巨細(xì)胞病毒(cmv)的基因變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及CMV基因變體，所述基因變體缺失CMV的IE區(qū)域的內(nèi)含子2(CMV?IEΔi2)。本發(fā)明也涉及這種基因變體以及從其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和從所述RNA剪接變體表達(dá)的蛋白的多種應(yīng)用，例如用于診斷CMV相關(guān)癌癥疾病，和鑒定個(gè)體患癌的風(fēng)險(xiǎn)或隨著人樣品轉(zhuǎn)移CMV?IEΔi2病毒的風(fēng)險(xiǎn)，并且就免疫治療和疫苗接種而言通過靶向獨(dú)特CMV?IE蛋白進(jìn)行預(yù)防和治療。
【專利說明】巨細(xì)胞病毒(CMV)的基因變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新的巨細(xì)胞病毒(CMV)基因變體，例如顯示在癌癥疾病患者中出現(xiàn)的基因變體。因此，本發(fā)明涉及癌癥診斷方法的領(lǐng)域，更特定涉及出現(xiàn)巨細(xì)胞病毒(CMV)感染的癌癥形式。本發(fā)明特別關(guān)注診斷成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、皮膚癌和胰腺癌，并且也適用于其他癌癥形式。
發(fā)明背景
[0002]巨細(xì)胞病毒(CMV)是感染世界上大部分人口的常見病毒；60-100%的成年群體經(jīng)歷過這種感染，并且是所述病毒的載體。在初次感染后，CMV形成潛伏狀態(tài)并有持久性，并且大部分感染是亞臨床的。在健康載體中，優(yōu)先發(fā)現(xiàn)所述病毒是骨髓譜系細(xì)胞中的潛伏病毒，并且病毒的重新活化依賴于細(xì)胞分化為成熟巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞，所述分化通常由炎癥造成。直到20世紀(jì)70年代，僅認(rèn)為嚴(yán)重的先天性感染病例代表所述病毒引起的人類疾病。隨著社會(huì)中免疫抑制個(gè)體(例如AIDS患者和移植患者)的增加，CMV的重新活化成為在這些患者中造成高發(fā)病率和死亡率的主要臨床問題。因此,在過去的幾十年中，CMV的重要`性和感興趣程度增加，因?yàn)镃MV疾病在這組患者中常見，并且可能危及生命。所述病毒通過炎癥重新活化，并且越來越多的證據(jù)表明了所述病毒頻繁地出現(xiàn)在炎癥疾病患者的組織樣品中。近來，越來越多的證據(jù)也提示了不同來源的癌癥中存在活性CMV感染。我們定義了癌癥中新的CMV基因變體，并且顯示了新的患癌機(jī)理。
[0003]CMV感染和癌癥
[0004]近期報(bào)導(dǎo)揭示了在某些惡性腫瘤中頻繁出現(xiàn)CMV的基因組和蛋白，所述惡性腫瘤例如結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤(1-7)、髓母細(xì)胞瘤(8)、EBV陰性霍奇金淋巴瘤、宮頸癌、前列腺癌和乳腺癌(綜述參見(9，10))。我們證明了在99%惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、>90%髓母細(xì)胞瘤(MB)和神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)、惡性黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、卵巢癌和宮頸癌中存在活性CMV感染(1，8)。重要地是，所述病毒感染在從相同患者獲得的非癌癥組織樣品中和健康對照個(gè)體中保持潛伏(1，3)。
[0005]CMV 和癌癥調(diào)節(jié)(oncomodulation):
[0006]在20世紀(jì)70年代，F(xiàn)red Rapp小組已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在前列腺癌中頻繁出現(xiàn)CMV，并且從動(dòng)物模型致癌腫瘤中分離出病毒株(11，12)。在數(shù)個(gè)稍后的研究中，CMV不能轉(zhuǎn)化正常人體細(xì)胞，所以并不認(rèn)為這種病毒是致癌的。相反，提出了術(shù)語癌癥調(diào)節(jié)來描述CMV對由數(shù)種特定影響宿主細(xì)胞功能的病毒蛋白所介導(dǎo)腫瘤發(fā)生的間接影響(綜述參見(13，14))。進(jìn)化中，CMV發(fā)展出了影響很多不同細(xì)胞和免疫功能的復(fù)雜機(jī)理(15，16)。所述病毒在感染細(xì)胞中生成約170種蛋白，其中大約僅有50種對病毒生成是必需的(17)。因此，絕大部分病毒蛋白用于控制幫助病毒與其宿主共同生存的重要宿主功能。這些蛋白可以通過控制宿主功能對癌癥發(fā)展起作用，并且通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，受病毒感染的腫瘤細(xì)胞會(huì)受到保護(hù)避免被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)(15)。可能涉及癌癥發(fā)病的CMV機(jī)理稱為癌癥調(diào)節(jié)(oncomodulatory)機(jī)理(10， 13)。[0007]癌癥調(diào)節(jié)定義為在腫瘤細(xì)胞提供的合適遺傳環(huán)境中提高癌癥發(fā)生過程的能力，所述癌癥發(fā)生過程表征為破壞細(xì)胞內(nèi)信號通路、轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白。CMV能阻滯細(xì)胞分化、干擾癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)特異染色體斷裂、抑制DNA修復(fù)機(jī)制、控制重要的表觀遺傳功能、控制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管新生和細(xì)胞遷移，這些都提供了癌癥調(diào)節(jié)機(jī)理(10，13)。較新的數(shù)據(jù)也提示了這種病毒可以是致癌的；一項(xiàng)研究顯示了事實(shí)上，CMV蛋白US28的表達(dá)通過誘導(dǎo)的C0X-2表達(dá)和VEGF生成造成自身造成鼠模型中的腫瘤發(fā)育(18，19)。祀向轉(zhuǎn)基因小鼠腸上皮的US28的表達(dá)造成了腸增生、腺瘤(adenoma)和腺癌(adenocarcinoma) (20)。與Smits小組合作,我們近期顯示了 US28也引起STAT3磷酸化，生成IL-6并產(chǎn)生增殖表型。例如,成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中STAT3的磷酸化與成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的存活相關(guān)(6)。我們近期也發(fā)現(xiàn)了 CMV蛋白IE72通過與啟動(dòng)子中SP-1結(jié)合位點(diǎn)的相互作用來誘導(dǎo)高端粒酶活性(7)。誘導(dǎo)端粒酶活性是致癌病毒的常見現(xiàn)象。有趣地是，我們發(fā)現(xiàn)了 GBM腫瘤中僅僅CMV感染的細(xì)胞顯示了增加的hTERT表達(dá)(7)。我們近期發(fā)現(xiàn)了 CMV感染水平與成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者存活延長相關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步證明CMV感染在癌癥中的重要作用
`(I)。再者，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中CMV感染的水平是患者存活的較強(qiáng)預(yù)后因子。診斷中腫瘤低級CMV感染(定義為少于25%病毒陽性細(xì)胞)的患者存活時(shí)間比高級感染患者長2.5倍(21)。體外，更昔洛韋治療抑制腫瘤生長達(dá)80-95%，并且動(dòng)物模型顯示了使用靶向病毒復(fù)制的藥物使腫瘤生長抑制40-75% (8，22)。
