Atm基因突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了ATM基因突變體及其應用，具體涉及分離的編碼ATM基因突變體的核酸、分離的多肽、篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法、篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒。其中，分離的編碼ATM基因突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自下列的至少一種突變：c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del。通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
【專利說明】ATM基因突變體及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及ATM基因突變體及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002]共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(ataxia-telangiectasia, AT)是一種罕見的常染色體隱性遺傳(autosomal recessive inherited, AR)病，又叫 Louis-Bar 綜合征，于 1941 年由Louis-Bar首先報道。AT發(fā)病率約1/4萬~1/10萬，多于兒童期起病，臨床主要表現(xiàn)為進行性發(fā)展的小腦性共濟失調(diào)，眼球結(jié)膜和面部皮膚的毛細血管擴張，反復發(fā)作的呼吸道感染；同時還具有對射線的殺傷作用異常敏感，染色體不穩(wěn)定性，易患惡性腫瘤，免疫缺陷和抗射線的DNA復制合成等特征。
[0003]Savitsky和Uziel等率先克隆AT的疾病基因(ATM)，并將其定位于llq22.3。ATM是AT唯一的致病基因，全長約150kb，而編碼序列只有12kb，共有66個外顯子，編碼一個有3056個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為350000的蛋白質(zhì)。ATM基因產(chǎn)物ATM編碼蛋白作為直接感受DNA雙鏈斷裂(DSBs)損傷信號的上游分子，以其激酶活性，催化多種重要功能底物蛋白的磷酸化，使受損的DNA停止于細胞周期檢測點并對其進行修復，對維持染色體的穩(wěn)定性起重要作用。
[0004]ATM基因的克隆為AT的基因診斷和癥狀前診斷奠定了基礎(chǔ)，并且很大程度上解決了該病臨床診斷困難的問題。ATM蛋白在胎兒和成人組織內(nèi)均有廣泛表達，其功能域包括磷酯酰肌醇 3-激酶(phosphoinositide_3kinase，PI3K)、Rad3、亮氨酸拉鏈(leucinezipper, LZ)、局部的連接區(qū)域(focaladhes1n target, FAT)、局部的連接區(qū)域C端(FATC)等。PI3K蛋白家族成員和具有Rad3結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員參與了激活細胞周期關(guān)卡，控制端粒長度和應答DNA損傷等重要的生物學過程。
[0005]AT最顯著的病理學表現(xiàn)是基因組的不穩(wěn)定性，主要反應在高頻率的染色體斷裂，自發(fā)染色體末端融合和染色體內(nèi)同源重組及染色體易位，以及體內(nèi)、外染色體自發(fā)畸變率和輻射誘發(fā)染色體畸變率的異常增加。作為DNA損傷信號傳導通路中最早的傳感和中樞調(diào)控基因，ATM編碼的ATM蛋白在電離輻射的誘導下被激活，并磷酸化其下游蛋白，通過調(diào)控細胞周期關(guān)卡、DNA損傷修復、細胞凋亡等維持基因組穩(wěn)定性。AT細胞由于ATM基因突變，缺失了 ATM蛋白，喪失了對下游基因的調(diào)控作用，使受損的DNA的合成受抑，阻礙DNA的修復過程，從而導致染色體的斷裂和基因組不穩(wěn)定。
[0006]ATM基因的突變具有極高的異質(zhì)性，突變方式和突變檢測都極為復雜。到目前為止，國外已經(jīng)報道了 400余種ATM基因突變，絕大多數(shù)AT患者為復合性雜合突變，突變形式有錯義突變、無義突變、剪切位點突變、小片段插入突變、小片段缺失突變、大片段缺失和同義突變等，突變位點遍布基因全長，無突變熱點。
[0007] 因而，目前對共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的致病基因ATM突變基因的研究仍有待深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法。
[0009]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作完成的:發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定了共濟失調(diào)毛細血管擴張癥新的致病基因突變位點(ATM基因的 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del 突變)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相對于野生型ATM基因，本發(fā)明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del(eX0n65del)的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，該突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽，該多肽與SEQ IDNO:2 相比，具有選自下列的至少一種突變:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs和p.2951_2995del，通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽是由上述核酸編碼的。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的地三個方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，該方法包括以下步驟:從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ 、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和 c.8851_8987del(exon65del)的至少一種突變是所述生物樣品易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的指示，任選地，所述生物樣品為選自人體血液，任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA，任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。通過根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥；任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒，該試劑盒含有:適于檢測ATM基因突變體的試劑，其中與SEQ IDNO:1相比，所述ATM基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del (exon65del)，任選地，所述試劑為核酸探針或引物，任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列，任選地，所述是常染色體隱性遺傳疾病。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸。需要說明的是，“構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸”表示，本發(fā)明的構(gòu)建體包含與SEQ ID N0:1相比具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和c.8851_8987del (exon65del)至少一種突變。由此，利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用作共濟失調(diào)毛細血管擴張癥相關(guān)研究的模型。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提出了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明的重組細胞，能夠有效地用作共濟失調(diào)毛細血管擴張癥相關(guān)研究的模型。
