專利名稱：：人巨細(xì)胞病毒m抗原表位及其在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用的制作方法人巨細(xì)胞病毒M抗原表位及其在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人巨細(xì)胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在制備人巨細(xì)胞病毒診斷試劑或疫苗中的應(yīng)用或在其它醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。發(fā)明背景人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)是一類在自然界普遍存在但又具有嚴(yán)格種屬特異性的病毒，屬P皰疹病毒亞科。人巨細(xì)胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多數(shù)呈臨床不顯性感染或潛伏感染，多數(shù)人在兒童或少年期受HCMV感染后獲得免疫。在孕婦，原發(fā)或新的HCMV復(fù)發(fā)感染均可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍產(chǎn)期感染，可導(dǎo)致胎兒畸形，智力低下和發(fā)育遲緩等，嚴(yán)重者可引起全身性感染綜合征，稱為巨細(xì)胞包涵體病。近20年來(lái)，隨著免疫低下?tīng)顟B(tài)人群包括艾滋病、放射損傷、器官移植和惡性腫瘤等患者的增多，HCMV感染及其引發(fā)的嚴(yán)重疾病有日益增加的趨勢(shì)，這引起了人們對(duì)人巨細(xì)胞病毒分子生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷技術(shù)、治療與預(yù)防等研究的重視。在巨細(xì)胞病毒外層嚢膜上含有多種糖蛋白，包括糖蛋白B(gB)、H(gH)、M(gM)/N(gN)、0(g0)/L(gL)等。gB是主要的中和性抗原，gH的作用是輔助膜蛋白B結(jié)合細(xì)胞膜受體EGFR使病毒完成對(duì)細(xì)胞的侵襲過(guò)程。相對(duì)于gB、gH來(lái)說(shuō)，gM研究的文獻(xiàn)較少。gM或gM/gN復(fù)合物的中和性作用是最近才研究證實(shí)。gN的作用一方面與gM構(gòu)成復(fù)合物在病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生中和性抗體，另一方面與病毒的復(fù)制有關(guān)。gM是病毒的第三類膜蛋白，分子量約為42-45kDa，經(jīng)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)gM蛋白含有7個(gè)跨膜區(qū)段。在病毒外膜上gM與gN形成異源二聚體而存在。盡管其中和性抗原的性質(zhì)已經(jīng)得到確認(rèn)，但到目前為止有關(guān)gM的表位研究還未見(jiàn)報(bào)道。gM的研究同樣具有重要的意義。(JVirol.2006.80(9):4591-4600).目前臨床診斷HCMV的主要方法是血清學(xué)診斷。血清學(xué)HCMV診斷主要是檢測(cè)IgM和(或)IgG。HCMV病毒感染機(jī)體首先出現(xiàn)IgM抗體，IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性直接說(shuō)明病毒正處于活動(dòng)期或繁殖期，它是病毒感染的前期表現(xiàn)，所以IgM抗體檢測(cè)在臨床應(yīng)用最多；但I(xiàn)gM抗體維持時(shí)間很短，從出現(xiàn)到消失僅僅一周左右的時(shí)間，如果檢測(cè)不及時(shí)很可能造成病例假陰性結(jié)果。IgG抗體盡管出現(xiàn)較晚，其維持時(shí)間最長(zhǎng)，有時(shí)可達(dá)幾個(gè)月的時(shí)間。檢測(cè)HCMVIgG的變化曲線是臨床診斷的重要參考依據(jù)。在臨床上將檢測(cè)IgM和IgG相結(jié)合才能盡量避免假陰性或者假陽(yáng)性結(jié)果。臨床血清學(xué)方法檢測(cè)HCMV試劑主要是商品化的ELISA試劑盒。由于國(guó)內(nèi)試劑盒目前包被的抗原大部分為裂解后的病毒粒子，成分復(fù)雜，同一病毒科的成員具有很多相同的成分，所以檢測(cè)過(guò)程中很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，導(dǎo)致臨床的誤診；而國(guó)外有些試劑盒已經(jīng)開(kāi)始包被重組的HCMV特異蛋白或人工合成的多肽，但其成本高，在臨床檢測(cè)過(guò)程中增加了患者醫(yī)療費(fèi)用，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)臨床檢測(cè)時(shí)推廣受到限制。近年來(lái)多主張釆用重組表達(dá)HCMV蛋白及多肽作為檢測(cè)抗原，已發(fā)現(xiàn)具有較高的診斷價(jià)值。用重組表達(dá)的病毒特異蛋白及多肽作為抗原檢測(cè)HCMV具有兩方面的優(yōu)勢(shì)l)避免了HCMV病毒粒子帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)；2)由于抗原是HCMV特異的蛋白或多肽，能夠減少假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。