[0008]CMV逃避免疫系統(tǒng)的檢測CMV發(fā)展出設(shè)計(jì)成避免被免疫系統(tǒng)識(shí)別的復(fù)雜機(jī)理。例如，CMV抑制I類和II類HLA分子的表達(dá)和抗原呈遞，其控制T細(xì)胞活化、抑制NK細(xì)胞活化、保護(hù)細(xì)胞免受從活化T和NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞溶解肽影響(16，23)。CMV也自身生成，并且控制細(xì)胞生成趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子(15)。這些是使免疫系統(tǒng)不能識(shí)別感染細(xì)胞的策略示例，并且可以解釋為什么CMV感染腫瘤不受免疫系統(tǒng)或針對其開發(fā)的免疫治療的控制。因此免疫系統(tǒng)不能識(shí)別感染的腫瘤細(xì)胞(綜述參見(16，23)，同時(shí)所述病毒依賴于炎癥(24)。我們小組第一次鑒定了骨髓譜系細(xì)胞是潛伏病毒的主要循環(huán)載體(24)，并且T細(xì)胞的免疫活化和后續(xù)生成TNF- a和IFN- y (造成巨噬細(xì)胞分化)是潛伏CMV重新活化的關(guān)鍵因素(24，25)。病毒感染也誘導(dǎo)C0X-2(18，26-28)，并且我們近期發(fā)現(xiàn)了所述病毒也誘導(dǎo)5-L0表達(dá)(29)以誘導(dǎo)炎癥和增強(qiáng)病毒復(fù)制，所述表達(dá)在腫瘤生物學(xué)中有高相關(guān)性。
[0009]CMV基因產(chǎn)物賦予化療抗性
[0010]細(xì)胞凋亡，或程序性細(xì)胞死亡是NK細(xì)胞和細(xì)胞凋亡T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷機(jī)制的最后步驟。腫瘤細(xì)胞對藥物誘導(dǎo)死亡的靈敏度減弱是抗癌癥治療失敗的主要原因。至少五種不同的CMV蛋白(即IE1、IE2、UL36和UL37、UL38)抑制細(xì)胞凋亡，并且可以增強(qiáng)CMV感染腫瘤細(xì)胞的存活。這些蛋白也可以防止所需的化療作用。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中UL36的表達(dá)賦予化療抗性(30)，支持了這種假說。
[0011]癌癥中CMV致密體的關(guān)鍵作用
[0012]越來越多的數(shù)據(jù)顯示了不同來源的癌癥中頻繁檢測出CMV蛋白。>90的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌、胰腺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、宮頸癌顯示了腫瘤細(xì)胞中的高CMV蛋白表達(dá)，但是腫瘤周圍的非腫瘤組織中都是病毒陰性。我們也檢測了患者活檢，并且發(fā)現(xiàn)它們就CMV蛋白表達(dá)而言都為高陽性。CMV蛋白在腫瘤中廣泛表達(dá)，并且CMV RNA轉(zhuǎn)錄物容易檢測，但與此形成鮮明對比的是，相同組織樣品中難于檢測CMV DNA。這是一個(gè)迷惑了本領(lǐng)域諸多研究員的有爭議的議題，并且這是否是人為假象(artefact)也引起了關(guān)注。
[0013]因此，本領(lǐng)域長期需要揭示CMV感染策略和其如何影響如癌癥的開始或進(jìn)展，并對其進(jìn)行廣泛研究。這歸因于以下事實(shí):這種揭示可以發(fā)現(xiàn)能更早治療所需患者的潛在診斷方法以及可能的新治療處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明人現(xiàn)在通過定義新的巨細(xì)胞病毒(CMV)基因變體解決了本文提出的問題，所述基因變體顯示缺失快速早期基因(IE) CMV基因組的內(nèi)含子2 (SEQ ID NO: 17)，所述基因變體命名為CMV IEAi2。本發(fā)明也涉及方法和應(yīng)用，所述方法和應(yīng)用包含發(fā)現(xiàn)的名為CMVIEA i2的新CMV基因變體，表示通過缺失主要快速早期基因中內(nèi)含子2 (SEQ ID NO: 17)的野生型CMV和/或新病毒株的變體，以及從所述基因變體轉(zhuǎn)錄的剪接變體和基因變體翻譯的蛋白。所述方法應(yīng)用于診斷例如癌癥傾向和已經(jīng)發(fā)展的癌癥疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:通過免疫組織化`學(xué)檢測人巨細(xì)胞病毒(CMV)蛋白。在獲自GBM(多形性成膠`質(zhì)細(xì)胞瘤)患者(A)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB(B)、髓母細(xì)胞瘤MB(C)和結(jié)腸癌組織(G)以及乳腺癌組織(H)的腦腫瘤組織中檢測到CMV立即早期抗原(CMV-1EA)。針對平滑肌細(xì)胞a肌動(dòng)蛋白的抗體(D，E，F(xiàn))和針對角蛋白20(1)和細(xì)胞角蛋白(J)的抗體用作對照。非特異條=50 u m0
[0016]圖2:乳腺癌樣品中人巨細(xì)胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫組化染色。CK表示腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白染色作為陽性或染色對照，陰性(Neg)對照表示同種型對照抗體。照片顯示了 CMV的限制性表達(dá)，即腫瘤細(xì)胞中的CMV蛋白。
[0017]圖3:淋巴結(jié)中乳腺癌腫瘤淋巴結(jié)大量轉(zhuǎn)移的人巨細(xì)胞病毒立即早期(CMVIE)和晚期(LA)蛋白的免疫組化染色。CK表示腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白染色作為陽性(即染色對照)，陰性對照表示同種型對照抗體。照片顯示了 CMV蛋白在腫瘤細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)移中的限制性表達(dá)。
[0018]圖4:就人巨細(xì)胞病毒立即早期抗原(CMV IEA)和pp65而言細(xì)胞系(髓母細(xì)胞瘤D283)的流式細(xì)胞術(shù)染色。在不同來源的腫瘤細(xì)胞系中經(jīng)常檢測到不同蛋白表達(dá)水平的CMV蛋白表達(dá)(n=40;CMV陽性細(xì)胞在0.5-69%之間變化，并且在相同細(xì)胞系的不同取樣時(shí)間也不同)。
[0019]圖5:野生型中人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期(IE)基因和CMV IE基因區(qū)域PCR所用不同引物定位的示意圖。在CMV IEA i2中，內(nèi)含子2缺失，這通過使用主要立即早期(MIE)外引物和MIE內(nèi)引物對的巢式PCR或者使用僅允許缺失變體生成陽性信號的跨越外顯子2和3的探針的Taqman PCR確證。
[0020]圖6:巢式PCR在癌癥患者中擴(kuò)增218bp的PCR DNA片段；大小與實(shí)驗(yàn)室巨細(xì)胞病毒株(CMV)感染細(xì)胞的RNA樣品的cDNA相似(C3)，而相同培養(yǎng)的DNA制品擴(kuò)增332bp的PCR片段(C2)。從健康供體(HD)和有感染性單核細(xì)胞增多癥(MN)的病毒血癥(viremic)患者中擴(kuò)增野生型DNA片段。HD:健康供體，CC:結(jié)腸癌，NTC:無模板對照，NB:神經(jīng)母細(xì)胞瘤，BrC ;乳腺癌，OvC:卵巢癌，Cl:未感染的成纖維細(xì)胞，C2 =CMV感染的成纖維細(xì)胞的DNA，C3 =CMV感染的成纖維細(xì)胞的cDNA。
