專利名稱：一種cd106陽性細(xì)胞、其鑒定、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞的分離和制備，專利涉及一種具有更強(qiáng)免疫抑制能力的 CD106間充質(zhì)干細(xì)胞的分離制備辦法。
背景技術(shù)：
大量的體內(nèi)、體外研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcell, MSC)能夠直接抑制T細(xì)胞的增殖、分化及其效應(yīng)機(jī)制，或者通過抑制樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)的分化和成熟，間接抑制T細(xì)胞的增殖，以及影響效應(yīng)T細(xì)胞亞群的分化。除了 T淋巴細(xì)胞和 DC，MSC的靶細(xì)胞還包括眾多其他類型的免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞(natural killer cell, NK)、 B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞免疫生物學(xué)活性，如細(xì)胞因子的分泌，細(xì)胞毒活性等，最終誘導(dǎo)抗炎效應(yīng)和/或免疫耐受狀態(tài)。目前對MSC的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全清楚，但是普遍認(rèn)為MSC主要通過細(xì)胞間接觸和可溶性因子的分泌發(fā)揮免疫抑制功能。
多種可溶性因子參與MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，它們可能直接來源于MSC，或者通過MSC和靶細(xì)胞交互作用旁分泌產(chǎn)生。目前研究較多的可溶性因子是前列腺素E2 (PGE2) 和人吲哚胺2，3-雙加氧酶(ID0)。MSC組成性表達(dá)一種對PGE2合成起關(guān)鍵作用的酶，即環(huán)氧化酶2 (Cyclooxygenase，COX-2)。MSC和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)可引起PGE2 的分泌上調(diào)，炎性細(xì)胞因子干擾素-Y (IFN- y )和腫瘤壞死因子-a (TNF- a )能提高M(jìn)SC 釋放PGE2的水平。從受體支氣管肺泡灌洗液中分離的同種異源MSC具有合成PGE2的能力， 體內(nèi)外可以利用化學(xué)抑制劑阻斷PGE2的生成來減輕MSC介導(dǎo)的免疫抑制功能，這些結(jié)果表明PGE2是參與MSC免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的關(guān)鍵分子。MSC不組成性表達(dá)ID0，但是靶細(xì)胞來源的 IFN-Y可誘導(dǎo)MSC表達(dá)IDO。IDO是色氨酸降解為犬尿氨酸過程中的限速酶，而色氨酸是 T細(xì)胞增殖所必需的氨基酸，其降解產(chǎn)物的堆積對T細(xì)胞增殖有抑制作用，這樣，在IFN-Y 存在下，MSC表達(dá)ID0，加速色氨酸的代謝，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。其他參與MSC免疫調(diào)節(jié)的可溶性因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-P I (TGF-^ I)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、白細(xì)胞介素-10 (IL-10)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、可溶性組織相容性白細(xì)胞抗原-G5 (HLA-G5)、一氧化氮 (NO)和半乳糖凝集素-9 (Galectin-I)等,它們可能通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成、影響效應(yīng)靶細(xì)胞的增殖、凋亡以及效應(yīng)因子的分泌等途徑介導(dǎo)MSC的免疫抑制功能。NO則更多參與小鼠MSC介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)。
多種因素影響MSC的免疫調(diào)節(jié)能力，其中最重要的因素可能是細(xì)胞因子微環(huán)境。 目前研究發(fā)現(xiàn)IFN-Y的分泌可能對MSC的免疫功能起重要作用。高濃度的IFN-Y可提高M(jìn)SC的免疫抑制能力，導(dǎo)致MSC對NK細(xì)胞的抑制效應(yīng)占優(yōu)勢。體外炎性因子如TNF- a 和IFN- y也可引起MSC的C0X-2和PGE2表達(dá)上調(diào)，通過PGE2依賴的方式抑制免疫應(yīng)答。 炎性因子作用MSC能上調(diào)黏附分子VCAM-I和ICAM-I，有助于MSC與T細(xì)胞的黏附，從而發(fā)揮其T細(xì)胞增殖的抑制功能。可以說，MSC所具備的這種免疫抑制特點(diǎn)使之在醫(yī)學(xué)上有巨大的應(yīng)用潛力，可以應(yīng)用于器官移植中排異反應(yīng)以及各種自身免疫性疾病的治療等多種情況。然而，常規(guī)制備的MSC是一個(gè)不均一的干細(xì)胞群體，并非所有的MSC都具備均一的較強(qiáng)免疫抑制能力，其到目前為止，尚未有某種成熟的公開技術(shù)能夠從MSC細(xì)胞群體中特異性地鑒別并獲取較高免疫抑制能力的細(xì)胞群體。
