專利名稱：弓形蟲蟲體、風(fēng)疹、巨細(xì)胞、皰疹Ⅰ、Ⅱ病毒抗原純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種TORCH檢測(cè)診斷試劑盒中抗原物質(zhì)的純化方法。
新生兒出生缺陷已成為影響人口素質(zhì)的重要因素，在引起出生缺陷的諸多因素中，宮內(nèi)感染是一個(gè)重要因素。國(guó)內(nèi)外研究指出，妊娠期間發(fā)生弓形體Toxoplasma(Toxo)，風(fēng)疹病毒Rubella Virus(RV)、巨細(xì)胞病毒Cytomegalovirus(CMV)和單純皰疹病毒Herpes Simplex Virus(HSV)，簡(jiǎn)稱TORCH感染，可通過(guò)胎盤傳給胎兒，發(fā)展成為先天性或圍產(chǎn)期新生兒感染。是導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、先天畸形、智力障礙等不良妊娠結(jié)局的重要原因之一。
弓形蟲妊娠期初次感染者，弓形蟲通過(guò)胎盤感染胎兒；孕早期感染者可發(fā)生流產(chǎn)或畸胎妊娠中晚期感染者，可發(fā)生宮內(nèi)胎兒生長(zhǎng)遲緩，神經(jīng)系統(tǒng)損害等。
風(fēng)疹病毒病毒能使胎兒致畸，主要為先天性白內(nèi)障，先天性心臟和神經(jīng)性能耳聾。20周后感染者幾乎無(wú)影響。
巨細(xì)胞病毒病毒能通過(guò)胎盤感染胎兒，引起宮胎兒生長(zhǎng)遲緩，小頭畸形、腦炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、黃疸、肝脾腫大、溶血性盆血等，新生兒死亡率甚高。
單純皰疹病毒孕早期感染者能破壞胚芽而導(dǎo)致流產(chǎn)，孕中晚期感染者雖少發(fā)畸胎，但可引起胎兒和新生兒發(fā)病。
近年來(lái)，許多經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家已將TORCH檢測(cè)作為孕期常規(guī)篩查項(xiàng)目，在預(yù)防畸胎、流產(chǎn)等方面發(fā)揮重要的作用。在國(guó)內(nèi)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)“優(yōu)生優(yōu)育”的認(rèn)識(shí)逐步提高，TORCH檢測(cè)越來(lái)越受到重視。
成人TORCH感染的臨床癥狀不明顯，無(wú)法自我感覺到是否受到感染，因此孕前及早期診斷對(duì)優(yōu)生優(yōu)育十分重要。
目前，國(guó)際上公認(rèn)的最方便、最先進(jìn)的早期診斷方法是檢測(cè)人體血清中的特異IgM、IgG抗體，以判斷受到感染的情況。TORCH檢測(cè)有許多種，其中ELISA法因其特異性強(qiáng)，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而成為各實(shí)驗(yàn)室首選。目前國(guó)內(nèi)外均以IgM、IgG抗體的檢測(cè)作為早期診斷或進(jìn)行流行病學(xué)、免疫學(xué)調(diào)查的實(shí)驗(yàn)方法。檢出特異性IgM說(shuō)明患者近期感染，檢出特異IgG說(shuō)明患者既往感染。對(duì)孕期檢測(cè)抗體陽(yáng)性者建議定期復(fù)查，結(jié)合其他檢測(cè)對(duì)抗體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，了解胎兒發(fā)育情況，并給予相應(yīng)治療。
國(guó)內(nèi)開展TORCH檢測(cè)起步較晚，由于TORCH抗原純化的技術(shù)難度影響TORCH試劑盒的開發(fā)生產(chǎn)，所用試劑盒多為國(guó)外進(jìn)口或由國(guó)外購(gòu)入包被抗原組裝而成。這些進(jìn)口試劑不但價(jià)格昂貴，而且未經(jīng)國(guó)家檢定部門檢定，產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法保障和規(guī)范。許多產(chǎn)品使用效果很不理想，市場(chǎng)情況混亂。
本發(fā)明的目的是為了提供一種工藝過(guò)程簡(jiǎn)便、所用試劑低廉、抗原純度和收率高、可批量生產(chǎn)、批間差異小的TORCH抗原純化工藝。
本發(fā)明的目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養(yǎng)液，經(jīng)離心去除細(xì)胞碎渣后，沉淀離心分離得病毒沉淀物；(2)將弓形蟲腹水離心去除細(xì)胞，然后加入的0.01mol、PH＝7的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋，離心后弓形蟲腹水與緩沖液的體積比為1∶(0.8-1.3)，再沉淀后離心分離得弓形蟲病毒沉淀物；(3)將上述(1)、(2)兩步沉淀所取得的病毒深沉物分別溶于0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的緩沖液中；然后再將溶解液采用透析得病毒濃縮液；(4)將病毒濃縮液用離子交換柱進(jìn)行分離并用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脫，收集各蛋白峰，包被酶標(biāo)板，并用已知陽(yáng)性血清，做間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)抗原活性高峰液收集，即為純化Torch抗原。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的工藝過(guò)程簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊貴重設(shè)備，采用中性鹽、有機(jī)溶劑和非離子多聚物沉淀濃縮病毒、步驟簡(jiǎn)單，所用試劑低廉、收率高可達(dá)80％以上。
2、本發(fā)明利用病毒體和弓形蟲體的特定結(jié)構(gòu)，選用DEAE陰離子交換柱，做NaCl梯度洗脫工藝純化抗原，抗原純度高，用于包被酶標(biāo)試劑盒、包被抗原板、本底低，可批量生產(chǎn)，批間差異小，一個(gè)批次可生產(chǎn)100萬(wàn)人份以上的抗原用于酶標(biāo)試劑盒。