[0021]圖7:顯示載有CMV IE A i2變體的癌癥患者(A)或健康供體野生型變體(B)中內(nèi)含子2缺失的色譜圖。圖顯示了載有CMV IE A i2變體的癌癥患者中內(nèi)含子2缺失位點(diǎn)(A)(序列:GTG GCC TTG GTC ACG GGT GTC TCG GCC GTG GCA CCT TGG AGG AAG GGC CCT)或健康供體野生型變體中內(nèi)含子2缺失位點(diǎn)(B)(序列:ACG TCG TGG CCT TGG ACA CGG GTGTCT CGG CCT AAA CAC ATT AGA AAT AG)。 [0022]圖8:A和B)測序PCR產(chǎn)物的比對顯示了在不同來源癌癥中發(fā)現(xiàn)的人巨細(xì)胞病毒(CMV) IE A 12株的內(nèi)含子2缺失。指示了外顯子2和外顯子3，以及用于巢式PCR的引物定位。在例如乳腺癌、結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了 CMVIE A i2，但是病毒血癥患者或健康對照載野生型CMV株。
[0023]圖9:常用于實(shí)驗(yàn)室研究的三種不同病毒株的巢式PCR ;VR1814、TB40、AD169擴(kuò)增332bp的野生型片段。樣品從病毒儲(chǔ)液或感染細(xì)胞中制備。NTC:陰性對照，C2:感染細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增218bp片段。
[0024]圖10:巢式PCR從動(dòng)脈粥樣硬化患者和感染性單核細(xì)胞增多癥患者(MN)的血清樣品中擴(kuò)增318bp的野生型DNA片段。C2 =CMV野生型感染細(xì)胞的cDNA樣品也顯示了野生型DNA條帶(所述樣品沒有經(jīng)DNA酶處理)，這在相同細(xì)胞的DNA制品中可以觀察到(C3)。
[0025]圖11:健康血液供體中的DNA擴(kuò)增。C2:DNA野生型(wt) CMV的陽性對照。在12_13%的檢測對照中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有CMV IE A 12株的個(gè)體(22)。
[0026]圖12:A和B)GBM RNA轉(zhuǎn)錄物的序列比對，所述轉(zhuǎn)錄物如來自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)物(從3個(gè)不同燒瓶中收集)的CMV DNA，顯示了快速早期(IE)基因中內(nèi)含子2缺失。IE1、IE9、IE17.5和IE19的編碼序列與外顯子2和外顯子3的Merlin參照序列(基因庫AY446894.2) 一起顯示。
[0027]圖13:使用人巨細(xì)胞病毒(CMV)單克隆抗體(克隆810R)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)原發(fā)性腫瘤的Western印跡分析。CMV蛋白立即早期(IE)55、IE72和IE86并不豐富；僅一個(gè)樣品顯示了 IE55(NB7)。相反，新蛋白重新表達(dá)的大小是38、31、20和lOkDa。圖14顯示陽性對照。
[0028]圖14:使用人巨細(xì)胞病毒(CMV)單克隆抗體(克隆810)對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)性腫瘤的Western印跡分析。CMV蛋白立即早期IE55、IE72和IE86并不豐富；僅兩個(gè)樣品顯示了 IE72(42，50)。相反，表達(dá)的新蛋白的大致分子量是50、53、28、24、19和lOkDa。陰性對照是未感染的成纖維細(xì)胞MRC-5 ;陽性對照在感染后15天感染的MRC-5。
[0029]圖15:使用針對IE86的人巨細(xì)胞病毒(CMV)肽抗體對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的Western印跡分析。兩次曝光以顯示有野生型CMV株VR1814的病毒感染細(xì)胞的陽性對照。在原代培養(yǎng)中CMV蛋白IE55和IE86以及40kDa和20kDa蛋白非常豐富，而缺失在原發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)的數(shù)種獨(dú)特蛋白。僅有兩個(gè)樣品表達(dá)50、53kDa蛋白(30，46)，三個(gè)樣品表達(dá)28kDa蛋白(42，47，48)。相反，新蛋白重新表達(dá)的大小是50、53、28、
24、19 和 IOkDa0
[0030]圖16:使用包含細(xì)菌人工染色體(BAC)載體中人巨細(xì)胞病毒(CMV)全基因組的CMV探針的熒光原位雜交(FISH)分析。A)感染7天后CMV野生型感染細(xì)胞(AD169)。B)CMV野生型病毒的健康載體。C)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的印跡顯示了 CMV基因組的外周定位，有時(shí)擴(kuò)增為如D)另一個(gè)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者所示。CMV基因組的外周定位模式在載有癌細(xì)胞CMVIE A i2株的癌癥患者中極不同，并且可重復(fù)(n=40; 100%)。[0031]圖17:A)使用包含細(xì)菌人工染色體(BAC)載體中人巨細(xì)胞病毒(CMV)全基因組的CMV探針的熒光原位雜交(FISH)分析顯示了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者腫瘤細(xì)胞中CMV基因組整合入染色體17。表示染色體17的兩個(gè)染色單體上所存在CMV DNA的兩個(gè)小點(diǎn)在更高放大倍數(shù)下可見⑶。
[0032]圖18:A)GBM患者中發(fā)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄物的序列比對。已知來自Awasthi等J Virol,2004年8月，第8191-8200頁(31)的剪接變體的示意圖。來自發(fā)表雜志(Awasthi等，JVirol，2004年8月，第8191-8200頁(31)，顯示IEl和IE2的氨基酸比對和剪接變體)的立即早期(IE)19、IE17.5和IE9的序列比對。B)附圖顯示來自IE基因的外顯子2、3、4和5的多個(gè)剪接變體。
[0033]發(fā)明詳述
[0034]定義
[0035]本文所述“內(nèi)含子”是基因中通過RNA剪接除去以生成基因最終成熟RNA產(chǎn)物的任意核苷酸序列。術(shù)語內(nèi)含子指基因中的DNA序列，但是在有內(nèi)含子的基因轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物相應(yīng)序列中除去。
[0036]本文所述“外顯子”指轉(zhuǎn)錄成信使RNA的蛋白合成信息編碼DNA的核酸序列。
[0037]本文定義的“CMV IEAi2”也稱為“CMVIEAint2”，指作為CMV獨(dú)立株的CMV基因變體，對應(yīng)圖5中所示CMV IE基因組的核酸序列，但是其中稱為立即早期區(qū)域的內(nèi)含子2對應(yīng)部分(IE的內(nèi)含子2示于SEQ ID NO: 17)DNA中缺失、缺少或刪除，如圖6、7和8所示。所述野生型CMV株參照基因庫(AY446894.2 Merlin)，在包含IE基因的堿基對位點(diǎn)170689-176186有立即早期基因，如圖5中是參照基因，和圖8缺失內(nèi)含子2的CMV IEAi2。因此，所述基因變體還表征為所述基因變體缺失Merlin參照序列AY446894.2 (野生型CMV)的位點(diǎn)173903到位點(diǎn)174019的核酸序列。
[0038]“立即早期”(IE)基因是在急性感染和響應(yīng)廣泛細(xì)胞刺激中短暫和快速活化的基因。這表示感染中CMV基因組轉(zhuǎn)錄的第一組基因，隨后是其控制轉(zhuǎn)錄的早期和晚期基因。IE基因表示在任何新蛋白合成前，對刺激的第一輪響應(yīng)中于轉(zhuǎn)錄水平活化的有效反應(yīng)機(jī)理。定位在CMV基因組的病毒長獨(dú)特(Unique long) (UL)基因片段上的主要立即早期基因UL123/122，指位于野生型CMV Merlin株(基因庫AY446894.2)的堿基對位點(diǎn)170689-176186的區(qū)域。主要立即早期基因在主要立即早期(MIE)啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄，生成編碼數(shù)個(gè)IE蛋白(IEl或IE72、IE2或IE82-86、IE86、IE2-55或IE55)的正義RNA轉(zhuǎn)錄物。這些蛋白共有外顯子2和外顯子3，并且因此有相同的蛋白N末端。除了這些主要IE蛋白，其他IE蛋白通過翻譯修飾的mRNA分子轉(zhuǎn)錄物生成(見下)。
