皮下注射施用于超過800名受試者(Arvin等.,Clin. Infect. Dis. 39 =233-239, 2004) 雖然這種疫苗被認(rèn)為是完全安全的，但它不是完全有效的。最近，為試圖增加其療效，替換了 Towne疫苗株中缺失的一些基因。該疫苗已經(jīng)在II期的安全性研究中進(jìn)行了測試，并被認(rèn)為是安全的(Arvin等,Clin. Infect.Dis. 39 :233-239,2004)。已在幾份報(bào)告中證明了活的、重組的CMV產(chǎn)生抗重組抗原的免疫應(yīng)答的能力(Hansen 等，Nat. Med. 15 :293-299, 2009 ；Karrer 等，J. Virol. 78 :2255-2264, 2004)。此夕卜，最近已證明，經(jīng)工程化以表達(dá)自身蛋白的重組的有復(fù)制能力的CMV會(huì)產(chǎn)生抗表達(dá)該自身蛋白的細(xì)胞的長效的、基于CD8+T細(xì)胞的免疫力(Lloyd等，Biol. R印rod. 68 =2024-2032,
2003)。由于大多數(shù)的腫瘤抗原是過表達(dá)的自身蛋白，該結(jié)果為使用CMV載體誘導(dǎo)對腫瘤的免疫應(yīng)答的概念提供了支持。最值得注意的是，Hanson等使用表達(dá)SIV抗原的重組獼猴CMV來免疫獼猴抗SIV (Hansen等，Nat. Med. 15 =293-299,2009)。該免疫誘導(dǎo)大量對外周組織中的SIV特異性的激活的“效應(yīng)子記憶”CD8+T細(xì)胞，這在為時(shí)多年的整個(gè)研究中是持續(xù)的。明顯的是，免疫的猴子受到SIV激發(fā)的實(shí)質(zhì)保護(hù)，這是由于激活的效應(yīng)子記憶T細(xì)胞的存在。該研究還表明，對CMV的預(yù)先存在的免疫力并沒有阻止重組CMV誘導(dǎo)新的免疫應(yīng)答的能力。盡管減毒的CMV活疫苗是表觀安全的，但對基于CMV的活疫苗的策略仍然保持明顯關(guān)注。雖然在健康個(gè)體中CMV感染通常是完全無癥狀的，但在免疫抑制個(gè)體(如艾滋病 患者、器官移植接受者或在子宮內(nèi)感染的嬰兒)中可能會(huì)產(chǎn)生問題。此外，基于CMV的腫瘤疫苗的潛在接受者可能是或者可能變成免疫缺陷的，從而顯著限制了活的CMV腫瘤疫苗的使用。因此，存在著在免疫受損個(gè)體中完全安全的CMV疫苗載體的持續(xù)需要。發(fā)明概述本文公開的是令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，完全不能在細(xì)胞間傳播的復(fù)制缺陷型CMV能夠在受試者體內(nèi)產(chǎn)生長期的免疫應(yīng)答。因此，本文所描述的是在受試者體內(nèi)產(chǎn)生長期的重復(fù)刺激的抗異源抗原的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用向受試者施用(例如，以單一劑量)包含編碼異源抗原的異源核酸的重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒，由此在受試者體內(nèi)建立病毒潛伏，該潛伏導(dǎo)致對抗該抗原的重復(fù)刺激的免疫應(yīng)答。在特定的實(shí)施例中，刺激的免疫應(yīng)答是抗細(xì)菌、真菌、病毒或腫瘤源的多肽的。還描述了被診斷患有癌癥的受試者的治療方法，包括對受試者施用一種化療或免疫抗癌試劑或者化療和免疫抗癌試劑的組合；并且通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用向相同的受試者施用包含編碼源自癌癥的異源抗原的異源核酸的重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒，由此在受試者體內(nèi)建立病毒潛伏，該潛伏導(dǎo)致抗癌癥的刺激的免疫力。通過參照附圖
的下面的詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述的和其它的目標(biāo)、特征和優(yōu)勢將變得更加明白。附圖簡要說明圖I是CMV感染后隨著時(shí)間的推移，比較病毒滴度和CMV-反應(yīng)性T細(xì)胞的曲線圖。圖2顯示了由MCMV-IE2_ova疫苗和B16-D5_ova腫瘤激發(fā)誘發(fā)的免疫應(yīng)答。A)在用MCMV-ova或僅載體接種6個(gè)月后的外周血中，卵清蛋白肽SIINFEKL的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)分析測量值直接在體外測定。上圖用SIINFEKL刺激。下圖無肽。B)如在A中測定的外周血中SIINFEKL特異性反應(yīng)的ICS測量值，作為接種6個(gè)月后但在腫瘤激發(fā)之前和在腫瘤激發(fā)之后17天，6只接種的小鼠中總CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。C)在接種小鼠和對照小鼠中腫瘤發(fā)展的過程，顯示為在接種后的指定天數(shù)保持無腫瘤的小鼠的百分比。大多數(shù)動(dòng)物在產(chǎn)生可觸知的腫瘤的七天內(nèi)死亡。一只接種的小鼠(圖2B中的#4)保持無瘤。圖3為顯示MCMV-感染的B6小鼠中T細(xì)胞應(yīng)答的一對圖。在感染的急性期(之后7天)和慢性期(之后7天)中C57BL/6小鼠的感染誘導(dǎo)了可重復(fù)的免疫優(yōu)勢層級。
圖4是一系列顯示用具有復(fù)制能力的MCMV感染的小鼠中⑶8+T細(xì)胞記憶擴(kuò)張(memory inflation)的圖。在第O周用MCMV感染C57BL/6小鼠(n_5)。在感染后指定周，由尾部放血獲得外周血并通過四聚體染色測定對于三個(gè)MCMV表位(ml39、m38和IE3)的反應(yīng)。以血液中總CD8+淋巴細(xì)胞的百分比對表位特異性的反應(yīng)作圖。符號表示動(dòng)物個(gè)體；線表示平均值。未感染對照的背景四聚體染色<0.2%。圖5是一系列顯示用復(fù)制缺陷型MCMV感染的小鼠中⑶8+T細(xì)胞的記憶放大的圖。A)用野生型MCMV感染的小鼠用實(shí)心圓表示和用復(fù)制缺陷型AgL MCMV感染的小鼠用空心圓表示。每條線代表在指定時(shí)間點(diǎn)分析的單個(gè)小鼠。數(shù)據(jù)以通過四聚體染色評定的外周血中總CD8+T細(xì)胞的％作圖。B)在用指定的肽刺激T細(xì)胞后，來自野生型和AgL感染的小鼠的⑶8+T細(xì)胞的代表性FACS圖。評估T細(xì)胞在感染后25周的IFN- Y產(chǎn)生(Y-軸)和KLRG-I表達(dá)(X-軸)。C)感染后20周來自野生型和AgL感染的小鼠的抗原特異性細(xì)胞的 代表性FACS圖顯示⑶8表達(dá)(X-軸)和四聚體染色(Y-軸)，以表明四聚體結(jié)合的T細(xì)胞如何被分選的。另外的FACS圖顯示在四聚體陽性T細(xì)胞分選后的KLRG-I表達(dá)(X-軸)和CD127 表達(dá)(IL-7Ra，Y-軸)。