關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)⑶106 (又叫VCAM-I)的報(bào)道不一。有報(bào)道說骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)⑶106陽性，而臍帶、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞⑶106表達(dá)多為陰性或弱陽性。有人認(rèn)為STR0-1 /⑶106/⑶146均可作為有效分選干細(xì)胞的標(biāo)記。上述報(bào)道是基于其分化能力來說的，如在申請?zhí)枮?00880002860. I的專利中提到用⑶44和⑶106雙陽性分選間充質(zhì)干細(xì)胞用于形成牙，申請?zhí)枮?00480014698. 7的專利提到⑶106陽性分選間充質(zhì)前體細(xì)胞可以分化成血管和牙本質(zhì)等。Ren等在免疫學(xué)雜志(Journal of Immunology, 2010 ;184:2321-8)發(fā)表的文章中指出，炎癥因子可以上調(diào)ICAM-I和VCAM-I增強(qiáng)免疫抑制效果， 用IFN-Y能刺激間充質(zhì)干細(xì)胞增加VCAM-I表達(dá)，但這同時(shí)也會增加HLA-DR的表達(dá)。本發(fā)明中，我們比較研究了 CD106陽性和陰性的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化能力，發(fā)現(xiàn)沒有明顯的差異，但發(fā)現(xiàn)了 CD106陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y 的能力，表達(dá)更高的水平的C0X2和HGF。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)CD106陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)HLA-DR?；谶@些研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明建立一種⑶106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的鑒定、制備方法，用于鑒別人體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)水平、制備可以治療移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的高免疫抑制活性間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺乏有效鑒定和分選高免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供如下的解決方案。
利用發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的CD106陽性細(xì)胞的生物學(xué)特征，通過免疫學(xué)的方法鑒定并分離出CD106陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞，該干細(xì)胞亞群即具備了相對均一的高免疫抑制能力。具體來說是采用流式細(xì)胞儀或免疫磁珠進(jìn)行純化間充質(zhì)干細(xì)胞中的CD106陽性細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)增操作。
本發(fā)明的操作步驟概括如下(I)從組織中分離出的單個(gè)核細(xì)胞分離出CD106陽性細(xì)胞，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的⑶106陽性細(xì)胞；(2 )或?qū)慕M織中分離出的單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的間充質(zhì)細(xì)胞，在獲得足夠的細(xì)胞時(shí)，再分離出其中CD106陽性細(xì)胞；根據(jù)上述方法，我們達(dá)到了以下效果(I)我們可以得到大量CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞；(2)得到了具有更強(qiáng)的抑制淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-Y的活性間充質(zhì)干細(xì)胞，可以用于自身免疫系統(tǒng)疾病的治療。
目前我們檢測了成人骨髓、成人脂肪、羊膜、胎盤絨毛膜和臍帶來源的細(xì)胞，其中成人骨髓、胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)較高水平的CD106。
我們認(rèn)為CD106陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞是一種活化型的間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨髓和絨毛膜出現(xiàn)更多的活化型間充質(zhì)干細(xì)胞是為了更好的抑制免疫反應(yīng)，維持造血環(huán)境穩(wěn)定和避免胎兒被母體排異。一些炎癥因子能刺激CD106陰性間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD106，但我們認(rèn)為這是一過性的活化，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)撤除炎癥因子后間充質(zhì)干細(xì)胞的CD106很快就恢復(fù)到陰性。


圖I :胎盤組織中⑶106+細(xì)胞比例，橫坐標(biāo)為⑶106 PE的熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為SSC (側(cè)向角);圖2 :CD106+細(xì)胞形態(tài)，其呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)；圖3 :⑶106+細(xì)胞流式表型；圖4 CD106+細(xì)胞成脂和成骨分化；成脂分化用油紅0染色，成骨分化用茜素紅染色； 圖5 :⑶106+細(xì)胞和⑶106—細(xì)胞C0X2和HGF mRNA表達(dá)比較，縱坐標(biāo)分別為C0X2和HGF mRNA的相對表達(dá)量；圖6 :⑶106+細(xì)胞和⑶106_細(xì)胞PGE2和HGF表達(dá)比較，縱坐標(biāo)分別為PGE2和HGF的濃度，單位為納克/毫升(ng/ml)；圖I :⑶106+細(xì)胞抑制PHA刺激的淋巴細(xì)胞分泌IFN- y，橫坐標(biāo)為PBMC用PHA刺激組、 ⑶106陰性間充質(zhì)干細(xì)胞與PHA刺激的PBMC共培養(yǎng)組、⑶106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞與PHA刺激的PBMC共培養(yǎng)組，縱坐標(biāo)為各組相對PBMC用PHA刺激組的IFN- y表達(dá)量；圖8 :治療組和GVHD組的動(dòng)物生存曲線。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例I :胎盤來源細(xì)胞的分離和其中CD106陽性細(xì)胞的獲取及擴(kuò)增培養(yǎng)。