[0039]本文所述巨細(xì)胞病毒(CMV) “基因變體”指僅缺失內(nèi)含子2的CMV變體或新的CMV病毒株，新的CMV病毒株與其他CMV株相比是變體，其中通常稱為CMV基因組的立即早期區(qū)域(見圖5)已改變并且不包含區(qū)域內(nèi)含子2(見圖6、7和8)。因此，所述變體是“基因改變“或“遺傳改變”，因?yàn)樽凅w已經(jīng)在CMV病毒的DNA水平發(fā)生，并且因此在這個(gè)基因變體的CMV蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯后的事件(下文進(jìn)一步解釋)中擴(kuò)大。SEQ ID NO:1核酸序列定義了本文定義的以及與野生型CMV相比的基因變體的DNA區(qū)域特征。這個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)野生型CMV的外顯子2和3，由于內(nèi)含子2缺失，其直接連接到野生型CMV基因變體的DNA上。如果CMV病毒有這種修飾區(qū)域，其能用于鑒定這種CMV病毒是野生型CMV的基因變體。這能使用PCR方法或本文進(jìn)一步定義的方法進(jìn)行。
[0040]“剪接變體”由有時(shí)稱為可變剪接(或差異剪接)的過程生成，通過所述過程由基因轉(zhuǎn)錄(初級基因轉(zhuǎn)錄物或前mRNA)生成的RNA外顯子(例如本文中的基因變體CMVIEA i2)在RNA剪接中以多種方式重新連接。在分子生物學(xué)中，“RNA剪接”是轉(zhuǎn)錄后對RNA的修飾，其中移除內(nèi)含子并連接外顯子。這對于典型真核細(xì)胞信使RNA(mRNA)而言，在其能用于通過翻譯生成正確蛋白之前是必需的。對很多真核內(nèi)含子而言，由剪接體(小核核糖核蛋白(snRNP)復(fù)合物)催化的一系列反應(yīng)完成剪接，但是也有自我剪接的內(nèi)含子。
[0041]所得的不同mRNA可以翻譯成不同的蛋白同種型，并且都由野生型CMV感染的5’末端轉(zhuǎn)錄生成。在主要IE基因中，已知6個(gè)已知的剪接變體生成變體IE蛋白，例如包含外顯子2和外顯子3 (見圖5和8) ；IE9 (AY445661.1 ;外顯子2和3和外顯子4的2個(gè)氨基酸；預(yù)測是10kD，但在感染細(xì)胞中不能觀察到的蛋白)、IE19(AY436380.1 ;外顯子2，3和外顯子4的片段，生成38kD蛋白)、IE17.5 (AY445660.1 ;外顯子2，3和外顯子4的小片段，共有IE19，生成31kDa蛋白)、IE18(SEQ ID NO: 2 ;外顯子2，3和5，生成18kDa蛋白)。兩個(gè)IE 蛋白從外顯子 5 生成；IE40 (SEQ ID NO: 3; 40kDa 蛋白)和 IE60 (SEQ ID N0:4;60kDa 蛋白)。因此，單個(gè)基因可以編碼多個(gè)蛋白。因而，本文不同的“剪接變體”通過基因變體CMVIE Δ i2轉(zhuǎn)錄中發(fā)生的不同剪接事件生成，以生成新的IE RNA轉(zhuǎn)錄物和IE蛋白。
[0042]因此，本發(fā)明涉及巨細(xì)胞病毒(CMV)的基因變體，本文稱為CMV IEΔi2或CMVIE Δ int2，所述基因變體缺失CMV基因組的IE基因的內(nèi)含子2。所述CMV基因變體顯示在遭受癌癥疾病的患者中有高流javascript:addCharactor('%CE%94');行性，這在下文進(jìn)一步說明。
[0043]發(fā)現(xiàn)CMV IE Δ 12在有不同癌癥形式的患者中有高流行性(72/86，84%)，而在病毒血癥患者(1/19，10%)和健康群體(15/100 ;2010年測試的15%，1995年測試的0/285)中檢測出的頻率較低(32)。有這種CMV基因變體感染的腫瘤細(xì)胞表達(dá)RNA剪接變體和新的CMVIE蛋白，進(jìn)一步幫助癌癥的建立和發(fā)展。這種新的CMV株檢測為活性病毒感染，在不同組織/器官的腫瘤細(xì)胞中生成病毒蛋白，而腫瘤周邊的非腫瘤組織仍保持CMV蛋白陰性。
[0044]所述CMV IEA i2分離自100個(gè)臨床分離物中的3個(gè)。在全部三個(gè)示例中，所述CMV IE Δ 12病毒用野生型CMV病毒分離，并且似乎有更低的生長速率和更低的復(fù)制效率。
[0045]目前還不知道CMV IE i2株的載體對癌癥或CMV陽性腫瘤發(fā)展的終身風(fēng)險(xiǎn)是什么，僅有84%載有CMVIE Δ i2株。因此，還不知道10-15%感染有CMV IE Δ i2株的個(gè)體中有多少會(huì)患癌，但出于多種原因仍需要鑒定這種CMV IEΔ12株的載體，這在下文會(huì)進(jìn)一步說明。
[0046]目前還不知道基因變體CMV IE Δ i2的轉(zhuǎn)錄是怎樣調(diào)節(jié)的。在腫瘤組織樣品中，存在CMV IE Δ 12與剪接CMV變體IE蛋白的高表達(dá)相關(guān)聯(lián)。
[0047]因此，本發(fā)明的一方面中，可以檢測哺乳動(dòng)物癌癥的傾向和/或診斷癌癥形式，所述檢測和/或診斷通過鑒定CMV Δ IEi2株的載體，例如通過檢索SEQ ID NO:1中公開的變體鑒定標(biāo)記，和使用多種常用技術(shù)。這種信息能用于避免通過生物樣品在個(gè)體之間轉(zhuǎn)移CMVΔIE12株，所述生物樣品例如通過血液捐贈(zèng)、器官和干細(xì)胞移植以及哺乳。[0048]約70%的成年群體是巨細(xì)胞病毒(CMV)的載體。近期在>90%不同來源的腫瘤中發(fā)現(xiàn)CMV蛋白和核酸，所述腫瘤包含成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌。越來越多的證據(jù)提示許多CMV蛋白是致癌或癌癥調(diào)節(jié)性的，但是僅有少數(shù)CMV載體患癌。在84%腫瘤患者、原發(fā)性腫瘤培養(yǎng)物(89%)或細(xì)胞系中檢測到至今未知的CMV病毒株，而僅在0-15%健康血液供體和10%CMV病毒血癥患者中發(fā)現(xiàn)此病毒株。所述病毒株通過在CMV基因組立即早期區(qū)域中缺失內(nèi)含子2來鑒定。剪接RNA變體和獨(dú)特(unique)病毒蛋白在腫瘤細(xì)胞中通過CMV IE A i2株生成。CMV IE A i2株在個(gè)體中引起癌癥的致癌能力外顯率仍然有待揭示。經(jīng)血液輸入擴(kuò)散這種病毒能通過所述方法防止，以測定哺乳動(dòng)物中存在這種CMV株，如本發(fā)明所示例。
[0049]本發(fā)明公開了確切證據(jù)，顯示腫瘤中CMV感染描述了與不同癌癥形式高度有關(guān)的新CMV變體(CMV IEAi2)。有這種CMV變體的癌細(xì)胞感染表示新的感染實(shí)體，從癌癥干細(xì)胞中生成缺陷性顆?！爸旅荏w”，因而提出了癌癥診斷和發(fā)展的新模型。作為支持，揭示了新的CMV遺傳變體，在CMV基因組的主要立即早期區(qū)域中恒定缺失內(nèi)含子2。
[0050]在原發(fā)性腫瘤、原發(fā)性腫瘤培養(yǎng)物和細(xì)胞系中，CMV感染的腫瘤細(xì)胞生成新RNA轉(zhuǎn)錄物和CMV IE蛋白。RNA轉(zhuǎn)錄物和蛋白通過致密體或外來體(exosome)從CMV DNA陽性細(xì)胞遞送到周圍細(xì)胞，在不復(fù)制病毒的細(xì)胞中引起CMV蛋白表達(dá)，從而使得細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因?yàn)槠洳唤?jīng)歷裂解感染。 [0051]不受特定理論的限制，患腫瘤的組織/器官可能依賴于載有CMV A IEi2株的潛伏感染細(xì)胞向組織的募集和病毒再活化，通過主要遞送缺陷性病毒顆粒(即致密體或外來體)中的CMV蛋白和RNA造成靶標(biāo)組織中細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)移和癌癥發(fā)展。由于炎癥是潛伏CMV重新活化的驅(qū)動(dòng)力，癌癥開始的起始步驟可能依賴于炎癥這一熟知的癌癥風(fēng)險(xiǎn)因子。當(dāng)活化時(shí)，所述CMV IE A i2會(huì)從CMV IE區(qū)域生成新的RNA轉(zhuǎn)錄物(正義和反義RNA，如圖12中由CMV 1￡八12生成所述)。在CMV致密體中的細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移IE蛋白，是很多癌癥形式的主要原因。
