專利名稱：：巨細(xì)胞病毒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體來說涉及疫苗研發(fā)領(lǐng)域。更具體來說，本發(fā)明涉及通過選擇繁殖巨細(xì)胞病毒的細(xì)胞型增加巨細(xì)胞病毒疫苗多樣性的方法，以及由這些方法制備的巨細(xì)胞病毒在疫苗組合物研發(fā)中的用途。
背景技術(shù)：
：本說明書通篇引用各種公開案，包含專利、公開申請案、技術(shù)文獻(xiàn)和學(xué)術(shù)文章。這些引用的公開案各以全文引用的方式并入本文中。本說明書最后列出說明書內(nèi)以圓括號中的數(shù)字提及的完全引用或未完全引用的公開案。巨細(xì)胞病毒(CMV)是歸為皰疹病毒科0亞科的成員的皰疹病毒。根據(jù)疾病控制和預(yù)防中心(CentersforDiseaseControlandPrevention)，發(fā)現(xiàn)CMV感染頗為普遍地存在于人類群體中，據(jù)估算40-80%的美國成人群體受感染。這一病毒主要通過體液傳播，且時常從懷孕母體傳遞給胎兒或新生兒。雖然CMV感染在大多數(shù)個體中是潛伏性的，但病毒激活(virusactivation)會引發(fā)高燒、寒戰(zhàn)、疲勞、頭痛、惡心和脾腫大。雖然大多數(shù)人類CMV感染是無癥狀的，但免疫不成熟或免疫受損個體(諸如新生兒、HIV陽性患者、同種異體移植患者和癌癥患者)的CMV感染尤其是個問題。這些個體的CMV感染除其它有害病況外還會引發(fā)危重癥，包括肺炎、肝炎、腦炎、結(jié)腸炎、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎、失明和神經(jīng)病。另外，CMV是先天缺陷的主要原因。目前，尚無治愈或預(yù)防CMV感染的疫苗。皰疹病毒進(jìn)入細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程，從吸附和受體結(jié)合開始，接著是病毒包膜與細(xì)胞膜融合。融合發(fā)生在質(zhì)膜或內(nèi)體膜上。舉例來說，EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入初級B細(xì)胞(1，2)，又通過使病毒粒子包膜與質(zhì)膜融合感染上皮細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(1)。雖然單純皰疹病毒與一些細(xì)胞型的質(zhì)膜融合，但通過胞吞作用進(jìn)入其他細(xì)胞型(3-6)。人巨細(xì)胞病毒(HCMV)活體內(nèi)感染多種細(xì)胞型，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(7)。雖然其與成纖維細(xì)胞的質(zhì)膜融合(8)，但通過胞吞作用進(jìn)入視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(9，10)。皰疹病毒“選擇”其進(jìn)入途徑的機(jī)理尚不清楚。雖然一般認(rèn)為進(jìn)入途徑主要由宿主細(xì)胞決定，但病毒粒子糖蛋白的趨性角色(tropicrole)優(yōu)先(11)。EBV病毒粒子含有兩種gH復(fù)合物，即gH/gL和gH/gL/gp42(12，13)，其具有互斥功能(11)。雖然與B細(xì)胞質(zhì)膜融合由gH/gL/gp42介導(dǎo)(14-16)，但進(jìn)入上皮細(xì)胞由gH/gL引發(fā)(11，12，17)。制備EBV的細(xì)胞型可改變EBV的趨性。B細(xì)胞衍生的EBV病毒粒子所含的gH-gL-gp42少于上皮細(xì)胞衍生的病毒粒子。因此，B細(xì)胞產(chǎn)生的病毒對上皮細(xì)胞更具感染性，而上皮細(xì)胞衍生的病毒具B細(xì)胞趨性的(18)。HCMV還編碼兩種gH/gL復(fù)合物gH/gL/gO和gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131(19，20)。含g0的復(fù)合物足以用于成纖維細(xì)胞感染，而含pUL128/pUL130/pUL131的復(fù)合物為感染內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞所需(19-21)。AD169實驗室病毒株在其病毒粒子中僅含有g(shù)H/gL/g0復(fù)合物(19)。第二種gH/gL復(fù)合物的缺乏造成HCMV實驗室病毒株的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞趨性喪失(19-22)。需要CMV疫苗變種和CMV疫苗多樣性，且需要控制病毒傳播和激活、尤其免疫受損個體和孕婦的病毒傳播和激活的有效方法。本發(fā)明解決這一需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面提供一種制備巨細(xì)胞病毒(CMV)疫苗的方法。這一方法包含在選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖CMV病毒株或分離株，從而制備細(xì)胞型條件性CMV，和由所述細(xì)胞型條件性CMV制備CMV疫苗。在某些實施例中，CMV病毒株或分離株是人CMV(HCMV)病毒株或分離株。有多種多樣的細(xì)胞型適用于這一方法，包括(但不限于)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。在一個具體實施例中，選定的細(xì)胞型是上皮細(xì)胞。上述方法可進(jìn)一步包含在兩種或兩種以上不同的選定細(xì)胞型中制備細(xì)胞型條件性CMV和合并這些CMV來制備CMV疫苗。可選地或另外地，這一方法包含提供兩種或兩種以上CMV病毒株或分離株，使這些病毒株或分離株的每一株在包含選定細(xì)胞型或兩種或兩種以上不同的選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞中生長和合并由此制備的所有CMV來制備CMV疫苗。在某些實施例中，這一方法包含制備減毒活CMV疫苗。在另一實施例中，其包含制備滅活或死CMV疫苗。在其它實施例中，其包含制備包含一種或一種以上減毒活病毒、滅活病毒和其它免疫原性組分(例如免疫原性CMV蛋白和肽)等的組合疫苗。由上述方法制備的CMV疫苗也屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明的另一方面提供一種實施本發(fā)明方法的試劑盒。這些試劑盒通常包括內(nèi)部含有一種或一種以上CMV病毒株或臨床分離株、一種或一種以上選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞的包裝，以及關(guān)于使用培養(yǎng)細(xì)胞和CMV病毒株或分離株制備用于CMV疫苗的細(xì)胞型條件性CMV的說明書。本發(fā)明的另一方面提供一種疫苗組合物，其包含與適合的藥用載體或佐劑混合的巨細(xì)胞病毒(CMV)群體或其病毒粒子組分，其中所述CMV群體從選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞中分離。在一個實施例中，選定的細(xì)胞型是上皮細(xì)胞。在一個實施例中，疫苗組合物包含人巨細(xì)胞病毒(HCMV)。在疫苗組合物的各個實施例中，從上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的CMV群體的特征在于在隨后感染的宿主細(xì)胞中的一個或一個以上特征，包括(但不限于)(a)通過與宿主細(xì)胞質(zhì)膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞中；(b)與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體相比，宿主細(xì)胞的由病毒粒子介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合更多；(c)與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體相比，宿主細(xì)胞中的病毒生長加速；(d)引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，包括與由從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體在感染后10小時所引發(fā)的應(yīng)答相比，約三分之二以下的基因的表達(dá)改變大于或等于2.5倍；或(e)引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，包括如本文中表2和表4中所示的一個或一個以上基因的表達(dá)發(fā)生變化，所述基因由以下基因庫登錄號(GenBankAccessionNos)表示AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442,NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。在某些實施例中，疫苗組合物包含從兩種或兩種以上不同的選定細(xì)胞型的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的CMV群體或其病毒粒子組分。舉例來說，CMV群體可從上皮細(xì)胞和另一細(xì)胞型(諸如成纖維細(xì)胞型)的細(xì)胞中分離。在其它實施例中，CMV群體包含兩種或兩種以上在選定細(xì)胞型中生長的CMV病毒株或臨床分離株。某些實施例可包含多種在多種不同細(xì)胞型的細(xì)胞培養(yǎng)物中生長的CMV病毒株或臨床分離株。在一個實施例中，疫苗組合物包含減毒活CMV疫苗。在另一實施例中，其包含滅活CMV疫苗。在其它實施例中，疫苗組合物可為包含減毒活病毒或其組分、滅活病毒或其組分和/或其它免疫原性CMV肽或蛋白中的一種或一種以上病毒株的組合疫苗。本發(fā)明的另一方面提供一種使個體對CMV免疫的方法，其包含向個體給藥由上述方法制備和/或包含上述特征的CMV疫苗組合物。在一個實施例中，待免疫的個體是人類?？蓞㈤喨缦赂綀D、實施方式和實例來理解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。圖1HCMVIE1于ARPE-19細(xì)胞中表達(dá)的動力學(xué)。(A)在指定時間時固定感染細(xì)胞(每個細(xì)胞0.lpfu)，且對IE1(彩色照片中為綠色，黑白照片中為淺灰色)、SplOO(彩色照片中為紅色，黑白照片中為極深的灰色)和DNA(彩色照片中為藍(lán)色，黑白照片中為深灰色)進(jìn)行染色。(B)在感染(每個細(xì)胞0.lpfu)后各時間點，定量表達(dá)IE1的細(xì)胞的百分比；結(jié)果顯示于圖中。圖2HCMV進(jìn)入ARPE-19細(xì)胞的電子顯微鏡分析。在4°C下使印iBADrUL131或fibroBADrUL131粒子(每個細(xì)胞50pfu)與細(xì)胞結(jié)合，隨后在37°C下內(nèi)化15分鐘。呈示代表性圖像。圖3內(nèi)體酸化抑制劑和病毒粒子源對HCMV進(jìn)入ARPE-19細(xì)胞的作用。一式三份進(jìn)行實驗，且相對于未處理培養(yǎng)物，記錄經(jīng)藥物處理的培養(yǎng)物中陽性細(xì)胞的數(shù)目。㈧用NH4CI或BFA預(yù)處理細(xì)胞1小時，接種epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每個細(xì)胞lpfu)，且16小時后對IE1進(jìn)行染色。(B)用50mMNH4C1或40nMBFA預(yù)處理細(xì)胞1小時，隨后接種指定細(xì)胞型中所制備的BADrUL131(每個細(xì)胞0.lpfu)或FIXwt(每個細(xì)胞0.Olpfu)，且16小時后對IE1進(jìn)行染色。圖4由上皮細(xì)胞衍生的病毒誘導(dǎo)的從ARPE-19細(xì)胞外部的融合。(A)給細(xì)胞接種epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每個細(xì)胞20pfu)，隨后維持在含200ug/mlPFA的培養(yǎng)基中。感染后16小時，獲取相襯圖像(Phasecontrastimage)。(B)在4°C下用印iBADrUL131或fibroBADrUL131(每個細(xì)胞20pfu)感染報告分子(importer)與效應(yīng)細(xì)胞(effectorcell)的混合物1小時。隨后使培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變到37°C歷時6小時，此后測量相對熒光素酶活性。圖5pUL130特異性中和抗體對HCMV感染和進(jìn)入的作用。(A)與各種濃度的抗PUL130—起培育上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞衍生的病毒，且測定殘余感染性。(B)用最終濃度為20yg/ml的抗pUL130或用PBS預(yù)處理上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞衍生的病毒粒子，隨后在4°C下吸附于ARPE-19細(xì)胞1小時。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，且提取與細(xì)胞相關(guān)的病毒DNA測定附著于細(xì)胞的粒子的相對數(shù)目?；蛘撸辜?xì)胞轉(zhuǎn)變到37°C歷時2小時以使病毒進(jìn)入。利用EDTA-胰蛋白酶處理移除未穿透細(xì)胞的病毒粒子。接著利用實時PCR定量內(nèi)化的病毒DNA。圖6上皮細(xì)胞中所制備的HCMV相對于成纖維細(xì)胞中所制備的HCMV對ARPE-19轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)的調(diào)節(jié)。(A)文氏圖(Vermdiagram)描繪相對于模擬感染，經(jīng)epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每個細(xì)胞3pfui)感染后6小時或10小時，分化調(diào)控基因的分布。⑶實時RTPCR測定的相對RNA水平的變化。