本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一一種TORCH抗原純化工藝含有下述工藝(1)取風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細(xì)胞病毒培養(yǎng)液100ml、經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液調(diào)PH7.0，加100ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘分離得沉淀物，再將沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS緩沖液中。
(2)將上述液體加入50ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分離得沉淀物，再將沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS緩沖液中。
(3)重復(fù)第(2)步兩次，最后將沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.00的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中。
(4)將此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中，在4℃下透析直至無(wú)硫酸根離子和銨離子檢出，再濃縮至10ml，此液為病毒濃縮提取液。
(5)將病毒濃縮提取液過(guò)DEAE纖維素交換柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液含0.2-0.5mol的NaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰包被酶標(biāo)板用風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒陽(yáng)性血清做間接ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)相應(yīng)抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油混勻，低溫保存。
弓形蟲純化(1)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液調(diào)PH7.0加入200ml飽和硫酸銨，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分離得沉淀物，將沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(2)將上述液體加入50ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻后，在4℃下靜置30分鐘，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分離得沉淀物，將沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(3)重復(fù)上述第(2)步兩次，最后將沉淀溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中。
(4)將此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中，在4℃下透析直至無(wú)硫酸根離子和銨離子檢出，再濃縮至10ml，此液為弓形蟲濃縮提取液。
(5)弓形蟲濃縮提取液過(guò)DEAE纖維素交換柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰液，包被酶標(biāo)板，用弓形蟲陽(yáng)性血清做間接ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)弓形蟲抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
實(shí)施例二在實(shí)施例一中將硫酸銨用硫酸鈉代替，最后濃縮提取液過(guò)于離離子交換柱可采用Qsepharose Fast Flow柱，其余工藝和參數(shù)與例一同。
實(shí)施例三一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液；(2)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液；(3)將上述(1)(2)兩步的上清液分別加入預(yù)冷的95％的乙醇至濃度達(dá)到60％，在-5℃下靜置過(guò)液，次日經(jīng)3000r/m離心30分鐘得沉淀物；(4)再將沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中；(5)將上述(4)的溶液分別在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡過(guò)DEAESepharose Fast Flow柱，并用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶標(biāo)板，用風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型和弓形蟲陽(yáng)性血清分別做間接ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)相應(yīng)抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
實(shí)施例四一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液；(2)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液；(3)將上述(1)(2)兩步的上清液分別加入葡聚糖至濃度達(dá)到12％，調(diào)PH7.4，在4℃下靜置過(guò)液，次日經(jīng)7000r/m離心20分鐘得沉淀物；(4)再將沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中；(5)將上述(4)的溶液分別在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡過(guò)DEAESepharose Fast Flow柱，并用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶標(biāo)板，用風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型和弓形蟲陽(yáng)性血清分別做間接ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)相應(yīng)抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