[0052]CMV IEA i2株在已建立癌中如此普遍的事實(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)了其潛在高度惡性潛能的猜疑。變體CMV株(CMV IEA12)的檢測因而可以在輸入血液或干細(xì)胞移植物、在器官移植前進(jìn)行，以避免貌似致癌CMV株的轉(zhuǎn)移，和避免在患者生命晚期發(fā)展疾病。這可以如本發(fā)明所示方面來進(jìn)行。
[0053]再者，多于90%CMV血清陽性哺乳母親在其乳汁中有重新活化的潛伏CMV，并且一歲孩童中CMV的流行性是30-40%，主要?dú)w因于通過乳汁的病毒轉(zhuǎn)移。因此，哺乳期母親會(huì)選擇測試其是否是CMV IE A 12株的載體，以避免哺乳和把貌似致癌CMV株轉(zhuǎn)移給其小孩，并且因而降低未來患癌的風(fēng)險(xiǎn)。所述測試方法也應(yīng)用于可以包含病毒的新鮮和存儲(chǔ)精液，以避免通過精子注射轉(zhuǎn)移病毒。因而，本發(fā)明也涉及從哺乳母親獲得的生物樣品中鑒定和/或檢測本文所述基因變體的方法。
[0054]人樣品中存在CMV IE A i2(組織，或體液如血液、血清、血漿、乳汁、精液、尿液和唾液，或干細(xì)胞樣品)用特異檢測立即早期基因缺失內(nèi)含子2的PCR技術(shù)來診斷，并且新蛋白使用Western印跡或ELISA方法檢測。本文公開了本發(fā)明所包含并且在材料和方法部分詳述的三個(gè)診斷PCR方法示例，顯示了從獲自有不同常見癌癥形式的患者生物樣品的野生型CMV株中檢測CMV IE A i2株的可行性。[0055]使用不同CMV特異抗體通過Western印跡檢測腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中由CMVIEA i2株生成的新蛋白。
[0056]使用這些蛋白特異抗體的ELISA用于匹配蛋白，以進(jìn)一步在夾心ELISA設(shè)置中檢測。因此，這可以用于本發(fā)明的某些方面。另外，從5’末端或3’末端轉(zhuǎn)錄的新型正義和反義轉(zhuǎn)錄物蛋白分別用于ELISA以檢測針這些獨(dú)特蛋白生成的抗體，篩選其在血清或血漿中的存在以定義CMV IEA i2株的載體，并且用作疾病的生物標(biāo)記。在本發(fā)明的其他方面，靜脈內(nèi)免疫球蛋白中CMV的抗體或?qū)MV IE A 12株所生成致密體包膜中存在的CMV蛋白特異的單克隆或多克隆抗體用于在人樣品(如血清或血漿)中富集這些顆粒，以檢測CMV IE A i2株的活性形式。PCR、Western印跡或ELISA技術(shù)用于確證核酸或新蛋白的存在。
[0057]因此，一方面，本發(fā)明涉及巨細(xì)胞病毒(CMV)的基因變體，所述基因變體表征為CMV基因組的立即早期(IE)基因缺失內(nèi)含子2 (CMV IEAi2), IE的內(nèi)含子2序列示于SEQID NO: 17。所述基因變體能因此進(jìn)一步表征為缺失SEQ ID NO: 17核酸，即Merlin參照序列AY446894.2的位點(diǎn)173903到位點(diǎn)174019的核酸序列。其中相較野生型株，所述基因變體CMV IE A i2中去除或刪除所述序列(SEQ ID NO: 17)，在所述基因組的區(qū)域，如SEQ ID NO:1特定所示生成DNA序列，即其中由于缺失內(nèi)含子2，外顯子2和3鄰接。
[0058]SEQ ID NO:1通過使用SEQ ID NO: 7和8特定所示引物生成，并且用于擴(kuò)增CMVDNA0 引物位置是 Merlin 序列 AY446894.2 的位點(diǎn) 173741 — 174073。
[0059]本文其他方面中，包含本文所定義基因變體轉(zhuǎn)錄獲得的RNA剪接變體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及基因變體CMV IE Ai2轉(zhuǎn)錄獲得的RNA剪接變體。一方面，所述RNA剪接變體由CMV IE基因的外顯子2和3，和/或其部分組成。[0060]本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，包含外顯子一個(gè)或多個(gè)部分的RNA剪接變體指RNA剪接變體，其由例如一個(gè)外顯子的一部分和完整的另一外顯子構(gòu)成，如圖12b所示。
[0061]另一方面，所述RNA剪接變體由CMV IE基因的外顯子2、3和4或其部分組成。另一方面，所述RNA剪接變體由CMV IE基因的外顯子2、3和5和/或其部分組成。應(yīng)理解，在本文所示本發(fā)明的所有方面，本文所述基因變體(CMV IE A i2)和/或RNA剪接變體和/或蛋白能用于例如本發(fā)明的任何方法或應(yīng)用或試劑盒，以鑒定CMVIEA i2株和其載體。
[0062]本發(fā)明另一方面涉及本文所定義RNA剪接變體編碼的蛋白，所述蛋白選自大小約為 150、125、86、72、55、53、50、40、38、36、32、31、24、20、19、18、14、12 和 IOkDa 的 CMV 蛋白。
[0063]本發(fā)明另一方面涉及在所述生物樣品中檢測是否存在CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或如本文所定義從其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體，和/或從本文所定義剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，所述方法包括步驟:a)從哺乳動(dòng)物提供生物樣品，b)通過對步驟a)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述一種或多種剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
[0064]本發(fā)明另一方面涉及在所述生物樣品中檢測是否存在CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，所述方法包括步驟:a)對所述樣品進(jìn)行技術(shù)分析，并且其后，b)在所述生物樣品中檢測是否存在CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。[0065]另一方面，本發(fā)明涉及檢測哺乳動(dòng)物患癌傾向的方法，所述方法包括步驟:a)從所述哺乳動(dòng)物提供生物樣品，和b)通過對步驟a)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，和c)基于所述哺乳動(dòng)物的所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白以測定患癌的傾向。
[0066]一方面，本文定義了檢測哺乳動(dòng)物患癌傾向的方法，所述方法包括步驟:a)通過對生物樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，和b)基于所述哺乳動(dòng)物的所述生物樣品中是否存在CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白以測定患癌的傾向。
[0067]另一方面，本發(fā)明涉及診斷哺乳動(dòng)物(所述哺乳動(dòng)物有CMV感染)巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥形式的方法，所述方法包括步驟:a)從所述哺乳動(dòng)物提供生物樣品，和b)通過對步驟a)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析以測定所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，并且基于所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的蛋白以診斷所述哺乳動(dòng)物是否有CMV相關(guān)癌癥疾病。