所測試的基因是羥甲基膽素合成酶(HMBS,NM_000190)、與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的GLI1(膠質(zhì)瘤)(GliPR,NM_006851)、由IL-13快速誘導(dǎo)的與穿透素(pentraxin)相關(guān)的基因(PTX3，NM_002852),2‘-5'-寡腺苷酸合成酶3(0AS3，NM_006187)、干擾素誘導(dǎo)的蛋白44(IFI44，NM_006417)、v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒致癌基因同系物BB細(xì)胞中k輕鏈多肽基因強(qiáng)化子的核因子3(relB，NM_006509)和ATP結(jié)合盒子族C(CFTR/MRP)成員3(MRP3,NM_003786)。具體實施例方式本說明書和權(quán)利要求書通篇使用與本發(fā)明方法和其它方面有關(guān)的各種術(shù)語。除非另作定義，否則本文中所使用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所理解相同的含義。雖然任何與本文所述的方法和材料類似或相同的方法和材料都可用于測試本發(fā)明的實踐中，但本文描述優(yōu)選材料和方法。在描述和主張本發(fā)明時，將使用以下術(shù)語。應(yīng)理解，本文中所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施例的目的且不打算限制本發(fā)明。^X如本說明書和隨附權(quán)利要求書中所使用，除非另外明確說明，否則單數(shù)形式“一(a，an)”和“所述(the)”包括多個指示物。因此，例如提及“一個細(xì)胞”包含兩個或兩個以上細(xì)胞的組合等。如本文所使用的“約”當(dāng)提及諸如量、持續(xù)時間(temporalduration)等可測量值時，打算涵蓋距指定值士20%或士10%、更優(yōu)選士5%、甚至更優(yōu)選士1%且更優(yōu)選士0.1%的變動，因為這些變動適于進(jìn)行所揭示的方法。術(shù)語“擴(kuò)增”、“繁殖”和“生長”在本文中可互換使用，是指根據(jù)病毒學(xué)家和醫(yī)學(xué)生物學(xué)家熟知的方法在允許病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖的條件下向培養(yǎng)細(xì)胞中引入病毒或用病毒感染細(xì)胞的一般方法。具體來說，這些術(shù)語在本文中用于指本發(fā)明方法中CMV通過在選定細(xì)胞型上繁殖而“條件化”的步驟，該步驟之后為使用條件性CMV制備疫苗?！吧锓肿印卑ǖ鞍踪|(zhì)、多肽、核酸、脂質(zhì)、多糖、單糖和其所有片段、類似物、同系物、結(jié)合物以及衍生物?！凹?xì)胞培養(yǎng)物”一般指取自活生物體且在控制條件下(“在培養(yǎng)物中”或“培養(yǎng)”)生長的細(xì)胞?！霸?xì)胞培養(yǎng)物”是在第一繼代培養(yǎng)之前直接取自生物體的細(xì)胞、組織或器官的培養(yǎng)物?！凹?xì)胞系”是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一次或一次以上繼代培養(yǎng)所形成的細(xì)胞群體。基因的“編碼區(qū)”由基因的編碼鏈的核苷酸殘基和基因的非編碼鏈的核苷酸組成，所述鏈各別與基因轉(zhuǎn)錄所制備的mRNA分子的編碼區(qū)同源或互補(bǔ)。mRNA分子的“編碼區(qū)”也由mRNA分子的核苷酸殘基組成，這些殘基在mRNA分子翻譯期間與轉(zhuǎn)移RNA分子的反密碼子區(qū)匹配或編碼終止密碼子。因此，編碼區(qū)可包括對應(yīng)于不存在于mRNA分子編碼的成熟蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基(例如蛋白質(zhì)輸出信號序列中的氨基酸殘基)的核苷酸殘基。術(shù)語“條件性病毒(conditionedvirus)”、“細(xì)胞型條件性病毒(celltype-conditionedvirus)”、“條件性CMV(conditionedCMV)”或“細(xì)胞型條件性CMV(celltype-conditionedCMV)”是指根據(jù)本文所述的方法在用于制備疫苗之前已在選定細(xì)胞型中繁殖的CMV。這些術(shù)語打算類似于術(shù)語“條件性培養(yǎng)基”，描述已生長特定細(xì)胞型或細(xì)胞系隨后移出且含有細(xì)胞制備的組分或因子，從而改變培養(yǎng)基的功能的培養(yǎng)基。出于本申請案的目的，術(shù)語“條件性病毒(conditionedvirus)”類似地指已在選定細(xì)胞型中生長，隨后從這些細(xì)胞中移出的病毒，其中病毒此后展現(xiàn)一種或一種以上因在這種細(xì)胞型中生長而產(chǎn)生的改變的功能特征?！熬幋a”是指諸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的核苷酸的特定序列用作生物過程中合成具有確定序列的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定序列的氨基酸的其它聚合物和大分子的模板的固有性質(zhì)和由此產(chǎn)生的生物性質(zhì)。因此，如果對應(yīng)于基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中制備蛋白質(zhì)，那么這一基因編碼蛋白質(zhì)。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供于序列表中的編碼鏈與用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈可稱作編碼這一基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另作說明，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互為簡并形式且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊痹诒疚闹锌苫Q使用，且指如本文所述有效實現(xiàn)特定生物結(jié)果的化合物、調(diào)配物、物質(zhì)或組合物的量。這些結(jié)果可包括(但不限于)如任何適于所屬領(lǐng)域的方法所確定的對病毒感染的抑制。如本文所使用的“內(nèi)源性”是指來自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)或生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)部所制備的任何物質(zhì)。“外源性”是指從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外部引入或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外部所制備的任何物質(zhì)。如本文所使用的術(shù)語“表達(dá)”定義為在啟動子驅(qū)動下轉(zhuǎn)錄和/或翻譯特定核苷酸序列。如本文所使用的“免疫”或“疫苗接種”在本文中可互換使用且意指預(yù)防性或治療性免疫或疫苗接種。“治療性疫苗接種”意思是給CMV感染患者接種疫苗。“分離”意思是從自然狀態(tài)變更或移出。舉例來說，天然存在于活的動物中的核酸或肽不是“分離”的，而部分或完全與其自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分離的相同核酸或肽是“分離”的。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以實質(zhì)上純的形式存在，或可存在于非原生環(huán)境(諸如宿主細(xì)胞)中。除非本文另外特別說明，否則形成本發(fā)明標(biāo)的物的蛋白質(zhì)、病毒粒子復(fù)合物、抗體和其它生物分子都是分離的或可被分離。術(shù)語“患者”、“個體”等在本文中可互換使用，且指任何可被CMV感染的動物或其活體外或原位細(xì)胞。在某些非限制性實施例中，患者或個體是人類。免疫原性或疫苗組合物的“腸外”給藥包括例如皮下(s.C.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、肌肉內(nèi)(i.m.)或胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。如本文所使用的術(shù)語“多核苷酸”定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸與多核苷酸可互換。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員一般認(rèn)為核酸是多核苷酸，其可水解成單體“核苷酸”。單體核苷酸可水解成核苷。如本文所使用的多核苷酸包括(但不限于)由所屬領(lǐng)域中可利用的任何方法獲得的所有核酸序列，所述方法包括(但不限于)重組方法(即使用普通克隆和擴(kuò)增技術(shù)等從重組文庫或細(xì)胞基因組克隆核酸序列)和合成方法。如本文所使用的術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，且指包含經(jīng)肽鍵共價連接的氨基酸殘基的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個氨基酸，且對蛋白質(zhì)或肽序列可包含的氨基酸的最大數(shù)目無限制。多肽包括包含兩個或兩個以上經(jīng)肽鍵相互連接的氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文所使用，這一術(shù)語是指短鏈(在所屬領(lǐng)域中通常也稱為肽、寡肽和寡聚物)與長鏈(在所屬領(lǐng)域中一般稱為蛋白質(zhì)，其有許多類型)?！岸嚯摹庇绕浒ɡ缟锘钚云?、實質(zhì)上同源的多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽變異體、經(jīng)修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。“醫(yī)藥學(xué)上可接受”是指就組合物、調(diào)配物、穩(wěn)定性、患者接受性和生物可用性來說，從藥理學(xué)/毒理學(xué)角度患者可接受且從物理/化學(xué)角度醫(yī)藥制備化學(xué)家可接受的性質(zhì)和/或物質(zhì)?！搬t(yī)藥學(xué)上可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物活性效果且對給藥所述載體的宿主無毒的介質(zhì)。術(shù)語“單個包裝”意思是試劑盒的組分在實體上位于一個或一個以上容器中或與所述容器相關(guān)且視為一個制備、分配、銷售或使用單元。容器包括(但不限于)袋、盒、瓶、熱縮包裝(shrinkwrappackage)、主要或附加組件或其組合?！皢蝹€包裝”還可包括虛擬組件。舉例來說，試劑盒可含有實體包裝內(nèi)部所含的簡化的實體說明書和從例如網(wǎng)站等虛擬環(huán)境獲取更詳細(xì)說明書的說明書。如本文所使用的術(shù)語“治療性”意思是治療和/或預(yù)防。通過消除、延遲、抑制、緩解或根除與CMV感染相關(guān)的疾病狀態(tài)獲得治療性作用。如本發(fā)明上下文所使用的術(shù)語“治療”打算包括對疾病或病癥的治療性治療和預(yù)防或抑制措施。因此，例如術(shù)語治療包括在疾病或病癥發(fā)作之前或之后給藥藥劑，從而預(yù)防或消除疾病或病癥的所有病征。另一實例為，在疾病臨床表現(xiàn)之后給藥藥劑以對抗疾病癥狀包含“治療”疾病。此包括例如預(yù)防CMV繁殖到生物體的未感染細(xì)胞中。短語“減弱CMV感染”在本文中有時用于指包括如臨床醫(yī)師熟知的方法所確定降低感染CMV的患者的感染程度的治療方法。描述巨細(xì)胞病毒(CMV)活體內(nèi)感染多種細(xì)胞型，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。如以上背景材料中所概述，各種研究已報導(dǎo)雖然病毒與成纖維細(xì)胞質(zhì)膜融合，但通過胞吞作用進(jìn)入視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。由于與上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物相比，在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中繁殖CMV相對容易，因此諸如上述研究等研究已使用成纖維細(xì)胞繁殖的CMV病毒株執(zhí)行。同樣，培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞通常是繁殖CMV用于臨床應(yīng)用(諸如研發(fā)用于疫苗的減毒病毒株)的所選細(xì)胞型。根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)已證明，制備CMV粒子的細(xì)胞型對CMV粒子在后續(xù)一系列感染中的特性具有重大影響。因此，例如當(dāng)迄今報導(dǎo)CMV通過胞吞作用進(jìn)入上皮細(xì)胞時，本發(fā)明發(fā)明者已證明這是在成纖維細(xì)胞中繁殖的CMV的進(jìn)入方式，而不是在培養(yǎng)上皮細(xì)胞中繁殖的CMV的進(jìn)入方式。上皮細(xì)胞繁殖的CMV主要通過與質(zhì)膜融合進(jìn)入上皮細(xì)胞。這種不同的進(jìn)入方式產(chǎn)生多種生理學(xué)結(jié)果影響感染繼續(xù)進(jìn)行的動力學(xué)且顯著影響對感染的細(xì)胞應(yīng)答。舉例來說，與經(jīng)在成纖維細(xì)胞中生長的病毒感染的細(xì)胞相比，在上皮細(xì)胞中生長的病毒引起顯著減弱的細(xì)胞應(yīng)答。許多在經(jīng)成纖維細(xì)胞中生長的病毒感染之后表達(dá)的細(xì)胞抗病毒基因在經(jīng)上皮細(xì)胞中生長的病毒感染之后不表達(dá)。因此，預(yù)測在上皮細(xì)胞中生長的CMV與疫苗和在成纖維細(xì)胞中生長的CMV的作用方式不同，從而為CMV疫苗的產(chǎn)生提供一種新穎且出乎意料多樣性來源。