[JClinMicrobiol.2005，43(9):4713-4718]HCMV疫苗的研究包括亞單位疫苗、質(zhì)粒載體DM疫苗、病毒載體DNA疫苗、合成蛋白(肽)疫苗。除了近幾年研究的基因工程疫苗以夕卜，還包括已在臨床上有限制應(yīng)用的Towne減毒活疫苗。目前在國(guó)外，有的疫苗已完成n期臨床試驗(yàn)研究[ClinInfectDis.2004，39:233-239],而國(guó)內(nèi)至今沒(méi)有疫苗進(jìn)行臨床試驗(yàn)的報(bào)道，只是對(duì)幾種病毒成分做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)室研究[軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊.2003,27(5):38-41;青島醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2003，39(1):12-15]。近年來(lái)抗原表位肽作為候選疫苗的研究越來(lái)越受到廣泛的重視，但由于抗原表位肽免疫原性差及免疫佐劑研制的限制，抗原表位肽在臨床上的應(yīng)用研究還處于初級(jí)階段。隨著表位肽的研究進(jìn)展，表位肽作為疫苗的應(yīng)用具有廣闊的前景。因此HCMV特異多肽的發(fā)現(xiàn)對(duì)提高臨床檢測(cè)HCMV陽(yáng)性率及預(yù)防HCMV感染的實(shí)驗(yàn)研究具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容鑒于gM或gM/gN復(fù)合物中和性抗體能夠部分抑制病毒的感染力，且目前還沒(méi)有g(shù)M抗原表位的研究報(bào)道，我們以羊抗HCMV多克隆抗體為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)噬菌體線性隨機(jī)肽庫(kù)篩選獲得了多克隆抗體一個(gè)結(jié)合肽，通過(guò)與gM蛋白序列比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)合肽序列與gM蛋白第32-38位氨基酸序列具有較高的一致性。將結(jié)合肽偶聯(lián)至鑰孔血蘭蛋白(KLH)后免疫Balb/c鼠，獲得了針對(duì)結(jié)合肽的多抗血清。該多抗血清不僅能夠結(jié)合天然的HCMV病毒粒子，而且還能夠結(jié)合重組表達(dá)的gM30-78多肽。本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及HCMV中的新M抗原表位，其是具有用單字符表示的如下氨基酸序列的多肽LVLSNFP。本發(fā)明的另一方面，涉及與上述M抗原表位序列具有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸殘基替換，且具有相同或相似的中和活性的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽具有用單字符表示的如下氨基酸序列LXLSQXP，其中X表示已知20中氨基酸中的任意一個(gè)。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述多肽具有用單字符表示的如下氨基酸序列HLVLSNFP。在本發(fā)明中，有用的保守置換在表1中列出。將屬于一個(gè)類別的氨基酸替換為相同類別的另一個(gè)氨基酸的保守置換落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這種置換實(shí)質(zhì)上不改變所述表位多肽的生物活性。表1優(yōu)選的氨基酸置換<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的又一方面涉及含有所述M抗原表位的多肽在制備HCMV診斷試劑或針對(duì)HCMV的疫苗中的應(yīng)用。微量病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明具有上述結(jié)構(gòu)多肽的抗體具有中和活性。通過(guò)FITC標(biāo)記HCMV即刻早期蛋白的表達(dá)情況，與陽(yáng)性對(duì)照羊抗HCMV多抗B65275G和陰性對(duì)照正常小鼠血清、正常山羊血清及PBS相比，經(jīng)過(guò)鼠抗結(jié)合肽多抗處理的HCMV粒子其感染HEL細(xì)胞后FITC熒光的數(shù)量明顯比陰性對(duì)照減少，HCMV病毒粒子感染能力降低，表明鼠抗結(jié)合肽抗體能夠部分中和病毒的活性。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)結(jié)合肽與重組表達(dá)的HCMVB抗原表位區(qū)AD1和AD2均能特異結(jié)合已知的HCMVIgG陽(yáng)性的人血清。將結(jié)合肽與AD1、AD2混合檢出的HCMVIgG陽(yáng)性人血清率比單純AD1/AD2混合物檢出率高。下面以結(jié)合附圖和針對(duì)M抗原表位的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1顯示鼠抗M抗原表位多抗竟?fàn)幰种蒲蚩笻CMV多抗結(jié)合HCMV病毒的ELISA結(jié)果。