權(quán)利要求
1.一種TORCH抗原純化工藝，其特征在于含有下述步驟(1)將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養(yǎng)液，經(jīng)離心去除細(xì)胞碎渣后，沉淀離心分離得病毒沉淀物；(2)將弓形蟲腹水離心去除細(xì)胞，然后加入的0.01mol、PH＝7的磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋，離心后弓形蟲腹水與緩沖液的體積比為1∶(0.8-1.3)，再沉淀后離心分離得弓形蟲病毒沉淀物；(3)將上述(1)、(2)兩步沉淀所取得的病毒深沉物分別溶于0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的緩沖液中；然后再將溶解液采用透析得病毒濃縮液；(4)將病毒濃縮液用離子交換柱進(jìn)行分離并用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脫，收集各蛋白峰，包被酶標(biāo)板，并用已知陽(yáng)性血清，做間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)抗原活性高峰液收集，即為純化TORCH抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的TORCH抗原純化工藝，其特征在于所述的細(xì)胞沉淀工藝可采用鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀和非離子多聚物沉淀工藝。
3.如權(quán)利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特征在于所述的鹽析沉淀工藝含有下述步驟(1)將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養(yǎng)液經(jīng)離心后的病毒液和弓形蟲腹水經(jīng)離心后的蟲體稀釋液分別加入飽和硫酸銨至飽和度達(dá)20-60％，混勻，在4℃下靜置再離心分離得病毒沉淀物；(2)將病毒沉淀物溶于體積比為1∶(5-10)的0.01mol、PH＝7.0的PBS緩沖液中；(3)將上述溶解液再加入飽和硫酸銨至飽和度達(dá)20-60％進(jìn)行二次沉淀，經(jīng)離心分離得沉淀物，并將沉淀物按(2)步的溶解工藝溶解；(4)重復(fù)(3)步工藝至少一次，并將最后的沉淀物溶于體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中。
4.如權(quán)利要求3所述的TORCH抗原純化工藝，其特征在于所述的硫酸銨還可用硫酸鈉代替，但其濃度為10-20％，其余工藝步驟和參數(shù)不變。
5.如權(quán)利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特征在于所述的有機(jī)溶劑沉淀工藝是將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養(yǎng)液經(jīng)離心后的病毒液和弓形蟲腹水經(jīng)離心后的蟲體稀釋液分別加入乙醇和/或丙酮至濃度達(dá)50-80％進(jìn)行沉淀，離心分離得病毒沉淀物，再將沉淀物溶于體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩沖液中。
6.如權(quán)利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特征在于所述的非離子多聚物沉淀工藝是將采風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養(yǎng)液經(jīng)離心后的病毒液和弓形蟲腹水經(jīng)離心后的蟲體稀釋液分別加入葡聚糖/右旋糖酐硫酸鈉至濃度達(dá)5-15％進(jìn)行沉淀，離心分離得病毒沉淀物，再將深沉物溶于體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDPA緩沖液中。
7.如權(quán)利要求1所述的TORCH純化抗原工藝，其特征在于所述的離子交換柱可選自DEAE纖維素柱、DEAE Sepharose Fast Flow柱、Qsepharose FastFlow柱中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TORCH抗原純化工藝,該工藝是將風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒培養(yǎng)液離心分離后和弓形蟲腹水經(jīng)離心分離再稀釋的蟲體液進(jìn)行沉淀分離得沉淀物,再將沉淀物溶解,然后經(jīng)透析得濃縮病毒液和弓形蟲提取濃縮液,將濃縮液過(guò)DEAE類陰離子交換柱,收集各蛋白峰,包被酶標(biāo)板,并用已知陽(yáng)性血清做間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)抗原活性高峰液收集,即為純化TORCH;本發(fā)明的工藝收率高可達(dá)80%以上、生產(chǎn)的抗原純度高、工藝簡(jiǎn)便,可批量生產(chǎn)、批間差異小、一個(gè)批次可生產(chǎn)100萬(wàn)人份以上的抗原。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1389731SQ0111528
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2001年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者李克生, 杜惠芬 申請(qǐng)人:李克生