I.胎盤的采集，在產(chǎn)婦知情同意的情況采集胎盤。用無菌生理鹽水沖洗胎盤，然后將胎盤裝入專用的無菌采集盒中，并加入采集液。隨后將胎盤4°C運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)地點(diǎn)，胎盤不超過48小時(shí)。
2.胎盤絨毛膜組織間充質(zhì)干細(xì)胞的分離(1)用機(jī)械的方法分離出絨毛膜組織；(2)將組織剪碎至0. 1-1立方厘米，然后用磷酸鹽溶液反復(fù)沖洗組織塊5次以上，使組織塊無明顯的血凝塊及其它雜物；(3)按照與組織體積比1:1的比例加入膠原酶和胰酶的混合物，37°C恒溫消化60分鐘；(4)通過200目濾網(wǎng)獲得單細(xì)胞懸液，離心，去掉上清；(5)用 DF12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
3. 0)106陽性細(xì)胞的分選按stem cell公司EasySep 正選人PE標(biāo)記細(xì)胞的試劑盒(貨號18551)的方法進(jìn)行，先用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的⑶106抗體標(biāo)記上述細(xì)胞，再用標(biāo)記有磁珠的抗PE抗體與上述細(xì)胞孵育，按試劑盒的方法獲得CD106陽性細(xì)胞。
4.⑶106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得，將第3步獲得的細(xì)胞用含10%體積比的胎牛血清的DF12培養(yǎng)基重懸，并接種到培養(yǎng)瓶中，每3天換液一次，等細(xì)胞融合度達(dá)到80-90% 時(shí)將細(xì)胞用質(zhì)量比0. 25%胰酶消化后按1:3傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞擴(kuò)增到所需的數(shù)量后進(jìn)行凍存或使用。
5.流式細(xì)胞儀分析間充質(zhì)干細(xì)胞中CD106陽性細(xì)胞的比例及間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166)的檢測。將分離后的細(xì)胞按每個(gè)樣本2X IO5 細(xì)胞分管，按專業(yè)人士熟知的方法使用抗體標(biāo)記后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸到400 u L 裝入流式管。用BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測、分析。
6.成骨、成脂分化以4X IO4細(xì)胞/孔接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液。
成脂誘導(dǎo)體系(MDM培養(yǎng)基、10% FBS、10-6M地塞米松、0. 5 mM 3-異丁基-I-甲基黃嘌呤、10 yl/ml胰島素、60 UM吲哚美辛、2 u M/ml L-谷氨酰胺)繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄掉培養(yǎng)液，PBS洗2次，10%甲醛固定30分鐘。PBS再洗3次。 加入0.2%油紅0染液，37°C染色30分鐘。吸出染液回收，PBS洗3次。顯微鏡下觀察并照相。
成骨誘導(dǎo)體系(MDM培養(yǎng)基、10% FBS、10-7M地塞米松、0. 2 mM 2-磷酸抗壞血酸、 10 mM ￠-磷酸甘油、2 u M/ml L-谷氨酰胺和100 U/ml青霉素/鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng)。每3 天換液I次，共誘導(dǎo)14-21天。培養(yǎng)21天，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次。甲醇丙酮(I: I)室溫固定10分鐘，PBS洗3次。加入0.5%茜素紅，37°C染色30分鐘，棄染液，PBS洗3次。顯微鏡下觀察并照相。
結(jié)果我們分離的胎盤組織原代細(xì)胞中有0. 36%的⑶106陽性細(xì)胞(見圖1)，分離的CD106陽性細(xì)胞經(jīng)過貼壁培養(yǎng)，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，具有成纖維細(xì)胞形態(tài)(見圖2);通過流式檢測⑶106陽性細(xì)胞比例為94%，⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166的陽性率均在 99%以上(見圖3)。誘導(dǎo)分化鑒定所獲得CD106陽性細(xì)胞具有向成骨、成脂的分化能力(見圖4)。
實(shí)施例2 CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞的分選。
將擴(kuò)增后的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過使用專業(yè)人士都熟知的磁珠分選方法，從胎盤來源細(xì)胞分理出⑶106陽性細(xì)胞。
結(jié)果通過磁珠分選后，獲得的⑶106陽性細(xì)胞純度為97. 91%。
實(shí)施例3 :⑶106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更高的C0X2/PGE2、HGF。
將CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞與CD106陰性間充質(zhì)干細(xì)胞分別擴(kuò)增到所需數(shù)量， 吸取培養(yǎng)上清留用，再用專業(yè)人士所熟知的方法提取上述兩種細(xì)胞的mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用定量聚合酶鏈反應(yīng)(rt-PCR)比較兩種細(xì)胞C0X2和HGF的mRNA表達(dá)量。
將上步留用的培養(yǎng)上清用專業(yè)人數(shù)熟知的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測其中 PGE2和HGF的含量。
結(jié)果⑶106+間充質(zhì)干細(xì)胞比⑶106-間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更高水平的C0X2和HGF mRNA (見圖5)，⑶106+間充質(zhì)干細(xì)胞比⑶106_間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更高水平的PGE2和HGF (見圖6)。
實(shí)施例4 :⑶106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞抑制PHA刺激的淋巴細(xì)胞分泌IFN- y。
I.分別收集正常培養(yǎng)的CD106+MSC和CD106—MSC，鈷60照射后計(jì)數(shù)。用含10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮后種植于平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按IO4個(gè)/孔分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37°C、5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。
2.無菌條件下取健康成人靜脈血5ml，肝素抗凝，F(xiàn)icoll分離PBMC并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并將濃度調(diào)節(jié)為2X 106/mL。
3.將PBMC接種于前述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，與MSC進(jìn)行共培養(yǎng)。每孔中IO5個(gè)細(xì)胞， 同時(shí)加入10ug/mlPHA。
4.用RPMI 1640培養(yǎng)液將每孔體積調(diào)整為200ul，37°C、5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后收集各個(gè)組的上清，用ELISA檢測每組培養(yǎng)上清的IFN- y濃度。
結(jié)果⑶106+和⑶106—間充質(zhì)干細(xì)胞均能明顯抑制PHA刺激的淋巴細(xì)胞分泌 IFN-Y，而⑶106+間充質(zhì)干細(xì)胞的抑制效果明顯好于⑶106—間充質(zhì)干細(xì)胞(p < 0. 01)(見圖7)。
實(shí)施例5 CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠移植物抗宿主病(GVHD)。
I. BAL B/c小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型的建立I.I造模前BAL B/c小鼠用60Co y射線照射清髓小鼠以60Co y射線致死量全身輻照(照射劑量為lO.OGy)。運(yùn)輸時(shí)全部小鼠裝在無菌包裝盒中，照射前于超凈間內(nèi)將小鼠轉(zhuǎn)移到專用的小鼠鉛盒中，保證小鼠不被污染。
I. 2 C57BL/6供體小鼠骨髓細(xì)胞(BMC)的制備(每只動(dòng)物約可取4-6 X IO7BMC): 小鼠斷髓處死，置于75%酒精中浸泡5分鐘，無菌條件下取小鼠股骨、脛腓骨，反復(fù)沖洗骨髓，過濾，制成單細(xì)胞懸液；室溫IOOOrpm離心5分鐘，用無菌的PBS洗2次；以臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性率在99%以上；調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為I X 108/ml，室溫放置備用。
1.3 C57BL/6供體小鼠脾臟細(xì)胞(SC)的制備(每只動(dòng)物約可取5-20X 107SC):小鼠斷髓處死，置于75%酒精中浸泡5分鐘，無菌條件下取脾臟，置200目不銹鋼濾網(wǎng)中研磨， RPMI1640沖洗，制成單細(xì)胞懸液；室溫IOOOrpm離心5分鐘，洗2次；以臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性率在99%以上；調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為I X 108/ml，室溫放置備用。
1.4建立aGVHD模型制備好的BMC和SC懸液，以I : I混合，即BMC取0. Iml，SC 取0. 1ml，尾靜脈輸注給經(jīng)過照射的BAL B/c受體小鼠，輸注細(xì)胞量為2.0X107個(gè)/只小鼠， 總體積0. 2ml。
2. MSC 用于治療 aGVHD傳代培養(yǎng)的CD1061SC和CD10611SC，消化、計(jì)數(shù)；用含有33單位/ml低分子肝素鈣的生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為I. OX 107/ml，共I. 5ml ;按照0. Iml/只動(dòng)物的劑量，給予小鼠尾靜脈輸注；給藥時(shí)間為造模后第3天和第6給兩個(gè)治療組輸注MSC。對照GVHD組則注射同體積含有33單位/ml低分子肝素鈣的生理鹽水。
3.療效的評價(jià)采用生存率為評價(jià)指標(biāo)每天觀察并記錄各組動(dòng)物的存活狀況，用于動(dòng)物生存曲線的繪制以評價(jià)模型與治療效果。