圖2顯示鼠抗M抗原表位多抗的微量HCMV病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A為HCMV多抗B65275G;B為M抗原表位多抗；C為B孔伊文斯蘭復(fù)染結(jié)果；D為正常小鼠抗體；E為正常山羊抗體；F為無(wú)抗體陰性對(duì)照。圖3顯示gM30-78多肽結(jié)合鼠抗M抗原表位多抗WesternBlot結(jié)果，其中1為鼠抗M抗原表位多抗；2為His單抗。實(shí)施例1.羊抗HCMV多抗抗原表位的篩選首先用100ul羊抗HCMV多抗IgG包被于酶聯(lián)板，置4'C過(guò)夜。經(jīng)過(guò)3%的BSA封閉lh后，加入噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)(NEB產(chǎn)品)，室溫孵育lh，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1%TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結(jié)合的噬菌體，再用G.2mmol/L甘氨酸-HClpH2.2洗脫特異結(jié)合的噬菌體，洗脫液用lmol/LTris-HC1pH9.0中和。按照產(chǎn)品試劑盒提供的方法，測(cè)定洗脫液中的噬菌體的滴度，以正常山羊血清IgG的洗脫噬菌體的滴度作為對(duì)照，測(cè)定P/N比值。同時(shí)將洗脫的與TRAP抗體IgG結(jié)合的噬菌體擴(kuò)增，并測(cè)定其滴度，用于下一輪的篩選。經(jīng)過(guò)4輪篩選后，測(cè)定的P/N比值有了明顯的提高。將富集的噬菌體克隆進(jìn)行ELISA鑒定，隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。分析后得到包含抗原表位序列的多肽序列。實(shí)施例2.篩選到的抗原表位序列和M蛋白序列進(jìn)行比較將篩選抗原表位序列和M蛋白的原始序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗原表位序列與M蛋白的32-38位氨基酸序列存在高度同源性表4立序列xzx，xfM蛋白一級(jí)序列31HZV諸F戶38實(shí)施例3.抗原表位多抗竟?fàn)幰种蒲蚩笻CMV多抗結(jié)合病毒粒子將M抗原表位通過(guò)共價(jià)鍵與鑰孔血蘭蛋白(KLH)偶聯(lián)，免疫Balb/C鼠獲得了M抗原表位多抗血清。經(jīng)過(guò)ProteinA純化后得到純度較高的M抗原表位多抗。按照試劑盒的方法，將HCMV病毒包被ELISA板孔，經(jīng)過(guò)3。/。的BSA封閉lh后，加入抗原表位多抗與不同濃度的羊抗HCMV多抗，室溫孵育lh，用PBST(20mmol/LPBS，0.5%Tween-20，pH7.5)洗滌，然后加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠二抗，用ECL液顯示抗原模擬表位抗體結(jié)合病毒的0D值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著羊抗HCMV多抗量的增加，抗原表位多抗結(jié)合病毒的能力呈下降趨勢(shì)，直至最后達(dá)到與正常山羊血清水平。(參見(jiàn)圖l)實(shí)施例4.抗原表位多抗微量病毒中和實(shí)驗(yàn)首先分別用標(biāo)準(zhǔn)羊抗HCMV多抗、M抗原表位多抗、正常小鼠多抗、正常山羊多抗以及PBS處理HCMV病毒粒子，然后將處理過(guò)的病毒感染HEL細(xì)胞。16小時(shí)后先用無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，再加入單抗MAB8129與病毒表達(dá)的分子量為68kD的即刻早期蛋白反應(yīng)，最后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體。通過(guò)計(jì)數(shù)熒光點(diǎn)數(shù)觀察M抗原表位多抗抑制病毒的能力。結(jié)果表明1:64倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)羊抗HCMV多抗幾乎完全抑制了病毒侵入細(xì)胞的能力，與1:2倍稀釋的正常小鼠多抗，正常山羊多抗以及PBS處理過(guò)的病毒相比，1:4倍稀釋的M抗原表位多抗能夠部分抑制病毒侵入HEL細(xì)胞。表明M抗原表位多抗具有中和病毒的活性。(參見(jiàn)圖2)實(shí)施例5.抗原表位序列展示在細(xì)菌鞭毛上及免疫動(dòng)物的效果觀察利用鞭毛的在細(xì)菌表面的高拷貝數(shù)(每個(gè)細(xì)菌約二萬(wàn)個(gè)拷貝)的性質(zhì)，我們將M蛋白抗原表位序列對(duì)應(yīng)的多肽展示在大腸桿菌GI826鞭毛蛋白的硫氧環(huán)蛋白區(qū)，將重組菌免疫小鼠，檢測(cè)特異抗體的產(chǎn)生，經(jīng)過(guò)兩次加強(qiáng)免疫后。WestenBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示產(chǎn)生的抗血清能夠特異結(jié)合重組表達(dá)的gM30-78多肽，表明我們獲得的抗原表位肽與合適的載體偶聯(lián)后具有良好的免疫原性。實(shí)施例6.