同樣，在CMV能夠感染的諸如內(nèi)皮細(xì)胞或特殊細(xì)胞型等其它細(xì)胞型(例如神經(jīng)元、中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的其它細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞)中繁殖CMV應(yīng)為CMV疫苗的產(chǎn)生提供其它新穎的多樣性來源。因此，本發(fā)明的一個方面提供利用與選擇繁殖病毒的細(xì)胞型相關(guān)的變化性制備CMV疫苗的方法。另一方面提供實施上述方法的試劑盒。本發(fā)明的另一方面提供預(yù)防或治療CMV感染的疫苗組合物和使用這些組合物使個體免疫的方法。下文闡述本發(fā)明這些方面的各種實施例。制備CMV疫苗的方法根據(jù)本發(fā)明的一個方面的方法包含(1)提供CMV病毒株或分離株；(2)在選定細(xì)胞型的細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖病毒株或分離株；和(3)收集通過在這一細(xì)胞型中生長所制備的CMV病毒粒子(本文中稱為“細(xì)胞型條件性CMV”以用于制備CMV疫苗。在CMV用于疫苗研發(fā)之前經(jīng)選擇用于繁殖CMV的細(xì)胞型可以是制備一定產(chǎn)量病毒粒子的容許CMV感染的任何細(xì)胞系。病毒粒子在一些測定中可能具高感染性，或粒子在許多測定中可能展現(xiàn)有限的感染性或無感染性。適合的細(xì)胞型包括(但不限于)(1)上皮細(xì)胞系，諸如本文中舉例說明的ARPE-19和其它視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(例如上皮細(xì)胞系K-1034)(Ando,Y.等人，1997，Arch.Virol.142(8)1645-1658)、源自正常人類結(jié)腸粘膜的HCMC(Smith,JD,1986,JVirol.60(2):583_588)、Caco_2腸上皮細(xì)胞(Esclatine.A.等人，2000，J.ofVirol.74(1):513_51)、SW480、HCT116、HeLa、H1299和MCF-7(關(guān)于后五者，參考Wang.D.^PΤ.Shenk,2005.J.Virol.7910330)；(2)內(nèi)皮細(xì)胞系，諸如HMEC-I，一種人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，SV-40病毒大T抗原使之永生化(Guetta.E.等人，2001.CardiovascularResearch50:538_546)、HUVEC和LMVEC(關(guān)于后兩者，參見Wang.D.和T.Shenk.2005，J.Virol.7910330)；(3)神經(jīng)元細(xì)胞，諸如SK-N-SH、SK-N-AS和IMR-32(參見Wang，D.禾口T.Shenk,2005.J.Virol.7910330)和源自多種組織/器官源的初級上皮、內(nèi)皮、平滑肌、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。能夠研發(fā)成疫苗的任何CMV或CMV的組合都適于用作這一方法的CMV源，只要其可在至少一種選定細(xì)胞型中生長。在一個實施例中，CMV是人CMV(HCMV)，為先前已分離且特性化的分離株或新穎的HCMV分離株或HCMV樣病毒。在另一個實施例中，CMV起源于另一種靈長類動物，包括(但不限于)黑猩猩(Davison.AJ等人，2003，J.Gen.Virol.8417-28)和稱猴(Hansen.SG等人，2003.J.Virol.77:6620_36；Rivailler.P等人，2006.J.Virol.80:4179-82)。CMV可以是來自選定來源的未經(jīng)修飾的病毒，或其可以是通過遺傳修飾或合并來自兩個或兩個以上不同CMV病毒株或分離株的成分制備的嵌合病毒。所屬領(lǐng)域中已知制備嵌合病毒的方法。為此目的，克隆至少6種人類CMV病毒株作為感染性細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)并測序(Murphy.E等人，2003.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:14976-14981)。BAC序列可由以下基因庫登錄號獲得AC146999(實驗室病毒株AD169，由其制備本文所述的BADrUL131變異體)；AC146851(實驗室病毒株Towne)；AC146904(臨床分離株P(guān)H)；AC146905(臨床樣分離株Toledo)；AC146906(臨床分離株TR)；和AC146907(臨床分離株FIX)。未進(jìn)行先前BAC克隆，已測序至少兩種人類CMV病毒株，且其可由以下基因庫登錄號獲得BK000394(實驗室病毒株AD169)和4￥446894(臨床分離株臨1~1化)。黑猩猩CMV病毒株的整個基因組可以基因庫登錄號AF480884獲得。也可獲得兩種獼猴CMV病毒株的基因組序列(登錄號AY186194和DQ205516)。利用本申請案的教示，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠使用任何前述序列或任何其它公開可用的CMV序列來制備嵌合CMV或?qū)MV進(jìn)行遺傳修飾。根據(jù)本發(fā)明已證明，可通過在選定細(xì)胞型上繁殖成功條件化已在成纖維細(xì)胞中重復(fù)傳代的CMV實驗室病毒株。舉例來說，如本文實例中所述，通過電穿孔將BADrUL131(一種重復(fù)傳代的AD169HCMV病毒株的UL131ORF已修復(fù)的BAC克隆)引入培養(yǎng)人類包皮成纖維細(xì)胞中，且在上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19中擴(kuò)增所得病毒制劑一次。因此，本發(fā)明的各種實施例包含使用已在不同于選擇用于條件化步驟的細(xì)胞型的細(xì)胞型中傳代的CMV(或CMV基因組)。舉例來說，可使CMV病毒株在成纖維細(xì)胞中傳代多次，隨后在上皮細(xì)胞中擴(kuò)增，此后用于制備疫苗。應(yīng)了解，CMV可在選定的細(xì)胞型中擴(kuò)增/繁殖一次或一次以上。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明方法用于制備減毒活CMV以用作疫苗。所屬領(lǐng)域中已知使病毒減毒的方法。減毒CMV優(yōu)選展現(xiàn)減弱的包括潛伏和激活的感染性和/或病原性，但仍能夠誘導(dǎo)治療或保護(hù)宿主抵抗CMV感染的免疫應(yīng)答。減毒CMV病毒株的實例包括(但不限于)實驗室病毒株，諸如AD169和Towne，其幾乎僅在成纖維細(xì)胞中復(fù)制。這些減毒病毒株，必要時經(jīng)工程改造以制備必需的表面蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物以獲得適當(dāng)?shù)内呅?，其可如以上所討論，在上皮?xì)胞中，或在成纖維細(xì)胞中生長此后在上皮細(xì)胞中生長，以用于本發(fā)明的疫苗組合物中?？墒褂迷谂囵B(yǎng)細(xì)胞、尤其成纖維細(xì)胞中連續(xù)傳代使CMV減毒?；铙w外進(jìn)行病毒感染宿主細(xì)胞的重復(fù)傳代直到充分使病毒減毒。傳代可在諸如調(diào)節(jié)的溫度、PH值、濕度等特定環(huán)境條件下進(jìn)行以選擇感染性或病原性降低的病毒。如果使用這種減毒方法，那么隨后在選定的細(xì)胞型中擴(kuò)增連續(xù)傳代的病毒一代或一代以上以制備CMV供本發(fā)明疫苗組合物使用。也可利用誘變使病毒減毒。舉例來說，根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)，可將CMV病毒粒子暴露于紫外線或電離輻射或化學(xué)誘變劑中。除用于制備嵌合病毒外，重組技術(shù)還可用于制備減毒的CMV病毒粒子。舉例來說，可使用定點誘變、基因置換或基因剔除技術(shù)來獲得感染性、病原性或潛伏性減弱的病毒株。W0/2007/038316中闡述通過剔除誘變修飾CMV的實例，其描述基因組缺失一個或一個以上潛伏促進(jìn)基因的CMV，顯現(xiàn)改變的進(jìn)入或維持潛伏狀態(tài)的能力。在其它實施例中，滅活或殺死從選定的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的CMV且用于疫苗組合物中。所屬領(lǐng)域中熟知滅活或殺死病毒的方法，例如用諸如福爾馬林(formalin)等化學(xué)品滅活或殺死病毒。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，殺死或滅活的CMV應(yīng)包含病毒粒子的所有或大部分組分，如此在疫苗組合物中維持通過在選定細(xì)胞型中擴(kuò)增所產(chǎn)生的多樣性。可使用本發(fā)明方法產(chǎn)生在不同選定細(xì)胞型中繁殖的CMV的組合，從而賦予所制備的疫苗另一層面的多樣性。在一個實施例中，使用單個CMV分離株或病毒株感染兩個或兩個以上不同類型的不同培養(yǎng)細(xì)胞系，例如視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。隨后合并通過在各別細(xì)胞型中擴(kuò)增所制備的CMV而用于單個疫苗中。在另一個實施例中，使用兩個或兩個以上不同CMV臨床分離株或病毒株感染單個選定的細(xì)胞系，且使用通過擴(kuò)增在這一細(xì)胞型中制備的多病毒株或多分離株CMV群體制備疫苗。在又一個實施例中，使用多個分離株或病毒株感染兩個或兩個以上不同類型的不同培養(yǎng)細(xì)胞系，且合并通過在各別細(xì)胞型中擴(kuò)增制備的CMV群體而用于疫苗中。本發(fā)明的另一方面提供根據(jù)上述方法制備CMV疫苗物質(zhì)的試劑盒。視使用和試劑盒組分而定，試劑盒在單個包裝的各別容器或虛擬包裝的各別容器中包含一種或一種以上選定細(xì)胞型的細(xì)胞系的等分試樣和一個或一個以上CMV分離株或病毒株或待引入選定培養(yǎng)細(xì)胞系中并在所述細(xì)胞系中擴(kuò)增的攜帶這些CMV病毒株的基因組的載體。這些試劑盒通常還含有說明書或說明書鏈接以說明如何進(jìn)行這一方法的各個步驟。試劑盒任選地還可包含培養(yǎng)基和其它適于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和病毒操作的試劑。疫苗組合物和使用方法本發(fā)明的另一方面提供免疫原性組合物(本文可互換稱為疫苗組合物)，其包含與適合的藥用載體或佐劑混合的巨細(xì)胞病毒(CMV)群體或其病毒粒子組分，其中CMV通過在例如上皮細(xì)胞培養(yǎng)物等選定細(xì)胞型中繁殖獲得。如上所提及，CMV疫苗迄今通常使用在成纖維細(xì)胞中繁殖的CMV制得。然而，根據(jù)本發(fā)明已證明，在上皮細(xì)胞中繁殖產(chǎn)生的病毒在許多不同方面與成纖維細(xì)胞中繁殖的病毒不同。上皮細(xì)胞中所制備的病毒優(yōu)先與質(zhì)膜融合，而成纖維細(xì)胞衍生的病毒主要通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入。另外，上皮細(xì)胞產(chǎn)生的病毒粒子的內(nèi)在“從外部融合”活性高于成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生的粒子，此影響感染的動力學(xué)。此外，受感染上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄概況的顯著不同的差異提供證據(jù)表明，這兩種病毒制劑引發(fā)不同細(xì)胞信號傳導(dǎo)反應(yīng)。具體來說，在上皮細(xì)胞中繁殖制備的CMV與通過在成纖維細(xì)胞中繁殖而制備的所述病毒的相同病毒株或分離株相比具有一個或一個以上以下特征。第一，如上所提及，不同之處可在于其通過與宿主細(xì)胞質(zhì)膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞。上皮細(xì)胞上所制備的CMV還顯示，與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分離的相同CMV群體相比，宿主細(xì)胞的病毒粒子介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合較多，以及與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分離的相同CMV群體相比，宿主細(xì)胞中的病毒生長加速。另外，與在成纖維細(xì)胞中繁殖的相同CMV相比，其引發(fā)的細(xì)胞應(yīng)答減弱。感染后10小時，約三分之二以下的基因(約50個基因?qū)s150個基因)展現(xiàn)2.5倍或2.5倍以上的表達(dá)水平變化。另外，上皮細(xì)胞中生長的CMV的特性可在于宿主基因的特定概況，所述基因在感染后表達(dá)發(fā)生變化(增加或減小)。實例中詳細(xì)描述這些基因表達(dá)概況，且可包括一個或一個以上由以下基因庫登錄號表示的基因的表達(dá)改變AK094860、NM_145023、ΝΜ_133492、ΝΜ_001039580、ΝΜ_00100430UNM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239,NM_001018084、NM_001037442,NM_017600,NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。在本發(fā)明的這一方面，如在本發(fā)明的上述方面，能夠研發(fā)成疫苗的CMV或CMV的組合都適于用作上述CMV群體來源，只要其可在至少一種上皮細(xì)胞系中或另一選定細(xì)胞型中生長。在一個實施例中，CMV是HCMV或HCMV樣病毒。在另一個實施例中，如上所述，CMV起源于另一種靈長類動物，包括(但不限于)黑猩猩和獼猴。如上所述，CMV可以是來自選定來源的未經(jīng)修飾的病毒，或其可以是通過遺傳修飾或合并來自兩個或兩個以上不同CMV病毒株或分離株的成分制備的嵌合病毒。