[0068]另一方面，本文定義了診斷哺乳動(dòng)物(所述哺乳動(dòng)物有CMV感染)巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括步驟:a)通過對生物樣品進(jìn)行技術(shù)分析以測定所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，和b)基于所述生物樣品中是否存在本文定義的CMV基因變體和/或其轉(zhuǎn)錄的剪接變體和/或其翻譯的蛋白以診斷所述哺乳動(dòng)物是否有CMV相關(guān)癌癥疾病。
[0069]本文定義的方法中，是否存在本文定義的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白是根據(jù)所述哺乳動(dòng)物中是否存在上述基因變體、剪接變體和/或蛋白的抗體來測定。
[0070]另外，在本文定義的方法中，是否存在本文定義的CMV基因變體(CMV IEAi2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白可以通過所述哺乳動(dòng)物中是否存在針對本文所定義CMV基因變體，針對從CMV基因變體轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或針對從其翻譯的一種或多種蛋白的T細(xì)胞來測定。
[0071]本文定義方法中使用的所述生物樣品可以是本文定義的任意生物樣品，從這些樣品中可以分離出病毒顆粒以用于檢測。如果所述生物樣品包含細(xì)胞，這些細(xì)胞可以在檢測病毒材料前裂解，并且所述病毒材料之后從其中分離。所述生物樣品也可以是除了細(xì)胞樣品之外的血漿樣品。因此，本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，所述生物樣品可以選自但不限于血液樣品、血漿樣品、組織樣品、干細(xì)胞樣品、器官移植物樣品、精液樣品、尿液樣品、唾液樣品和乳汁樣品。
[0072]在本文所述方法中，所述技術(shù)分析可以通過DNA檢測方法例如ISH (原位雜交)來進(jìn)行。
[0073]—方面，本發(fā)明涉及本文定義的方法，其中所述方法的所述技術(shù)分析通過包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法來進(jìn)行，所述PCR方法例如TaqMan ?實(shí)時(shí)PCR或序列捕獲PCR。一方面，所述PCR可以通過擴(kuò)增CMV的IE基因外顯子2和3的至少部分來進(jìn)行，以測定SEQID NO:1的存在，即在所述樣品中檢測CMV IE A i2。這是通過使用圖5和圖8和表1中示例的引物來進(jìn)行。這種方法也用于在載有CMV IE A i2潛伏形式的干細(xì)胞中檢測CMV IEA12,例如在⑶34陽性造血干細(xì)胞、在循環(huán)或組織駐留⑶133陽性干細(xì)胞和在循環(huán)或組織駐留內(nèi)皮祖細(xì)胞中，所述細(xì)胞通過其表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子2(VEGFR2)來鑒定。[0074]另一方面，本發(fā)明所述方法的技術(shù)分析通過使用FISH技術(shù)(熒光原位雜交)進(jìn)行。FISH是用于檢測和定位染色體上是否存在特異DNA序列的方法。FISH使用的熒光探針僅僅結(jié)合到與其有高度序列相似性的染色體部分上。熒光顯微鏡能用于發(fā)現(xiàn)熒光探針結(jié)合到染色體的哪個(gè)部分。FISH經(jīng)常用于發(fā)現(xiàn)DNA中的特異元件以用于基因建議、醫(yī)療和特異性鑒定。FISH也能用于檢測和定位組織樣品中的特異mRNA。在這種背景下，其能在細(xì)胞和組織中幫助定義基因表達(dá)的空間一時(shí)間模式。在其他方面，F(xiàn)ISH技術(shù)能包含DNA或RNA探針，以分析檢測基因變體CMV IE A i2感染細(xì)胞中的DNA定位特異模式，以及鑒定CMVIE A i2 DNA整合到人染色體中。與潛伏野生型CMV或野生型CMV活性復(fù)制相比，CMV陽性腫瘤細(xì)胞中的DNA定位模式顯著不同。
[0075]另一方面，使用抗體進(jìn)行本發(fā)明方法的技術(shù)分析。這種抗體可以例如針對CMV基因組立即早期(IE)區(qū)域的外顯子2和3(即在其上編碼蛋白)，并且因此測定在要分析的生物樣品中是否存在CMV基因變體。其他方面中，也能使用針對其他區(qū)域的抗體，例如針對非感染CMV顆粒的抗體，所述CMV顆粒如來自癌癥患者血液、血漿或血清的致密體或外來體。本發(fā)明的其他方面中，本文所述的不同技術(shù)分析方法能聯(lián)合鑒定是否存在CMV IEAi2基因變體和/或一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或從所述RNA剪接變體表達(dá)的一種或多種蛋白，如抗體檢測然后PCR或Western印跡，或任意其他組合?？贵w也能用于檢測是否存在非感染性或缺陷性CMV顆粒，包含從基因變體CMV IE A i2翻譯的致密體。本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，本文所示例方法能用于診斷癌癥，其中所述癌癥選自:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、惡性黑素瘤、皮膚癌和肉瘤、腎癌、胰腺癌及其轉(zhuǎn)移。如果癌癥形式涉及本文定義的CMV基因變體，也可以診斷本文沒有描述的其他癌癥形式。
[0076]本文公開的方法中，用SEQ ID NO:1所含的核酸(例如通過擴(kuò)增所述區(qū)域的PCR方法)來檢測本文定義的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
[0077]本文公開的任何方法也可以是體外方法。
[0078]另一方面，本發(fā)明也涉及使用本文定義的CMV基因變體(CMV IEAi2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，以檢測哺乳動(dòng)物的癌癥傾向。
[0079]另一方面，本發(fā)明涉及使用本文定義的CMV基因變體(CMV IEAi2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，以診斷哺乳動(dòng)物巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥形式。所述能診斷的癌癥形式可選自:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、惡性黑素瘤、皮膚癌、肉瘤、基底細(xì)胞癌和胰腺癌。如果癌癥形式涉及本文定義的CMV基因變體，也可以診斷本文沒有描述的其他癌癥形式。本文也涉及使用CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，其中所述變體通過使用SEQ ID NO:1所含核酸檢測，例如通過在擴(kuò)增所述區(qū)域的PCR方法中使用SEQ ID NO:1。
[0080]本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，本文所述哺乳動(dòng)物能是任意哺乳動(dòng)物，例如人類。
[0081]一方面，本發(fā)明也涉及試劑盒，所述試劑盒包含在獲自哺乳動(dòng)物的生物樣品中診斷、和/或檢測是否存在CMV基因變體(CMV IEA12)和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，也包含載有潛伏CMV IE A 12的細(xì)胞例如⑶34和VEGFR2陽性細(xì)胞。一方面，所述試劑包含進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的試劑。另一方面，所述試劑包含抗體。