結(jié)果小鼠aGVHD模型用⑶106+細(xì)胞和⑶106_細(xì)胞治療后的生存曲線(見圖8)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞亞群的鑒定方法，其特征是，利用技術(shù)手段鑒定表面標(biāo)志物CD106為陽性的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的鑒定方法，其特征是，所述鑒定表面標(biāo)志物CD106的技術(shù)手段是免疫學(xué)方法。
3.如權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征是，所述免疫學(xué)方法是流式細(xì)胞技術(shù)。
4.如權(quán)利要求1-3所述的鑒定方法，其特征是所述CD106陽性細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的鑒定方法，其特征是所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征是所述人間充質(zhì)干細(xì)胞的來源包括人胎盤組織及骨髓組織。
7.如權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征是所述人間充質(zhì)干細(xì)胞的來源為人胎盤組織。
8.如權(quán)利要求1-3、5-7所述的鑒定方法，用于鑒定分離相對于天然狀態(tài)下的間充質(zhì)干細(xì)胞具備更強(qiáng)免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群。
9.一種CD106陽性細(xì)胞的制備方法，其特征是采用技術(shù)手段將利用權(quán)利要求1-3、5-7 所述鑒定方法鑒定的CD106陽性細(xì)胞亞群由天然組織中分離。
10.如權(quán)利要求4所述的分離方法，其特征是所述技術(shù)手段為免疫學(xué)方法。
11.如權(quán)利要求5所述的分離方法，其特征是所述免疫學(xué)方法包括流式細(xì)胞儀分選、免疫磁珠分離。
12.—種CD106陽性細(xì)胞，其特征是由權(quán)利要求9所述的制備方法制備的。
13.如權(quán)利要求12所述的⑶106陽性細(xì)胞，其特征是表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記還包括⑶29、 CD44、CD73、CD90、CD105、CD166。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的CD106陽性細(xì)胞，其特征是所述CD106陽性細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，具有成骨、成脂分化能力。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的CD106陽性細(xì)胞，其特征是所述CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞與CD106陰性間充質(zhì)干細(xì)胞相比，表達(dá)更高的前列腺素E2 (PGE2)和HGF，具有更強(qiáng)的免疫抑制作用和促血管新生功能。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15所述的CD106陽性細(xì)胞，其在人體骨髓細(xì)胞中的數(shù)量可以反映體內(nèi)免疫調(diào)控水平的高低。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-15所述的CD106陽性細(xì)胞，可以用于制備治療GVHD和自身免疫系統(tǒng)疾病的藥物。
18.一種分離人間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的方法，包括以下步驟從組織原代分離出的單個(gè)核細(xì)胞分離出CD106陽性細(xì)胞，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的⑶106陽性細(xì)胞；或?qū)慕M織原代分離出的單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的間充質(zhì)細(xì)胞，在獲得足夠的細(xì)胞時(shí)，再分離出其中CD106陽性細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種CD106陽性間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定、制備方法及其應(yīng)用。通過免疫學(xué)的手段從骨髓或胎盤等組織分離出的單個(gè)核細(xì)胞鑒定并分離出CD106陽性細(xì)胞，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的CD106陽性細(xì)胞；或?qū)⒐撬杌蛱ケP等組織分離出的單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)操作，獲取貼壁的間充質(zhì)細(xì)胞，在獲得足夠的細(xì)胞時(shí)，再分離出其中CD106陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞。這些CD106陽性為間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁生長，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)免疫表型，具有成骨、成脂等分化能力。與CD106陰性間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的免疫抑制能力，可以更好的抑制淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ，可以用于GVHD和自身免疫系統(tǒng)疾病的治療。
文檔編號G01N33/53GK102539736SQ20111042254
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者韓忠朝 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司