[0017]對于本發(fā)明中所述核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本發(fā)明的實施例中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID NO: 1，實際包括其互補序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0018]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0020]圖1:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，
[0021]A為根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥患者的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，
[0022]B為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0023]C為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖。
[0024]圖2:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的共濟失調(diào)毛細血管擴張癥患者的家系圖
-1'TfeP曰。
[0025]圖3:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系I的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0026]圖4:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系2的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0027]圖5:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系3的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。
[0028]圖6:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系I的ATM基因突變體的QPCR的結(jié)果圖。圖7:顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的AT家系2的ATM基因突變體的Sanger法測序結(jié)果。

【具體實施方式】
[0029]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0030]ATM基因突變體
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC和c.8851_8987del (exon65del)。即相對于野生型ATM基因，本發(fā)明的ATM基因具有 c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC 和c.8851_8987del (eX0n65del)突變的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，該突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0032]在本文中所使用的表達方式“編碼ATM突變體的核酸”，是指與編碼ATM突變體的基因相對應的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與ATM突變體的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，前面所述的編碼ATM突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 ATM基因的新突變體，這些新突變體與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥，也可以通過檢測這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預測生物體是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥。
[0033]該編碼ATM突變體的核酸，是本申請的發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定的共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的致病基因上的新突變。該突變位點在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。
[0034]其中，野生型ATM基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:

【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼ATM基因突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID N0:1相比， 所述核酸具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Cysl899X、p.Glu2950fs、p.Trpl026Cys、p.Val2662del、p.1lel59fs 和p.2951_2995del, 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一種突變是所述生物樣品易患感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA， 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥是常染色體隱性遺傳疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測序文庫進一步包括: 利用ATM基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測序文庫， 任選地，所述ATM基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與 SEQ ID NO:1 相比，是否具有 c.5697C>A、c.4777_2A>T、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_48IdeIATCTC 和 c.8851_8987del 的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥； 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥為常染色體隱性遺傳疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括: RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地,所述文庫構(gòu)建單元 進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有ATM基因外顯子特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易患共濟失調(diào)毛細血管擴張癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測ATM基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述ATM基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.5697C>A、c.4777-2ΑΧ、c.3078G>T、c.7983_7985delTGT、c.477_481delATCTC和 c.8851_8987del, 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地,所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:7-16所示的核苷酸序列， 任選地，所述共濟失調(diào)毛細血管擴張癥為常染色體隱性遺傳疾病。
10.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼ATM基因突變體的核酸。
11.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而獲得的。
【文檔編號】C12N15/12GK104178487SQ201310188517
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月20日
【發(fā)明者】江泓, 陳召, 師玉亭, 唐北沙, 肖晶晶, 管李萍, 王俊 申請人:中南大學湘雅醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司