在優(yōu)選實施例中，疫苗組合物包含減毒活CMV，所述減毒活CMV可利用上述方法制備，所有上述方法都為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在其它實施例中，滅活或殺死從選定的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的CMV且用于疫苗組合物中。疫苗組合物可包含不同CMV病毒株或分離株的組合以便再產(chǎn)生多樣性，所述CMV病毒株或分離株可在單個上皮細(xì)胞培養(yǎng)物上繁殖或在若干不同上皮細(xì)胞培養(yǎng)物上繁殖或在另一細(xì)胞型的細(xì)胞上繁殖。此外，可合并減毒活CMV與死或滅活CMV或CMV的免疫原性組分以制備組合疫苗，例如合并減毒活CMV與熱殺死的CMV，或合并減毒活CMV與亞單位疫苗用物質(zhì)，或合并所有三種類型的物質(zhì)。標(biāo)題為“CytomegalovirusSurfaceProteinComplexforUseinVaccinesandasaDrugTarget(用于疫苗和作為藥物靶的用途的巨細(xì)胞病毒表面蛋白復(fù)合物)”的WO2007/146024中描述適于亞單位疫苗的免疫原性CMV多肽和復(fù)合物的實例。疫苗組合物可進(jìn)一步包含一種或一種以上佐劑。佐劑可以是增強(qiáng)對疫苗中的抗原的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。適用于本發(fā)明的佐劑的非限制性實例包括弗氏佐劑(Freimd'sadjuvant)；不完全弗氏佐劑(incompleteFreund‘sadjuvant)；皂甙；表面活性劑，諸如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂(lysolecithin)、脫甲基二-十八基溴化銨、N，N-二-十八基-N'-N-雙(2-羥乙基丙二胺)、甲氧基十六基甘油、氧化異丙烯多元醇(pluronicpolyol)；聚陰離子，諸如吡喃、二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝聚胺(polybrene)、聚IC、聚丙烯酸(polyacrylicacid)、卡波普(carbopol)、乙烯馬來酸(ethylenemaleicacid)、氫氧化鋁和磷酸鋁肽；油或烴乳液等。疫苗可在水溶液(諸如水或乙醇)或生理學(xué)上相容的緩沖液(諸如漢氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或生理鹽水緩沖液(包括PBS))中調(diào)配。疫苗調(diào)配物也可制成固體型制劑，所述固體型制劑打算例如通過在即將使用之前用適合的媒劑(諸如無菌水、生理鹽水溶液或乙醇)復(fù)原，在使用前即刻轉(zhuǎn)化成適于向個體給藥的液體型制劑。疫苗組合物還可使用持續(xù)釋放媒劑或長效型制劑(cbpotpreparation)調(diào)配。這些長效作用調(diào)配物可通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如疫苗可與適合的聚合或疏水性物質(zhì)一起調(diào)配(例如調(diào)配成于可接受的油中的乳液)或與離子交換樹脂一起調(diào)配，或調(diào)配成微溶衍生物(例如微溶鹽)。可使用脂質(zhì)體和乳液作為適于供疏水性調(diào)配物使用的傳遞媒劑。視化學(xué)性質(zhì)而定，持續(xù)釋放媒劑釋放抗原的時間可在數(shù)小時至數(shù)天至數(shù)周至數(shù)月范圍內(nèi)。疫苗組合物可進(jìn)一步包括一種或一種以上抗氧化劑。例示性還原劑包括巰基丙?；拾彼?、N-乙?；腚装彼?、β-巰基乙胺、谷胱甘肽、抗壞血酸和其鹽、亞硫酸鹽或偏亞硫酸氫鈉或類似物質(zhì)。另外，抗氧化劑還可包括天然抗氧化劑，諸如維生素Ε、維生素C、黃質(zhì)素(Ieutein)、黃嘌呤、β胡蘿卜素和礦物(諸如鋅和硒)。疫苗組合物可進(jìn)一步合并其它物質(zhì)來充當(dāng)穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、潤濕劑、乳化齊U、分散劑并且合并單糖、多糖和改變滲透平衡的鹽。疫苗可進(jìn)一步包含增強(qiáng)疫苗功效的免疫刺激分子。這些分子可加強(qiáng)免疫應(yīng)答，可誘發(fā)炎癥且可以是任何淋巴因子或細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的非限制性實例包括白細(xì)胞介素(IL)-l、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13、粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞菌落刺激因子(GMCSF)、巨噬細(xì)胞炎癥因子等。疫苗可經(jīng)調(diào)配用于輸注或注射(靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、十二指腸內(nèi)、腹膜內(nèi)等)或通過輸注或注射給藥。疫苗還可通過鼻內(nèi)、陰道、直腸、經(jīng)口、局部、經(jīng)頰、經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式給藥?？捎伤鶎兕I(lǐng)域非常完善的方法憑經(jīng)驗確定治療CMV感染的有效抗原劑量。疫苗的有效劑量可取決于若干變量，包括(但不限于)個體的體型、身高、體重、年齡、性別、總體健康狀況、調(diào)配物類型、給藥模式或方式、病毒是活性的還是潛伏性的、患者是否二次感染或罹患其它相關(guān)病況。疫苗方案也可基于上述因素。疫苗接種可在個體生命周期(包括從胎兒發(fā)育成成人)的任何時候進(jìn)行。為完全保護(hù)，可能需要補(bǔ)充給藥或增強(qiáng)免疫。為確定是否已實現(xiàn)足夠的免疫保護(hù)，可在疫苗接種后監(jiān)測患者的血清轉(zhuǎn)化和抗體效價。提供以下實例以更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這個實例打算說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明。SM人類巨細(xì)胞病毒使用兩種不同途徑進(jìn)入視網(wǎng)膜餼素上皮細(xì)胞這一實例中描述的實驗結(jié)果證明，兩種不同細(xì)胞型中所制備的HCMV通過不同途徑進(jìn)入上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒粒子優(yōu)先通過在質(zhì)膜處融合進(jìn)入，而來自成纖維細(xì)胞的病毒粒子通過PH依賴性胞吞作用進(jìn)入。這兩種病毒制劑誘導(dǎo)顯著不同的細(xì)胞應(yīng)答。材料和方法生物試劑將第10至15代的人類包皮成纖維細(xì)胞(HFF)維持在含10%新生牛血清的培養(yǎng)基中。將第24至34代人類MRC-5胚胎肺成纖維細(xì)胞和ARPE-19視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(美國典型微生物菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)維持在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。使人類近端腎小管上皮細(xì)胞(hRPTEC)(Cambrex)在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長且使用第4至5代。BADwt衍生自AD169HCMV病毒株的BAC克?。籅ADrUL131(19，21)是UL131ORF已修復(fù)的BADwt衍生物；BFXwt衍生自VR1814臨床HCMV分離株的BAC克隆。通過將BACDNA電穿孔于HFF中制備病毒，且除非另作說明，否則在ARPE-19細(xì)胞或HFF中擴(kuò)增所得病毒制劑一次。通過經(jīng)由山梨醇墊(sorbitolcushion)離心部分純化無細(xì)胞的病毒粒子，且再懸浮于無血清培養(yǎng)基中。利用空斑測定(plaqueassay)測定MRC_5細(xì)胞的病毒效價。利用空斑還原測定(19)使用純化的抗PUL130單克隆抗體(3E3)(19)測定BADrULl31的中和。先前已描述抗IEl單克隆抗體1B12(21)。使用兔抗SplOO多克隆抗體(Chemicon)觀察NDlO。電鏡將ARPE-19細(xì)胞在4°C下暴露于病毒中1小時，通過用冷PBS洗滌兩次移除未結(jié)合病毒，添加生長培養(yǎng)基(37°C)15分鐘，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗細(xì)胞，固定且處理以進(jìn)行電鏡檢查，且用FEITecnai-T12顯微鏡在80kv下檢查。關(guān)于感染對內(nèi)體酸化的依賴性的測定在37°C下用NH4Cl或巴弗洛霉素AKBafilomycinAl，BFA)(Sigma)預(yù)處理ARPE-19細(xì)胞1小時，接著在抑制劑繼續(xù)存在的情況下感染。16小時后，將培養(yǎng)物固定在2%三聚甲醛中，且用0.1%曲通(Triton)X-IOO滲透。利用免疫熒光使用單克隆抗體1B12(21)加Alexa546結(jié)合二次抗體鑒別IEl，且用DAPI對核進(jìn)行染色。以表達(dá)IEl的藥物處理的細(xì)胞相對于未處理細(xì)胞的百分比計算抑制。病毒粒子蛋白質(zhì)的融合活性的分析為測定“從外部的融合”，使ARPE-19細(xì)胞生長到匯合度為90%且使之感染。在37°C下1小時后，移除接種物，且添加含200μg/ml膦甲酸(PFA)的培養(yǎng)基來抑制病毒DNA合成。通過目測檢查合胞體形成來監(jiān)測融合。使熒光素酶報告分子測定適于定量分析病毒粒子融合活性。分別用攜帶熒光素酶基因的質(zhì)粒在T7啟動子控制下和用pcDNA3-T7聚合酶質(zhì)粒通過電穿孔(效率為90-95%)制備報告分子和效應(yīng)ARPE-19細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時，以11的比率混合細(xì)胞，且在37°C下再培育16小時。隨后將混合群體在4°C下暴露于HCMV病毒粒子中1小時，此后用冷PBS洗滌單層兩次，接著添加緩沖液(含IOmM2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸和IOmMHEPES的磷酸鹽緩沖溶液(PBS))，最終pH值在4.5至8范圍內(nèi)。在37°C下3分鐘之后，移除緩沖液，且添加正常生長培養(yǎng)基。感染后6小時，溶解細(xì)胞，且使用熒光素酶報告分子測定系統(tǒng)(普洛麥格(Promega))測定熒光素酶活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的測定使匯合的ARPE-19細(xì)胞血清饑餓24小時，接著進(jìn)行模擬感染或感染。在感染后6小時或10小時，使用Trizol(英杰(Invitrogen))提取總RNA，且經(jīng)RNeasy管柱(凱杰(Qiagen))純化。擴(kuò)增RNA樣品，且用安捷倫(Agilent)低RNA輸入熒光線性擴(kuò)增試劑盒作標(biāo)記(菁-3)。為控制芯片間的變化(chiptochipvariation),給參考RNA(克隆技術(shù)(Clontech))作標(biāo)記(菁_5)且將其與由模擬感染或HCMV感染細(xì)胞制備的探針共雜交。一式兩份用Aligent人類44Κ寡核苷酸陣列進(jìn)行雜交。使用Agilent掃描儀在5微米分辨率下掃描陣列，且用安捷倫特征提取(AgilentFeatureExtraction)軟件分析圖像以確定雜交點樣和本底扣除的熒光信號的強(qiáng)度。使用AgilentGeneSpringGX軟件歸一化和定量相對RNA變化。結(jié)果成纖維細(xì)胞衍生的病毒粒子激活A(yù)RPE-19細(xì)胞中的即刻早期基因表達(dá)，其中動力學(xué)比上皮細(xì)胞衍生的病毒粒子慢。AD169HCMV病毒株(BADwt)因UL131基因突變而在ARPE-19上皮細(xì)胞中不良復(fù)制(10，21)。制備BADrUL131的AD169突變的修復(fù)通過制備成功進(jìn)入上皮細(xì)胞中所需的gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131病毒粒子糖蛋白復(fù)合物(19，20)，使這些細(xì)胞的趨性恢復(fù)(21)。在ARPE-19上皮細(xì)胞中生長的BADrUL131(印iBADrUL131)啟動上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)程序的速度大于在HFF成纖維細(xì)胞中生長的BADrUL131(fibroBADrUL131)(圖1A)。當(dāng)ARPE-19細(xì)胞受印iBADrUL131感染時，約17%的細(xì)胞在感染后(hpi)6小時表達(dá)可檢測的IEl蛋白。IEl表達(dá)的同時伴隨核中NDlO的破壞。相比之下，fibroBADrUL131感染在感染后6小時僅在2.8%的ARPE-19細(xì)胞中引起IEl表達(dá)。然而，表達(dá)IEl的細(xì)胞的數(shù)目隨時間增加。經(jīng)兩種細(xì)胞型中制備的病毒感染后24小時，表達(dá)IEl的ARPE-19細(xì)胞的百分比并無顯著差異(圖1B)。在HFF中所制備的病毒粒子相對于在ARPE-19細(xì)胞中制備的病毒粒子通過不同途徑進(jìn)入ARPE-19細(xì)胞。電鏡檢查病毒進(jìn)入來確定是否ARPE-19細(xì)胞衍生的病毒相對于HFF衍生的病毒的IEl積聚的不同動力學(xué)由病毒基因表達(dá)開始之前的事件引起。在4°C下使得與epiBADrUL131或fibroBADrUL131—起培育的ARPE-19細(xì)胞附著于細(xì)胞表面，且培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變到37°C歷時15分鐘以內(nèi)化，之后處理以進(jìn)行鏡檢。每個樣品檢查40-50個細(xì)胞，至少90%的細(xì)胞顯示完整的病毒粒子或衣殼。各細(xì)胞中病毒粒子的數(shù)目在2-8個不等，大多數(shù)細(xì)胞顯示2-3個粒子。