[0082]一方面，本發(fā)明也涉及診斷方法/試劑盒，所述診斷方法/試劑盒包含診斷試劑，和/或檢測針對患者血清或血漿樣品中CMV IE A 12株的剪接變體IE蛋白生成的抗體(使用方法以檢測對CMV IE A i2株相關(guān)肽特異的抗體)，和更高水平的這些抗體；例如使用IE剪接變體蛋白涂層的ELISA板、膜或珠，等等，作為癌癥或患癌風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)記。
[0083]一方面，本發(fā)明也涉及診斷方法/試劑盒，所述診斷方法/試劑盒包含試劑以診斷、和/或檢測患者中與CMV IE A 12株生成肽反應(yīng)的T細(xì)胞，作為癌癥或患癌的生物標(biāo)記。
[0084]另外，常見人癌癥形式中CMV IE A i2株感染的細(xì)胞表示惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中鑒定以更高豐度生成的本文所定義新IE CMV蛋白允許靶向新CMV蛋白的免疫治療和治療性疫苗接種，并且因而有效消除CMV IEAi2株感染的細(xì)胞。顯示了腫瘤中的干細(xì)胞都表達(dá)這些CMV蛋白以及高水平I類和II類MHC分子，顯示了將其靶向特異免疫治療的可行性。
[0085]通過血漿去除術(shù)從癌癥患者富集的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)用載體中的CMVIE A i2 DNA、RNA離體培養(yǎng)以在細(xì)胞中生成蛋白，或者來自腫瘤的純化蛋白或外顯子2和外顯子3的重組蛋白會(huì)用于呈現(xiàn)患者的自體T細(xì)胞。培養(yǎng)中擴(kuò)增的活性T細(xì)胞作為過繼性治療再給予患者以治愈癌癥?；蛘?，在樹突細(xì)胞疫苗接種方案中，樹突細(xì)胞通過系列注射給予回患者以刺激體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增成CMV IE A 12相關(guān)肽。兩種方案的目的是殺死癌癥患者中病毒感染的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞。
[0086]所述CMV IEA i2株蛋白用于誘導(dǎo)抗體生成，包含細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抗體，旨在用于轉(zhuǎn)移至癌癥患者以發(fā)現(xiàn)和殺死病毒感染的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞。因此，本發(fā)明一方面涉及本文所述的這種治療方法。
[0087]其他方面中，本文所述的CMV IEA i2基因變體用于發(fā)展保護(hù)疫苗以從社會(huì)中消除這種病毒株?；诘鞍椎谋磉_(dá)載體和技術(shù)用于表達(dá)新的CMV IEAi2 IE蛋白，所述蛋白用于生成就預(yù)防和治療疫苗而言針對CMV IE A i2株的亞基疫苗。發(fā)展新型CMV IEAi2株的DNA疫苗以表達(dá)新的IE蛋白，所述蛋白用于靶向CMV IE A i2株的預(yù)防和治療疫苗。因此，本發(fā)明的其他方面涉及用作治療或預(yù)防疫苗的編碼CMV IE Ai2株的疫苗載體。另一方面，本發(fā)明涉及本文定義的CMV基因變體(CMV IEAi2)，或使用SEQ ID N0:1，和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白，以制備針對CMV感染進(jìn)行治療或預(yù)防疫苗接種的的疫苗載體。在一些方面，RNA轉(zhuǎn)錄物能用于表達(dá)本文公開的來自CMVIE A i2IE區(qū)域的新CMV蛋白，所述蛋白用作治療或預(yù)防疫苗接種的疫苗載體。在其他方面，從CMVIE A i2的IE區(qū)域生成的IE蛋白能用于過繼性治療以(離體)刺激T細(xì)胞。另外，本文所述轉(zhuǎn)錄物和蛋白能如本文所示例進(jìn)一步用作免疫治療的靶標(biāo)并且用于開發(fā)預(yù)防和治療疫苗。在本發(fā)明的一些方面，顆?？梢詮难褐羞x擇，并且用作原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移疾病的生物標(biāo)記。這種顆粒也可以從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物分離并且用于疫苗接種。載有基因變體CMV IEA12的循環(huán)腫瘤細(xì)胞能用PCR檢測，例如作為癌癥和轉(zhuǎn)移疾病的生物標(biāo)記。
[0088]本發(fā)明的其他方面中，能避免通過人組織或細(xì)胞移植來轉(zhuǎn)移CMV IE A i2株(包含血液灌注、干細(xì)胞或器官移植物、或從哺乳期婦女到小孩)從而消除癌癥風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)移，所述避免是通過檢測獲自哺乳動(dòng)物(如人)的生物樣品中是否存在基因變體CMV IE A i2和/或其轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)RNA剪接變體和/或其翻譯的一種或多種蛋白。所述方法也能用于匹配CMV IE A 12器官和血液供體與載有相同株的受體。
[0089]實(shí)驗(yàn)部分
[0090]縮寫
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種巨細(xì)胞病毒(CMV)基因變體，其特征在于，缺失CMV基因組立即早期(IE)基因的內(nèi)含子 2 (SEQ ID: 17) (CMV IEAi2)。
2.如權(quán)利要求1所述的基因變體，其特征在于，缺失的是Merlin參照序列AY446894.2 (野生型CMV)的位點(diǎn)173903到位點(diǎn)174019的核酸序列。
3.—種從權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的基因變體轉(zhuǎn)錄獲得的RNA剪接變體。
4.如權(quán)利要求3所述的RNA剪接變體，其特征在于，所述剪接變體由CMVIE基因的外顯子2和3，和/或其一個(gè)或多個(gè)部分組成。
5.如權(quán)利要求3所述的RNA剪接變體，其特征在于，所述剪接變體由CMVIE基因的外顯子2、3和4，和/或其一個(gè)或多個(gè)部分組成。
6.如權(quán)利要求3所述的RNA剪接變體，其特征在于，所述剪接變體由CMVIE基因的外顯子2、3和5，和/或其一個(gè)或多個(gè)部分組成。
7.一種由權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體或由權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的RNA剪接變體所編碼的蛋白，所述蛋白選自大小約150、125、76、75、72、55、53、50、40、38、36、32、31、30、25、19、18、14、12 和 IOkDa 的 CMV 蛋白。
8.在生物樣品中檢測是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多 種蛋白的方法，所述方法包括如下步驟: a)提供來自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品； b)通過對步驟b)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
9.在生物樣品中檢測是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白的方法，所述方法包括如下步驟: a)對所述樣品進(jìn)行技術(shù)分析，然后 b)在所述生物樣品中檢測是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