抗原表位聯(lián)合重組表達(dá)的已知的B抗原表位AD1和AD2檢測(cè)人血清應(yīng)用我們從山東省圻南縣計(jì)劃生育服務(wù)站和北京兒童醫(yī)院獲得人血清40份，分別用兩個(gè)不同生物公司生產(chǎn)的HCMVIgGELISA試劑盒檢測(cè)此40份血清，結(jié)果有8份血清確定為IgG陽(yáng)性(第6、10、11、17、18、40、41、42號(hào))。在這8份HCMVIgG陽(yáng)性的人血清中其中有3份血清(第6、11、41號(hào))能夠特異結(jié)合M抗原表位，有6份血清(第6、10、11、17、40、42號(hào))與重組表達(dá)的已知的B抗原AD1/AD2表位混合物發(fā)生特異的結(jié)合反應(yīng)。將M抗原表位與重組表達(dá)的AD1、AD2混合作為抗原，發(fā)現(xiàn)該混合物能夠特異結(jié)合7份血清(第6、10、11、17、40、41、42號(hào))。其中第41號(hào)血清只能與M抗原表位反應(yīng)而不與AD1/AD2混合物反應(yīng)，初步表明M抗原表位的發(fā)現(xiàn)提高了HCMV的檢出率。(參見(jiàn)表l)表1、本發(fā)明所述M抗原表位及已知B抗原AD1/AD2表位(MAD)與HCMVIgG標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測(cè)定陽(yáng)性人血清的比較結(jié)果樣品OD450.值標(biāo)準(zhǔn)試劑盒MAD10.203±0.020.189土0.0120.123±0.030.134±0.0130,172土0.010.09士0.0140.213±0.050.129士0.0250.134±0.030.2±0.0160.701±0.1020.642±0，70.205土0.020.135±0.0380.132±0.010.198士0.0490.2±0.010.19土0.01100.601±0,110.206±0.0211O'749士0.0970.808±0.109120.21士0.01o.no±o,oi130.121士0.020.203±0.0114(U35士0.040.124±0.05150.213±0.010.194±0.0216(U2士0.080.132±0.03170,628士0.127o.mo.oi180.151士0.03190.07±0.010.98±0,02200.152土0.0S0.14±0.05樣品OD450值標(biāo)準(zhǔn)試刑盒MAD210.168士0.030.112±0,08220.08±0.020.112土0.01230.23±0.010.154±0,04250.167土0.040.2±0.02260.147士0.020.152±0.0228(U73士0.020.131士0.09290.159±0.01(U62士0.01300.18土0.030.122±0.02310.087土0.120,064±0,09320.052±0.10.095士0.12330.147±0,050,193±0.01340.051±0,080.078±0.01350.181±0.01(U67士0.03360.209±0.030.187士0.02370.156±0.010.143土0.0538(U93土0.020.187士0.04390.32土0.010.135±0.02400.539±0.090.102±0.01410.801±0.0780.525士0.045420.725±0.0720.216土0.0權(quán)利要求1.人巨細(xì)胞病毒M抗原表位或其具有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸殘基替換、添加或刪除且具有相同或相似的中和活性的保守性變體，其中所述M抗原表位具有以單字符表示的以下氨基酸序列LXLSQXP其中X表示已知20中氨基酸中的任意一個(gè)。2.權(quán)利要求1所述的M抗原表位，其具有以單字符表示的以下氨基酸序列LVLSNFP。3.權(quán)利要求1所述的M抗原表位，其具有以單字符表示的以下氨基酸序列HLVLSNFP。4.權(quán)利要求1所述的M抗原表位，其特征在于所示序列中的氨基酸殘基可以根據(jù)氨基酸的相似性進(jìn)行相互替代，其中絲氨酸殘基(S)和蘇氨酸殘基(T)之間可以相互替代；亮氨酸殘基(L)和異亮氨酸殘基(I)之間可以相互替代；谷氨酰胺殘基(Q)和天冬酰胺殘基(N)之間可以相互替代；苯丙氨酸殘基(F)和酪氨酸殘基(Y)之間可以相互替代。5.權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)的M抗原多肽在制備HCMV診斷試劑中的用途。6.權(quán)利要求l-4中的任意一項(xiàng)的14抗原多肽在制備針對(duì)110^的疫苗中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及人巨細(xì)胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在制備人巨細(xì)胞病毒診斷試劑或疫苗中的應(yīng)用或在其它醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/68GK101274957SQ20071030143公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2007年12月27日優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日發(fā)明者玉劉,光楊,川柳,沈倍奮,芳王,王本旭,邵寧生,高亞萍申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所