在受印iBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)病毒粒子幾乎僅位于細(xì)胞表面，約97%的病毒粒子在頂膜上。一些粒子靠近細(xì)胞，但這部分未顯示接觸的證據(jù)(圖2A，圖a)，且在融合過程中，其它粒子被捕捉在質(zhì)膜上(圖2A，圖b和圖C)。很少觀察到膜內(nèi)表面下面的衣殼，實際上，僅鑒別到兩個實例(圖2A，圖d和圖e)。細(xì)胞內(nèi)部未發(fā)現(xiàn)包膜的病毒粒子。這一結(jié)果表明，印iBADrUL131通過與質(zhì)膜融合進(jìn)入ARPE-19細(xì)胞。相反，經(jīng)fibroBADrUL131感染的細(xì)胞在細(xì)胞膜上(約占總數(shù)的65%)和細(xì)胞內(nèi)部在囊泡中(約占總數(shù)的35%)含有病毒粒子(圖2B)。囊泡內(nèi)的粒子被包膜，表明其通過胞吞作用進(jìn)入。還檢查在成纖維細(xì)胞中繁殖的BFXwt臨床分離株的進(jìn)入。這一臨床分離株積聚在ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的囊泡中(圖2C)，表明BADrUL131作為HCMV臨床分離株的細(xì)胞進(jìn)入模型是有效的。成纖維細(xì)胞衍生的病毒對ARPE-19細(xì)胞的感染是pH依賴性的，但上皮細(xì)胞衍生的病毒不是。許多通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的病毒(1，4，10)需要酸化內(nèi)體以便病毒粒子包膜與內(nèi)體膜融合并將衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中。測試緩沖內(nèi)體PH值的NH4Cl和阻斷內(nèi)體ATP酶質(zhì)子泵的巴弗洛霉素Al(BFA)對ARPE-19細(xì)胞感染的影響。用任一試劑預(yù)處理之后，感染細(xì)胞且在含藥物培養(yǎng)基中再培養(yǎng)16小時。通過測定IEl陽性細(xì)胞對成功的感染進(jìn)行評分。與上述超微結(jié)構(gòu)分析一致，用任一試劑預(yù)處理僅對epiBADrUL131感染產(chǎn)生適度影響(圖3A)。相反，這兩種試劑在fibroBADrUL131感染之后以劑量依賴性方式抑制IEl表達(dá)，表明成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的病毒的進(jìn)入取決于內(nèi)體酸化。所述試劑對印iBADrUL131的進(jìn)入幾乎不產(chǎn)生影響的事實顯示對fibroBADrUL131的抑制不是由毒性產(chǎn)生。接著，確定在其它類型上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中生長的病毒是否顯示與ARPE19衍生的病毒粒子和HFF衍生的病毒粒子相同的性質(zhì)。在用NH4Cl或BFA處理之后，使用來自hRPTEC上皮細(xì)胞和MRC-5成纖維細(xì)胞的病毒母液(virusstock)感染ARPE-19細(xì)胞，且其對抑制劑的反應(yīng)完全與在ARPE-19細(xì)胞或HFF中生長的病毒相同(圖3B，左圖)。因此，在兩種不同成纖維細(xì)胞中制備的BADrUL131對抑制劑的敏感性實質(zhì)上大于在兩種不同上皮細(xì)胞系中制備的病毒。還測定內(nèi)體pH值對BFXwt臨床分離株進(jìn)入ARPE-19細(xì)胞的影響(圖3B，右圖)。雖然NH4Cl或BFA顯著降低因受成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的BFXwt感染制備的IEl陽性ARPE-19細(xì)胞的數(shù)目，但經(jīng)上皮細(xì)胞衍生的BFXwt感染之后，僅觀察到輕微的抑制。上皮細(xì)胞中制備的病毒粒子的內(nèi)在融合活性大于成纖維細(xì)胞中制備的病毒粒子。其它皰疹病毒的情況也是這樣。HCMV臨床分離株促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞融合，所述融合早在感染后3-5小時即可檢測到。無需從頭合成病毒包膜蛋白而快速產(chǎn)生合胞體表明，此受“從外部融合”促進(jìn)，從外部融合是一種包膜的病毒粒子直接融合靶細(xì)胞的過程。因為上皮細(xì)胞中制備的BADrUL131相對于成纖維細(xì)胞中制備的BADrUL131以不同方式進(jìn)入上皮細(xì)胞中，所以測試其會展現(xiàn)不同的“從外部融合”活性的可能性。模擬感染的ARPE-19細(xì)胞不展現(xiàn)合胞體(圖4A)，且在經(jīng)fibroBADrUL131感染后，合胞體也很罕見(圖4B)。相反，暴露于epiBADrUL131之后，早在感染后6小時即檢測到細(xì)胞-細(xì)胞融合，且在感染后24小時，20-30%的核聚集在合胞體中(圖4C)。用阻斷發(fā)展成感染晚期的PFA處理細(xì)胞，因此融合必定已被印iBADrUL131粒子誘發(fā)，但未被新表達(dá)的病毒粒子蛋白誘發(fā)。使用熒光素酶報告分子測定定量病毒粒子的融合活性以及pH值對從外部融合的影響。報告分子和效應(yīng)細(xì)胞各別接受由T7啟動子驅(qū)動的含熒光素酶基因的質(zhì)?；騎7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒?；旌线@兩種ARPE-19衍生物，且通過測定熒光素酶表達(dá)定量感染依賴性融合，epiBADrUL131誘導(dǎo)的融合活性始終高于fibroBADrUL131(圖4D)。在pH7-8時，fibroBADrUL131的活性是印iBADrUL131的活性約三分之一。當(dāng)病毒吸附后用低pH值緩沖液處理細(xì)胞時，這兩種病毒制劑介導(dǎo)適度增強(qiáng)的融合。在這一測定中，BADwt不誘導(dǎo)融合。進(jìn)入的方式不改變HCMV細(xì)胞趨性。如以上所討論，取決于感染病毒在哪種細(xì)胞中制備，皰疹病毒優(yōu)先偏愛進(jìn)入特定細(xì)胞型。這一現(xiàn)象不同于如上所述所觀察到的現(xiàn)象，即來自不同細(xì)胞型的HCMV制劑利用不同機(jī)理進(jìn)入上皮細(xì)胞。盡管如此，不同進(jìn)入機(jī)理仍有可能會影響復(fù)制效率和產(chǎn)率，從而產(chǎn)生趨性作用。因此，進(jìn)行實驗以確定進(jìn)入方式是否影響上皮細(xì)胞上的HCMV空斑產(chǎn)生，與成纖維細(xì)胞作比較(表1)。在ARPE-19、hRPTEC、HFF或MRC-5細(xì)胞中制備BADrUL131母液，且測定ARPE-19或MRC-5細(xì)胞上的空斑形成(表1)。雖然ARPE-19上產(chǎn)生的空斑稍多于MRC-5細(xì)胞，但上皮細(xì)胞衍生的病毒與成纖維細(xì)胞衍生的病毒相較于另一細(xì)胞型都不優(yōu)先在一種細(xì)胞型上產(chǎn)生空斑。表1.ARPE19和MRC5細(xì)胞(XlO5個)中的上皮細(xì)胞衍生或成纖維細(xì)胞衍生的BADrULl31的效價測定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a使用最初在HFF中測定效價的2XIO5PfuBADrULl31來感染ARPE-19或MRC5細(xì)胞。bARPE-19效價相對于MRC5效價之比。pUL130特異性抗體阻斷上皮細(xì)胞衍生和成纖維細(xì)胞衍生的病毒對ARPE-19的感染。中和上皮細(xì)胞的HCMV感染(19)的PUL130特異性抗體能夠阻斷由任一進(jìn)入方式對ARPE-19的感染(圖5A)。其以劑量依賴性方式抑制這兩種病毒的感染，但epiBADrUL131對中和的敏感性稍大于fibroBADrUL131?？贵w抑制這兩種進(jìn)入方式的能力增強(qiáng)了如下結(jié)論無論融合發(fā)生在質(zhì)膜上還是內(nèi)體膜上，含PUL130的復(fù)合物都起作用。先前已報導(dǎo)，gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131復(fù)合物不為內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞內(nèi)化HCMV所必需，因為缺乏這一復(fù)合物的實驗室病毒株有效被胞吞(10)。然而，與內(nèi)體膜的后續(xù)融合和逸入細(xì)胞質(zhì)中需要這一復(fù)合物。與這些早期結(jié)果一致，當(dāng)針對ARPE-19細(xì)胞測定時，PUL130的抗體不阻斷印iBADrUL131、fibroBADrUL131或BADwt的結(jié)合或內(nèi)化(圖5B)。然而，內(nèi)化的成纖維細(xì)胞衍生的病毒的總量低于上皮細(xì)胞衍生的病毒的總量。這可能反映內(nèi)化率降低，此可與成纖維細(xì)胞衍生的病毒延遲IEl表達(dá)的開始一致(圖1)。印iBADrUL131和fibroBADrUL131在ARPE-19細(xì)胞中誘導(dǎo)不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如同許多其它病毒，HCMV調(diào)節(jié)進(jìn)入期間的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)變更的一個結(jié)果是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組顯著變化，此實質(zhì)上由病毒粒子糖蛋白與宿主細(xì)胞接觸所引起。因此，研究這兩種進(jìn)入途徑對ARPE-19細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響。模擬感染或用epiBADrUL131或fibroBADrUL131感染細(xì)胞，且6小時或10小時后純化總RNA。通過使用微陣列分析相對RNA水平，并且鑒別相對于模擬感染對照組水平變化>2.5倍的感染細(xì)胞RNA(表2-5)。用圖6A中的文氏圖描繪表達(dá)增加或減小的RNA的分布。表2.感染后6小時，由經(jīng)印iBADrUL131感染的ARP19細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3.感染后6小時，由經(jīng)fibroBADrUL131感染的ARP19細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>NM_0026583.09ATF;UPA;URK;u-PANM_0182843.076FUl0961;DKFZp686E0974;DKFZp686L15228NM—0002013.022BB2;CD54;P3.58NM—0059233.007ASKl;MEKK5;MAPKKK5NM_0188363.001MOT8;SHREWl;SHREW-1;RP3-426F10.1NM_0045562.971IKBENM_0220442.955SDF2L1NM_0066112.954Ly49;KLRA#;LY49L:Ly-49L;MGC126520;MGC126522NM_0143142.935RlG-I;FLJ3599;DKFZp434Jllll;DKFZp686N19181NM—0038972.906DIF2;IEX1;PRG1;DIF-2;GLY96;IEX-1;IEX-ILNM_0064172.899p44;MTAP44NM_0061872.877ρ100;MGC133260NR_0021862.876DKFZp58611420NM_0330362.872GAL3ST2;GAL3ST-3;MGC142112;MGC142114NM_0143312.86xCT;CCBRlNM_0037862.831MLP2;MRP3;ABC31;MOAT-D;cMOAT2;EST90757NM_0015112.829GRO1;GROa:MGSA;NAP-3;SCYB1;MGSA-a;MGSAaNM_0001892.827HKII;HXK2;DKFZp686M1669NM_0019012.821CCN2;NOV2;HCS24;IGFBP8;MGC102839NM—0312172.811DKFZP434G2226NM—0028492.766PTPRQ;EC-PTP;PCPTPl;PTP-SL;PTPBR7NM_0198912.764EROILBNM_0022342.745HK2;HCKl;PCNl;HPCNl;KV1.5;MGCIl7058;MGCIl7059NM_1985692.739DREG;VIGR;PSITP2NM_0207992,726AMSH-FP;AMSH-LP;ALMa;FLJ31524;KIAAl373等NM—0146322.726KIAA0750;MICAL2PY1;MICAL2PV2NM—1829202.721FLJ42955;KIAA1312NM_0034832.715BABL;LIPO;HMGIC;HMGI-CNM_1334922.706ACER1;MGC138327;MGC138329CR5983642.633ENST00000370238NM_0009702.62TXREB1；SHUJUN-2;TAXREB107NM_0054442.617RCDl;CNOT9;RCDl+NM_1943032.614NM—194303NM_0153592.612ZIP「4;cigl9;LZT-Hs4;KIAA0062NM_0163542.608POAT;OATP1;OATP-E;OATP4A1;OATPRP1;SLC21A12NM:0150092.607LNX3;SEMACAP3AK1249412.602AK124941NM—0015482.602G10P1;IFI56;ISG56;IFI-56;IFNAI1;RNM561;GARG-16NM_1450232.597FLJ32762;DKFZp686N0559;RP11-479G22.1NM_0230702.592FU34293;RP11-656D10.1NM_0019022.584MGC9471NM_0042332.563BL11;HB15NM_0206832.562A3AR;AD026;bA552Ml1.5;RPl1-552M11.7NM_0319382.56FLJ34464;B-DIOX-IINM_1526492.55FLJ34389BC0482632.543LOC146909XM—2103652.527LOC284288NM_0