10.檢測哺乳動(dòng)物患癌傾向的方法，所述方法包括如下步驟: a.提供來自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品， b.通過對步驟a)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，和 c.在所述生物樣品中檢測是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從其翻譯的一種或多種蛋白，以測定所述哺乳動(dòng)物患癌的傾向。
11.檢測哺乳動(dòng)物患癌傾向的方法，所述方法包括如下步驟: a)通過對生物樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白，和 b)基于所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMVIE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從其翻譯的一種或多種蛋白確定所述哺乳動(dòng)物患癌的傾向。
12.診斷哺乳動(dòng)物巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥形式的方法，所述哺乳動(dòng)物載有CMV感染，所述方法包括如下步驟: a)提供來自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品； b)通過對步驟a)所得樣品進(jìn)行技術(shù)分析測定所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從其翻譯的一種或多種蛋白，和 c)基于在所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的剪接變體和/或從其翻譯的蛋白診斷所述哺乳動(dòng)物是否有CMV相關(guān)癌癥疾病。
13.診斷哺乳動(dòng)物巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥形式的方法，所述哺乳動(dòng)物載有CMV感染，所述方法包括如下步驟: a)通過對生物樣品進(jìn)行技術(shù)分析來測定所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從其翻譯的一種或多種蛋白，和 b)基于所述生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的剪接變體和/或從其翻譯的蛋白診斷所述哺乳動(dòng)物是否患有CMV相關(guān)癌癥疾病。
14.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白是根據(jù)所述哺乳動(dòng)物中是否存在上述基因變體、剪接變體和/或蛋白的抗體來測定的。
15.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白是根據(jù)所述哺乳動(dòng)物中是否存在針對如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體、針對權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從CMV基因變體轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或針對從其翻譯的一種或多種蛋白的T細(xì)胞來測定的。
16.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自血液樣品、組織樣品、干細(xì)胞樣品、器官移植物樣品、精液樣品、尿液樣品、唾液樣品、細(xì)胞拭子或乳汁樣品。
17.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述技術(shù)分析通過DNA檢測方法如ISH(原位雜交)進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述技術(shù)分析通過包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)如Taqman PCR或序列捕獲PCR試驗(yàn)的方法來進(jìn)行。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述PCR通過擴(kuò)增CMV的IE基因外顯子2和3的至少部分來進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述技術(shù)分析使用FISH技術(shù)(熒光原位雜交)進(jìn)行。
21.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述技術(shù)分析使用抗體來進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗體針對從CMV基因組立即早期(IE)區(qū)域的外顯子2和外顯子3翻譯的蛋白。
23.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、惡性黑素瘤、皮膚癌、和肉瘤、腎癌、胰腺癌及其轉(zhuǎn)移。
24.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用SEQID NO:1包含的核酸來測定如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或如權(quán)利要求3_7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
25.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法是體外方法。
26.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和/或從其翻譯的蛋白在檢測哺乳動(dòng)物癌癥傾向中的應(yīng)用。
27.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的RNA剪接變體和/或從其翻譯的蛋白在診斷哺乳動(dòng)物巨細(xì)胞病毒(CMV)相關(guān)癌癥中的應(yīng)用。
28.如權(quán)利要求26-27中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥形式選自:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、惡性黑素瘤、皮膚癌、和肉瘤、腎癌和胰腺癌。
29.如前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用SEQID NO:1包含的核酸來測定如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMV IE A i2)和/或如權(quán)利要求3_7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的一種或多種剪接變體和/或從所述剪接變體翻譯的一種或多種蛋白。
30.一種包含試劑的試劑盒，所述試劑診斷、和/或檢測獲自哺乳動(dòng)物的生物樣品中是否存在如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的CMV基因變體(CMV IE A i2)，和/或如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述從其轉(zhuǎn)錄的剪接變體和/或從其翻譯的蛋白。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包含進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或序列捕獲PCR試驗(yàn)的試劑。
32.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包含抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK103649109SQ201280021200
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月15日
【發(fā)明者】賽西莉亞·那烏克勒 申請人:賽西莉亞·那烏克勒