圖6是一系列顯示在足墊中皮下感染后，由野生型MCMV或Λ gL復(fù)制缺陷型MCMV誘發(fā)的免疫應(yīng)答的圖。通過如圖5A所示的四聚體染色測定外周血中T細(xì)胞隨著時(shí)間的反應(yīng)。實(shí)心圓表示野生型感染的小鼠?？招膱A代表AgL感染的小鼠。各條線代表在指定的感染后時(shí)間進(jìn)行測試的單個(gè)動(dòng)物。圖7是顯示用野生型或AgL MCMV感染的存在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的脾臟中在感染后的各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)存在的病毒基因組數(shù)目的圖。Balb/c-SCID小鼠在第O天用不同量的野生型病毒或IxlO5Pfu的AgL病毒感染。各組中任何成員表現(xiàn)出疾病跡象時(shí)，對該組動(dòng)物進(jìn)行處死。用AgL病毒感染的小鼠在感染后六周內(nèi)從未表現(xiàn)出疾病跡象。序列表在所附的序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列顯示使用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母代碼顯示，如37 C. F. R. I. 822中所規(guī)定的。只顯示各核酸序列的一條鏈，但應(yīng)理解對顯示鏈的任何引用包括互補(bǔ)鏈。在所附的序列表中SEQ ID NO 1是MCMV El的代表性探針的核酸序列。SEQ ID NO :2和3 (分別)是MCMV El的代表性正向和反向引物的核酸序列。詳細(xì)描述I.縮略詞
權(quán)利要求
1.在受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗異源抗原的長期的、重復(fù)刺激的免疫應(yīng)答的方法，包括 通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用給受試者施用包含編碼所述抗原的異源核酸的重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒，由此在受試者體內(nèi)建立病毒潛伏，從而產(chǎn)生抗該抗原的重復(fù)刺激的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述重復(fù)刺激的免疫應(yīng)答包括CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
3.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的方法，其中所述異源抗原包括細(xì)菌、真菌、病毒或腫瘤源的多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述腫瘤源的多肽是癌抗原。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒包含滅活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述滅活的基因編碼gL糖蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述編碼gL糖蛋白的基因是通過敲除突變滅活的。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼抗原的核酸可操作地與組成型啟動(dòng)子連接。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼抗原的核酸可操作地與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒是鼠巨細(xì)胞病毒。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒是人巨細(xì)胞病毒。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述人巨細(xì)胞病毒選自于AD169、Davis、Toledo和Towne0
13.一種治療被診斷患有癌癥的受試者的方法，包括 對所述受試者施用一種化療或免疫抗癌藥物或者化療和免疫抗癌藥物的組合；和 通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用給受試者施用重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒，該病毒包含編碼源自該癌癥的異源抗原的異源核酸，由此在受試者體內(nèi)建立病毒潛伏，從而產(chǎn)生對抗該癌癥的重復(fù)刺激的免疫力。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述重復(fù)刺激的免疫力包括CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒包含滅活的gB、gD、gH和gL糖蛋白基因。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述滅活的基因編碼gL糖蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述編碼gL糖蛋白的基因通過敲除突變滅活。
18.權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒是人巨細(xì)胞病毒。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述人巨細(xì)胞病毒選自于AD169、Davis、Toledo和Towne0
20.權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的方法，還包括對所述受試者施用放射治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用重組的復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒(CMV)在受試者中產(chǎn)生長期的、重復(fù)刺激的基于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的方法，例如，對抗由巨細(xì)胞病毒表達(dá)的異源抗原的免疫應(yīng)答。進(jìn)一步涉及使用重組的復(fù)制缺陷型CMV作為抗癌的免疫原性制劑的方法。
文檔編號C07K14/045GK102844663SQ201080065800
公開日2012年12月26日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者A·B·希爾, C·M·斯奈德 申請人:俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)