071072.515TRAPG;SSRyNM_002B372.513PTPB;HPTPB;FLJ44133;MGC59935;ΗΡΤΡ-β;NM_1723452.505NM_172345NM_0026090.4JTKl2;PDGFR;CD140B;PDGFRl；PDGF-R-βNM_1983530.4KCTD8NM_0035580.394MSS4;STM7NM_0010109110.392bA418C1.3NM_0176440.391DREl;FLJ25796NM_0528920.388FLJ45333;DKFZp686J19100NM_1758680.387MAGE6;MAGE3B;MAGE-3b;MGC52297NM—0072820.38RZF;MGCl3689NM—0051850.38CLPNM—0219900.378GABREAK0551560.375FLJ30594;MGC120893;DKFZp761K2322AF0859680.375AF085968NM_0195550.371GEF3;STA3;XPLN;MGCl18905;DKFZP434F2429NMl0042940.368RFI;MTTRFl;MGC47721NM_1730390.365AQPXlBU9437300.364BU943730NM_0176000.364DKFZp434M0331NM:0072820.36RZF;MGC13689AL7137430.357FLJ42875;MGC35434;DKFZp761G0122NM_0073140.347ARG;ABLLAK0561900.345WHRN;CIP98;USH2D;KIAAl526;RP11-9M16.1;DKFZP434N014NM_0003720.345OCAIA;OCAIABCO—159290.338RVR;BD73;HZF2:EAR-Ir;Hs.37288NM_0123770.328OR7C3;OR19-18;CIT-HSP-87M17NMJ384400.324SLITL2NM_0010180840.317NM—001018084NM_0008080.311MGC33793NMl0332600.31HFHlNM_0221600.309DMO;MGC163307;MGC163309BC0_185970.308BCOl8597NM_1984040.305bA321C24.3KM_0240500.303DDAl;PCIAI;MGC2594NM:0314660.299NIBP;Tl;IBP;MGC4737;MGC4769;KIAAl882NM=Ol68310.287GIGl3NM—0221150.251PFMl5;ZNF298;C21orf83NM:0161250.249LOC51136;MGCl11090NM:0021040.242TRYP2NmIo132610.236LEM6;PGC1;PGCIA;PGC-lv;PPARGC1;PGC-1(a)NM:0021670.211HEIR-INMl0321880.204MOF;hMOF;FLJ14040BX3609330.197SLC25A5NM_0038620.194ZFGF5;FGF-18NM_1735500.148FLJ39267;FLJ46740;MGC50805NMl0041850.135WNT13;XWNT2將‘fibroBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞的經(jīng)標(biāo)記RNA雜交的微陣列靶與模擬感染細(xì)胞作比較，且列出水平變化>2.5倍的探針組。列出基因庫編號、變化倍數(shù)和基因名稱。表4.感染后10小時，由經(jīng)印iBADrUL131感染的ARP19細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>AK0948605.688AK094860NM_1450234.19FLJ32762;DKFZp686N0559;RPl1-479G22.1NM_1334923.456ACER1;MGC138327;MGC138329ΝΜ_0010395803.352ASAP;FLJ21159NM_0010043012.982FLJ16542;FLJ34141NM_0010342.911R2;RR2MAI3695252.764AI369525AK1230662.753AKl23066NM_0053452.729HSP72;HSPAl:HSPA1B;HSP70-1NM—0207312.712AHH;AHHR;KIAA1234BC0717972.631BC071797NM_0034142.609HZF2NM—0008002.576AFGF;ECGF;FGFA;ECGFA;ECGFB;HBGFI;GLI0703等NM_1384672.571Clorfl71;FLJ40918AK0908032.557SRrp35;FLJ14459;FLJ33484;FLJ41221;RPl1-63L7.3AL1331182.529AL133118NM—0011652.508AIP1;API2;MIHC;CIAP2;HAIP1;HIAP1;MALT2;RNF49BGOOl0370.392TXNRDlNM—0248610.388FLJ22671;MGC150431;MGC150432NM_00]0430.385NET;NATl;NETl;SLC6A5NM—0162390.384DFNB3;MYOl5;DKFZp686N18198NM—0010180840.383NM_001018084NM—0010374420.381RIPX;KIAA0871NM—0176000.377DKFZp434M0331NM—0220970.369LOC63928NM_1758680.356MAGE6;MAGE3B;MAGE-3b;MGC52297NM_0322660.342DKFZp434G118;DKFZp781D2023NM_0038410.342LIT;DCRI;TRID；CD263;TRAILR3;MGC149501;MGC149502NM—0050390.339PM;PMF;PMS;Ps1;Ps2;PRB1L;PRBlMNMJ450510.339MGC4734;FLJj1197NM_0042940.336RFl;MTTRF1;MGC47721AW8560730.335AW856073NM_0240500.327DDAl;PCIAl;MGC2594AF0859680.327AF085968NM_0809270.318ESDN;CLCPlNM_0221150.317PFM15;ZNF298;C21orf83AK0567030.309L0C219731NM_0008080.301MGC33793NM_0123770.299OR7C3;OR19-18;CIT-HSP-87M17AOPl;MER5;AOP-I;SP-22;PRO1748;MGC24293;NM—0067930.298MGC104387NM_0314660.289NIBP;Tl；IBP;MGC4737;MGC4769;KIAAl882NM_0051850.286CLPNM_1391730.286MGC131641BX3609330.28SLC25A5NM_0161250.269LOC51136;MGCll1090NM_0021040.251TRYP2NM—0321880.248MOF;hMOF;FLJ14040NM_0041850.245WNT13;XWNT2L0125JNM—0048430.237CRLl;TCCR;WSXl;IL27R;zcytorlNM_1735500.208FLJ39267;FLJ46740;MGC50805將與印iBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞的經(jīng)標(biāo)記RNA雜交的微陣列靶與模擬感染細(xì)胞作比較，且列出水平變化≥2.5倍的探針組。列出基因庫編號、變化倍數(shù)和基因名稱。表5.感染后10小時，由經(jīng)fibroBADrUL131感染的ARP19細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>AK09486011.26AK094860NM_0330668.751DLG6;ALS2CR5NMJ450236.529FLJ32762;DKFZp686N0559;RP11-479G22.1NM一1523774.463FLJ44073;MGC34837NMl0023104.386SWS;SJS2;STWS;CDl18NR_0012794.051LOC164380;MGC26611;MGC26924NM_0053454.008HSP72;HSPAl;HSPA1B;HSP70-1NM~0064173.879p44;MTAP44NM~0176383.783p28b;FLJ20045NM_0011653.695AIP1;API2;MIHC;CIAP2;HAIPl;HIAP1;MALT2;RNF49NM:0006403.659IL-13R;IL13BP;CD213A2NM:0016733.313TSllNM_0025263.274NT;eN;NT5;ΝΤΕ;cNT;CD73;E5NTNM二0037863.244MLP2;MRP3;ABC31;MOAT-D;cMOAT2;EST90757NM_0055273.229hum70t;HSP70-HOMNM~0183723.224RIF1;FLJ11269;RP11-96K19.1NM_1334923.16ACER1;MGC138327;MGC138329NM_0331603.101FLJ32813;MGC35232;DKFZp572C163DB3182103.094DB318210NM_1827513.093CNA43;PR02249;MGC126776NMJ809893.089ITRNM_0053453.048HSP72;HSPAl;HSPA1B;HSP70-1NMl0053453.029HSP72;HSPAl;HSPA1B;HSP70-1NM_0002122.993CD61;GP3A;GPIIIaNM_1458672.991MGC33147NM_0218132.976BACH2NM_0061872.943plOO;MGC133260CR5942002.942LOC643837NM—0124192.941RGSZ2;RGS-17;hRGS17AF0381942.923AF038194NM一0186642.921SNFT;BATF3;JUNDMlNM_0175772.907FLJ35862;FLJ40464NMJ446332.887ELK;ELK1;elk3;Kvl2.1NM_1446202.86MGC14816;DKJZp31301122NM_0010043012.859FLJ16542;FLJ34141NM_0028522.847TSG-14;TNFAIP5NMl0071072.839TRAPG;SSRyNM—0327782.836MDIG;N052;MINA53;FLJ14393;DKFZp76201912NM_0325232.8280RP6;FLJ36583;MGC59642NM_0055152.808HB9;SCRAl；HOXHB9NM_0022012.804CD25;HEM45NMJ526492.799FLJ34389NMl0330362.794GAL3ST2;GAL3ST-3;MGC142112;MGC142114NM:0065092.791I-RELNM_0042332.789BL11;11B15NM_1809892.772ITRNM_0209882.735GNAO;G-ALPHA-o;DKFZp68600962U163072.687GLIPR;RTVP1；CRISP7NM_0037062.672CPLA2-y;DKFZp586C0423NM_1536892.662FLJ38973NM_0008002.653AFGF;ECGF;FGFA;ECGFA;ECGFB;HBGFl;GLI0703_等BC0432122.643LOC402125NM_0026702.619I-PLASTINNM_1524082.614FLJ35779;MGC120442;MGC120443;MGC120444NMJ989512.613TG2;TGCNM^O123292.595MMA;PAQRllNMIOO10099542.589FLJ20105;MGC131695NMl0322282.585FARl;FLJ22728;FLJ33561AI3695252.584AI369525NM_0041702.583EAACI;EAAT3NM_0029302.571RIN;RIBA;ROC2AK0238562.569LOC339803NM_0245252.558FLJ22584NM—1526492.553FLJ34389NM_1817952.552PRKACN2;FLJ23817BC0391512.549PABPCIL;FLJ42053;dJ1069P2.3NM_0065472.525IMP3;KOC1;IMP-3;VICKZ3;DKFZp686F1078NMl0006412.521AGIF;IL-IlNM_1453062.506C10orf35AK0218040.398AK021804NM_0072110.397HoJ-1;C12orf2NM=2034340.397MGC70833;bA247A12.2NM_0003620.397SFD;K222;K222TA2;HSMRK222AK0567030.395LOC219731NM_0035580.395MSS4;STM7NM_0168310.394GIGl3NM—0248610.394FLJ22671;MGC150431;MGC150432BF5T45130.393BF514513NR_0028190.392MALAT-IΝΜ~0026090.391JTKl2;PDGFR;CD140B;PDGFRl；PDGF-R-βNMIo180270.391FRMD4;FLJ10210;K1AA1294;bA295P9.4NM:0010109110.39bA418C1.3AW4445530.389FAM84BAK0561900.388WHRN;CIP98;USH2D;KIAAl526;RP11-9M16.1NM_1758680.385MAGE6;MAGE3B;MAGE-3b;MGC52297AB0514310.385KIAA1644;MGC125851;MGC125852NM_0010036830.384HCAMI;HSPDE1A;MGC26303NM_0042940.384RFI;MTTRFI;MGC47721NM—0065160.383GLUT;GLUT1;MGC141895;MGC141896BXl049990.382BXl04999AL7137430.381FLJ42875;MGC35434;DKFZp761G0122NM_0003220.381RDS;RP7;rd2;AVMD;PRPH;AOFMD;TSPAN22NM_0073140.381ARG;ABLLNM_0183710.376ChGn5FLJl1264;p4GalNAcTNR0028020.376TncRNADB5272710.376DB527271NM_0063930.374LKEBL;bA56H7.1;MGC119746;MGC119747NM_0139890.372D2;5DII;SclY;TXDI2NM_0176000.37DKFZp434M0331BCO115950.369NMB;HGFINAF0859680.366AF085968BCO185970.365BC018597NM_0147290.362TOXl;KIAA0808NM—0010039400.362FLJ00065NM_0003720.358OCAIA;OCAIANM二0195550.358GEF3;STA3;XPLN;MGCl18905;DKFZP434F2429NM_0221150.357PFM15;ZNF298;C21oriB3NM_1983530.355KCTD8NM:0324340.355KIAA1805;MGCl11046AK0553860.355AK055386NM_0069330.352SMIT;SMIT2CR6221100.35CR622110AW8560730.347AW856073NM_0150740.345KLP;CMT2;CMT2A;CMT2A1;HMSNIINM_0328660.342JACOP;FLJ14957;KIAA1749;MGC138254NM:0123770.342OR7C3;OR19-18;CIT-HSP-87M17NM_0052610.341KIR;MGC26294AK0233910.339AK023391NM_0022140.339ITGB8NM_1827280.339LAT2;LPI-PClNM_0240500,338DDAl;PCIAl;MGC2594NM_0051850.338CLPNM_0166130.337AD021;AD036;FLJ38155;DKFZp434L142NM:0007820.336CP24;CYP24;MGC126273;MGC126274;P450-CC24NM_0016240.335ST4NM_0072820.333RZF;MGC13689NM~0010374420.327RIPX;KIAA0871NM_0043180.32BAH;HAAH;JCTN;junctin;CASQ2BP1BU9437300.32BU943730NM_2058490.319FLJ40182NM_0008080.315MGC33793NM_0332600.313HFHI0.309OT-RNM_0321880.309MOF;hMOF;FLJ14040BX3609330.306SLC25A5NM—0143510.304NST;BRSTLl;SULTX3;BR-STL-1;MGC40032;DJ388M5.3等NM_0021670.3HEIR-INM:0010330860.298dJ631M13.5;RP11-189J1.1NM一0003720.292OCAIA;OCAIANM=OOl0029260.289TWISTNBAK0941430.288C14orf78;KIAA2019NM_0044660.287GPC5ΝΜ:0314660.276NIBP;Tl;IBP;MGC4737;MGC4769;KIAAl882NMl0132610.271LEM6;PGC1;PGClA;PGC-lv;PPARGC1;PGC-I(a)NM=0006930.267ALDH6;RALDH3;ALDIIIA6NM~0161250.26LOC51136;MGC111090ΑΚ1~243900.23AK124390NM_0021040.228TRYP2NM_0053410.209HKR3;pp9964NMJ730820.202FLJ27258;FLJ37625;FLJ45012NM=I735500.191FLJ39267;FLJ46740;MGC50805NM_0041850.133WNT13;XWNT2NM~0217270.0415CYB5RP;LLCDL3將與fibroBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞的經(jīng)標(biāo)記RNA雜交的微陣列靶與模擬感染細(xì)胞作比較，且列出水平變化>2.5倍的探針組。列出基因庫編號、變化倍數(shù)和基因名稱。印iBADrUL131感染后6小時，與模擬感染細(xì)胞相比，47個RNA的水平發(fā)生變化；且相對于模擬感染細(xì)胞，fibroBADrUL131感染細(xì)胞的121個RNA改變。這兩種病毒的調(diào)節(jié)的RNA組實質(zhì)上不同；經(jīng)印iBADrUL131或fibroBADrUL131感染后，僅19個RNA改變。雖然可能在數(shù)種情況下基因會因一種病毒而改變>2.5倍，而另一種病毒誘導(dǎo)低于這一臨界值的更適度改變，但對數(shù)據(jù)的檢查表明這并不常見。感染后10小時，印iBADrUL131調(diào)節(jié)的宿主細(xì)胞RNA的數(shù)目僅稍有增加(50個RNA)，而fibroBADrUL131觀察到的較大幅度的增加(153個RNA)。此后，這兩種病毒調(diào)節(jié)的RNA數(shù)目增加的程度有限(28個RNA)。微陣列結(jié)果由1個未改變的RNA和6個因感染而改變的RNA的實時RT-PCR得到證實(圖6B)。為進(jìn)一步比較fibroBADrUL131與印iBADrUL131對RNA水平的調(diào)節(jié)，使用包含以下四個基因本體(GeneOntology)組的基因列表過濾陣列結(jié)果宿主-病原體相互作用(GO=0030383)、細(xì)胞通訊(G0=0007154)、病毒生命周期(G0=0016032)以及細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)(G0=0007267)。在fibroBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞中調(diào)節(jié)大于2.5倍的約三分之一的mRNA(222個中的70個)出現(xiàn)在并入的組中(表6)。與之形成鮮明對比，在這四個基因本體組中僅發(fā)現(xiàn)印iBADrUL131誘導(dǎo)的86個RNA中的1個。這兩種病毒制劑在感染上皮細(xì)胞后產(chǎn)生實質(zhì)上不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。表6.經(jīng)fibroBADrUL131修飾的細(xì)胞RNA水平基因庫I變化倍數(shù)I變化倍數(shù)I基因名稱_6hpi_IOhpi__NM_0065097.0082.791I-RELNL2;ARP4;FIAF;PGAR;HFARP;ppl158;NM_1393146.6792.067ANGPTL2NM_0029825.977ncHCl1;MCAF;MCPl;MCP-I;SCYA2;GDCF-2等NM_0002124.922.993CD61;GP3A;GPIIIaNM_002310nc4.386SWS;SJS2;STWS;CD118NM_0044644.1832.264HBGF-5;Smag-82NM_0211014.072ncCLD1;SEMP1;ILVASCNM_0068514.072.364GLIPR;RTVPl;CRISP7NM_0053473.648ncBIP;MIF2;GRP78;FLJ26106Ul63073.362.687GLIPR;RTVPl:CRISP7NM_0008003.3352.115AFGF;ECGF;FGFA;ECGFA;ECGFB;HBGFl等NM_002526nc3.274NT;eN;NT5;ΝΤΕ;eNT;CD73;E5NTNM—005527nc3.229hum70t;HSP70-HOMNM_0020533.21ncGBPlNM_1809893.117ncITRNM_0006403.1163.659IL-13R;IL13BP;CD213A2NM_0026583.09ncATF;UPA;URK;u-PANM_180989nc3.089ITRNM_0182843.0762.185FLJ10961;DKFZp686E0974;DKFZp686L15228NM_005345nc3.048HSP72;HSPA1;HSPA1B;HSP70-1NM_0002013.022ncBB2;CD54;P3.58NM0045562.971ncIKBENM_0066112.9542.263Ly49;KLRA#;LY49L;Ly-49L;MGC126520等RIG-I;FLJl3599;DKFZp434JllllNM—0143142.9352.071DKFZp686N19181NM—0038972.906ncDIF2;IEX1;PRG1;DIF-2;GLY96;IEX-1;IEX-ILNM_0064172.8993.879p44;MTAP44NM_144633nc2.887ELK;ELK1;elk3;Kvl2.1NM_0061872.8772.943plOO;MGC133260NM_032778nc2.836MDIG;N052;MINA53;FLJ14393;DKFZp76201912MLP2;MRP3；ABC31；MOAT-D;cMOAT2NM—0037862.8313.244EST90757NM_0015112.829ncGROl;GROa;MGSA;NAP-3;SCYBl;MGSA-a等NM—0019012.821ncCCN2;NOV2;HCS24;IGFBP8;MGCl02839NM_0028492.766ncPTPRQ;EC-PTP;PCPTP1;PTP-SL;PTPBR7NM—0022342,745ncHK2;HCKl;PCN1;HPCN1;KV1.5;MGC117058等NM_1985692.7392.182DREG;VIGR;PSITP2NM_0009702.62ncTXREB1；SHUJUN-2;TAXREB107NM_198951nc2.613TG2;TGCNM—0153592.612DCZIP14;cigl9;LZT-Hs4;KIAA0062NM—0015482.602ncG10P1;1F156;1SG56;IFI-56;IFNAI1;RNM561等NM_012329nc2.595MMA;PAQRllNM_002930nc2.571RIN;RIBA;ROC2NM_0042332.5632.789BL11;HB15NM_0206832.562ncA3AR;AD026;bA552Ml1.5;RPl1-552M11.7NM—181795nc2.552PRKACN2;FLJ23817NM_006547nc2.525IMP3;KOCI;IMP-3;VICKZ3;DKFZp686F1078NM_000641nc2.521AGIF;IL-IlKM_1723452.505ncNM_172345NM_0124192.3592.941RGSZ2;RGS-17;hRGS17NM_0209882.1882.735GNAO;G-ALPHA-o;DKFZp68600962NM_0022012.0282.804CD25;HEM45NM_0043180.4950.32BAH;HAAH;JCTN;junctin;CASQ2BP1NM_0139890.4920.372D2;5DII;ScIY;TXDI2NM_0052610.4680.341KIR;MGC26294NM_0009160.4340.309OT-RNM_0143510.4080.304NST;BRSTL1;SULTX3;BR-STL-1;MGC40032等NM—0026090.40.391JTK12;PDGFR;CD140B;PDGFR1;PDGF-R-βNM—007211nc0.397HoJ-1;C12orf2NM_001003683nc0.384HCAMl;HSPDElA;MGC26303NM_006516nc0.383GLUT;GLUTl;MGC141895;MGC141896NM_000322nc0.381RDS;RP7;rd2;AVMD;PRPH;AOFMD;TSPAN22NM—0219900.3780.49GABRENM_018371nc0.376ChGn;FLJ11264;p4GalNAcTNM_0195550.3710.358GEF3;STA3;XPLN;MGC118905;DKFZP434F2429NM_0073140.3470.381ARG;ABLLNM_002214nc0.339ITGB8NM_182728nc0.339LAT2;LPI-PCIBC0159290.3380.453RVR;BD73;HZF2;EAR-Ir;Hs.37288NM_0168310.2870.394GIGl3NM_0132610.2360.271LEM6;PGCI;PGC1A;PGC-lv;PPARGC1等NM_0038620.194ncZFGF5;FGF-18并入四個GO組宿主-病原體相互作用(G0=0030383)、細(xì)胞通訊(G0=0007154)、病毒生命周期(G0:0016032)以及細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)(G0:0007267)。使用含9276個基因的組過濾fibroBADrUL131感染的ARPE-19細(xì)胞的陣列結(jié)果。顯示基因庫識別號和基因名稱以及感染后6小時和10小時的誘導(dǎo)或抑制倍數(shù)。與模擬感染細(xì)胞相比改變不大于且不等于2.5的探針組由表示無變化的“nc”表示。討論ARPE-19上皮細(xì)胞可通過兩種不同途徑被HCMV感染，在質(zhì)膜處融合，或融合之后，在內(nèi)體膜處胞吞。這兩種進(jìn)入方式引發(fā)產(chǎn)毒感染(productiveinfection)。進(jìn)入途徑取決于病毒繁殖所在細(xì)胞型。上皮細(xì)胞制備的HCMV通過前一種途徑進(jìn)入，而在成纖維細(xì)胞中生長的病毒遵循后一種途徑。這個結(jié)論由超微結(jié)構(gòu)分析和感染對阻斷內(nèi)體酸化的試劑的敏感性有差異得出。在上皮細(xì)胞中生長的病毒的“從外部融合”活性大于在成纖維細(xì)胞中制備的病毒的觀察結(jié)果增強(qiáng)如下觀點這兩種病毒制劑以根本上不同的方式與ARPE-19細(xì)胞相互作用。重要的是，這兩種進(jìn)入方式需要PUL130功能，因為pUL130抗體中和由任一來源制備的病毒的感染。如果感染病毒已在上皮細(xì)胞中制備，那么gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131復(fù)合物在ARPE-19質(zhì)膜處起作用，且如果病毒在成纖維細(xì)胞中生長，那么所述復(fù)合物在內(nèi)體膜處起作用。在內(nèi)體中中和的病毒不能逃逸，且估計可能遭受與缺乏含PUL130復(fù)合物的AD169相同的命運，且積聚在上皮細(xì)胞內(nèi)體中但未引發(fā)產(chǎn)毒感染(10)。在成纖維細(xì)胞中生長的病毒相對于來自上皮細(xì)胞的病毒在延遲后誘導(dǎo)IEl蛋白積聚在ARPE-19細(xì)胞中，表明相較于通過在質(zhì)膜處融合進(jìn)入，通過胞吞作用進(jìn)入的某個方面進(jìn)行得較慢。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的病毒進(jìn)入后，內(nèi)體中顯而易見許多病毒粒子，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見到衣殼；且在受上皮細(xì)胞制備的病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也很少發(fā)現(xiàn)衣殼。顯然，病毒粒子在內(nèi)體中逗留一段時間，而一旦衣殼無包膜且到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，其即快速分解。HCMV病毒粒子是如何在兩種不同細(xì)胞型中制備的？看來不同的“從外部融合”活性提供暗示。不僅印iBADrUL131誘導(dǎo)融合的效率大于fibroBADrUL131，而且pH值降低會增強(qiáng)兩種病毒制劑的活性。不打算受任何機(jī)理解釋的約束或限制，膜的融合有可能需要一定閾值的融合活性。因為PUL130抗體中和這兩種病毒制劑的能力表明兩者都取決于用于融合的gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131復(fù)合物，所以設(shè)計實驗來假設(shè)病毒含有不同量的復(fù)合物。測定數(shù)個其組成部分，且發(fā)現(xiàn)印iBADrUL131粒子中呈現(xiàn)的gH/gL/pUL128/pUL130/PUL131與gH/gL/gO的比率稍高于(約2倍)fibroBADrUL131粒子中。gB、pp28以及pp65的水平在這兩種病毒粒子制劑中類似。EBV中優(yōu)先制備含不同相對量的gH復(fù)合物的病毒；由B細(xì)胞制備的粒子缺乏gH/gL/gp42(18)。然而，可能涉及其它因子。復(fù)合物的未測定的組成部分可能改變?；蛘?，gH復(fù)合物與一種或一種以上其它病毒粒子糖蛋白復(fù)合物的比率可能改變?nèi)诤匣钚浴Ｗ詈?，?dāng)在上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞內(nèi)制備病毒粒子時，供應(yīng)給病毒粒子的未鑒別的細(xì)胞蛋白質(zhì)可能改變復(fù)合物。兩種進(jìn)入方式是否有生理學(xué)結(jié)果？印iBADrUL131和fibroBADrUL131在感染ARPE-19細(xì)胞后誘導(dǎo)顯著不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。假定差異確實由病毒粒子或病毒粒子加特定相關(guān)的細(xì)胞因子所致，那么微陣列實驗證明對感染的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)驚人地不同。胞吞作用密切參與細(xì)胞表面分子的信號傳導(dǎo)的調(diào)控。因此，如果病毒通過在質(zhì)膜處融合進(jìn)入，相對于通過胞吞作用進(jìn)入，病毒可以不同方式調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。細(xì)胞信號傳導(dǎo)的差異很可能產(chǎn)生在培養(yǎng)細(xì)胞中未檢測到的生理學(xué)結(jié)果，諸如對病毒傳播、免疫逃逸或毒力的影響。參考文獻(xiàn)l.Miller.N.和Hutt-Fletcher，L.M.(1992)病毒學(xué)雜志(JVirol)66,3409-14.2.Nemerow.G.R.和Cooper.N.R.(1984)病毒學(xué)(Virology)132，186-98.3.Nicola.Α.V.,Hou.J.,Major,Ε.0.^PStraus,S.Ε.(2005)JVirol79,7609-16.4.Nicola,Α.V.，McEvoy,Α.Μ.和Straus,S.Ε.(2003)JVirol77，5324-32.5.Milne.R.S.，Nicola.Α.V.，ffhitbeck,J.C.，Eisenberg,R.J.禾口Cohen，G.H.(2005)JVirol79，6655—63.6.ffittels.Μ.和Spear，P.G.(1991)病毒研究(VirusRes)18，271-90.7.Plachtcr.B.，Sinzger,C.和Jahn，G.(1996)病毒研究前沿(AdvVirusRes)46，195-261.8.Compton.Τ.，Nepomuceno,R.R.禾口Nowlin，D.Μ.(1992)Virology191，387—95.9.Bodaghi.B.,Goureau.0.,Zipeto.D.,Laurent.L.,Virelizier,J.L.禾口Michelson,S.(1999)免疫學(xué)雜志(JImmunol)162，957-64.10.Ryckman.B.J.,Jarvis.Μ.A.,Drummond,D.D.,Nelson,J.A.禾口Johnson,D.C.(2006)JVirol80，710-22.11.Wang.X.,Kenyon,W.J.,Li,Q.,Mullberg,J.禾口Hutt—Fletcher，L.M.(1998)JVirol72，5552-8.12.Li，Q.，Turk,S.M.和Hutt-Fletcher,L.Μ.(1995)JVirol693987-94.13.Hutt-Fletcher，L.M.和Lake，C.M.(2001)在微生物學(xué)和免疫學(xué)方面的當(dāng)今的題目(CurrTopMicrobiolImmunol)258,51-64.14.Haan,K.·Μ·，Kwok,W.W.，Longnecker,R.禾ΠSpeck.P.(2000)JVirol74,2451-4.15.Haan,K.Μ.和Longnecker，R.(2000)美國國家科學(xué)院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)97,9252-7.16.Li,Q.,Spriggs,Μ.K.，Kovats.S.，Turk,S.Μ.，Comeau,Μ.R.，Nepom.B.禾口Hutt-Fletcher,L.Μ.(1997)JVirol71,4657-62.17.Wang.X.和Hutt-Fletcher，L.Μ.(1998)JVirol72，158-63.18.Borza,C.Μ.^PHutt-Fletcher,L.Μ.(2002)自然醫(yī)學(xué)(NatMed)8,594-9.19.Wang,D.禾口Shenk，Τ·(2005)ProcNatlAcadSciUSA102，18153-8.20.Adler.B.,Scrivano.L.,Ruzcics.Ζ.,Rupp.B.,Sinzger.C.禾口Koszinowski.U.(2006)普通病毒學(xué)雜志(JGenVirol)87,2451-2460.21.Wang,D.和Shenk，T.(2005)JVirol79，10330—8.22.Hahn.G.,Revello,M.G.,Patrone,Μ.,Percivalle,Ε.,Campanini,G.,Sarasini,A.,Wagner,Μ.,Gallina,A.,Milanesi,G.,Koszinowski,U.,Baldanti,F.禾口Gerna.G.(2004)JVirol78，10023—33·雖然本發(fā)明不受以上描述和舉例說明的實施例限制，但在隨附權(quán)利要求書的范疇內(nèi)能夠進(jìn)行變更和修改。權(quán)利要求一種制備巨細(xì)胞病毒(CMV)疫苗的方法，其包含a)在選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖CMV病毒株或分離株，從而制備細(xì)胞型條件性CMV；以及b)由所述細(xì)胞型條件性CMV制備CMV疫苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述CMV病毒株或分離株是人CMV病毒株或分離株。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述選定的細(xì)胞型包含上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述選定的細(xì)胞型是上皮細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含在兩種或兩種以上不同的選定細(xì)胞型中制備所述細(xì)胞型條件性CMV和合并所述CMV來制備所述CMV疫苗。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含提供兩種或兩種以上CMV病毒株或分離株，使所述病毒株或分離株各在包含所述選定細(xì)胞型或兩種或兩種以上不同的選定細(xì)胞型的所述培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖，和合并由此制備的所述細(xì)胞型條件性CMV來制備所述CMV疫苗。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含制備減毒活CMV疫苗。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含制備滅活或死CMV疫苗。9.一種CMV疫苗，其由根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。10.一種試劑盒，其包含容器，所述容器含有a)一種或一種以上CMV病毒株或臨床分離株；b)一種或一種以上選定細(xì)胞型的培養(yǎng)細(xì)胞；以及c)關(guān)于使用所述培養(yǎng)細(xì)胞和所述CMV病毒株或分離株制備用于CMV疫苗的細(xì)胞型條件性CMV的說明書。11.一種疫苗組合物，其包含與適合的藥用載體或佐劑混合的巨細(xì)胞病毒(CMV)群體或其病毒粒子組分，其中所述CMV群體從上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中，所述CMV是人類CMV。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中，從所述上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的所述CMV群體的特征在于隨后感染的宿主細(xì)胞中的一個或一個以上包含以下的特征a)通過與宿主細(xì)胞質(zhì)膜融合進(jìn)入所述宿主細(xì)胞中；b)與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體相比，所述宿主細(xì)胞的由病毒粒子介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合更多；c)與從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體相比，所述宿主細(xì)胞中的病毒生長加速；d)引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，包括與由從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中分離的相同CMV群體在感染后10小時所引發(fā)的應(yīng)答相比，約三分之二以下的基因的表達(dá)改變大于或等于2.5倍；或e)引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，包括一個或一個以上由以下基因庫登錄號表示的基因的表達(dá)改變AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301,NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_00384UNM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其進(jìn)一步包含從另一細(xì)胞型的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的CMV群體或其病毒粒子組分。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗組合物，其中，所述另一細(xì)胞型是成纖維細(xì)胞型。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中所述CMV群體包含兩種或兩種以上在所述上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中生長的CMV病毒株或臨床分離株。17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其包含減毒活CMV疫苗。18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其包含滅活CMV疫苗。19.一種使個體對CMV免疫的方法，其包含向所述個體給藥CMV疫苗組合物，所述CMV疫苗組合物包含與適合的藥用載體或佐劑混合的巨細(xì)胞病毒(CMV)群體或其病毒粒子組分，其中所述CMV群體從上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述個體是人。全文摘要本發(fā)明揭示通過選擇繁殖巨細(xì)胞病毒的細(xì)胞型增加巨細(xì)胞病毒疫苗多樣性的方法，和由所述方法所制備的巨細(xì)胞病毒在疫苗組合物研發(fā)中的用途。本發(fā)明還揭示包含從上皮細(xì)胞分離的CMV的疫苗組合物。文檔編號A61P31/22GK101820906SQ200880111084公開日2010年9月1日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日發(fā)明者湯瑪斯·雪克,王戴申請人:普林斯頓大學(xué)理事會