Nr_073415．2在檢測(cè)器官移植患者巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及疾病早期診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及NR_073415.2在檢測(cè)器官移植患 者巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨細(xì)胞病毒是器官移植術(shù)后較為常見(jiàn)的條件致病病毒，嚴(yán)重感染者可導(dǎo)致移植器 官失去功能甚至危及生命。器官移植受者在術(shù)中及術(shù)后需要使用大量免疫抑制劑，導(dǎo)致細(xì) 胞免疫功能低下，巨細(xì)胞病毒特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞免疫無(wú)應(yīng)答，不能清除感染 和產(chǎn)生免疫保護(hù)，易發(fā)生巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染。在沒(méi)有使用預(yù)防性抗病毒治療的情況下， 器官移植術(shù)后患者巨細(xì)胞病毒的感染率為60~80%，而其中有17~28%患者將發(fā)展為巨細(xì)胞 病毒病，如巨細(xì)胞病毒性肺炎、肝炎、胰腺炎、胃腸炎、腦膜腦炎等。
[0003] 隨著對(duì)器官移植術(shù)后預(yù)防性抗病毒治療的重視和防治水平的不斷提高，移植后巨 細(xì)胞病毒感染的發(fā)生率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。有報(bào)道顯示:恰當(dāng)使用更昔洛韋或纈更昔洛韋預(yù)防 治療能將巨細(xì)胞病毒病的發(fā)生率降低58~80%，將巨細(xì)胞病毒感染的發(fā)生率降低40%左右。 但其對(duì)器官移植術(shù)后患者仍有巨大影響，它可以通過(guò)直接或間接作用增加排斥或其他感染 的發(fā)生率、死亡率及降低移植物存活時(shí)間。因此，早期準(zhǔn)確診斷巨細(xì)胞病毒感染顯得至關(guān)重 要。
[0004] 目前可用于臨床診斷巨細(xì)胞病毒感染的方法有： 1、檢測(cè)外周血中巨細(xì)胞病毒特異性抗體:CMV-IgG和CMV-IgM常用于檢測(cè)巨細(xì)胞病毒感 染的情況。70%移植患者血清中CMV-I gG為陽(yáng)性，其對(duì)診斷巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染特異性高， 但敏感性低，實(shí)際診斷意義不大。而巨細(xì)胞病毒發(fā)生活動(dòng)性感染1周后CMV-IgM方可檢出，而 且其特異性較CMV-IgG低，因此其對(duì)診斷巨細(xì)胞病毒早期感染意義不大。由于移植術(shù)后受體 處于免疫抑制狀態(tài)，CMV-IgG和CMV-IgM出現(xiàn)延遲或缺失，容易造成假陰性結(jié)果，影響陽(yáng)性檢 出率，這些因素都限制了血清抗體檢測(cè)在巨細(xì)胞病毒感染診斷中的作用，因此，這兩種抗體 檢測(cè)可以作為供體和受體是否感染過(guò)巨細(xì)胞病毒的篩選指標(biāo)，對(duì)診斷巨細(xì)胞病毒感染起輔 助參考作用。
[0005] 2、檢測(cè)巨細(xì)胞病毒DNA拷貝數(shù):定量核酸檢測(cè)技術(shù)是對(duì)血清和白細(xì)胞中的CMV-DNA 拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，從而判斷巨細(xì)胞病毒感染的狀況。該方法還可以檢測(cè)組織、肺泡灌洗 液、尿液和腦脊液等標(biāo)本中的CMV-DNA，其敏感度和檢測(cè)速度均明顯高于其它檢測(cè)方法。該 方法可操作性好，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件要求低，便于推廣開(kāi)展。此外，若選用一個(gè)內(nèi)參基因同步 擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，則可計(jì)算病毒載量。但這種方法的缺點(diǎn)是變異度較大，不同實(shí)驗(yàn)室的 檢測(cè)最低值相差較遠(yuǎn)。而且，在感染早期，巨細(xì)胞病毒在局部復(fù)制、未擴(kuò)散入血時(shí)，抽取外周 血檢測(cè)CMV-DNA的陽(yáng)性率較低，影響了疾病的早期診斷。
[0006] 3、抗原學(xué)檢測(cè):通過(guò)半定量熒光分析方法、標(biāo)記鏈絲菌素-生物素結(jié)合法等方法檢 測(cè)巨細(xì)胞病毒-PP65抗原可提示體內(nèi)活動(dòng)性巨細(xì)胞病毒復(fù)制完成，其對(duì)診斷巨細(xì)胞病毒感 染的準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上。但巨細(xì)胞病毒-pp65抗原檢測(cè)是依靠抗原-抗體結(jié)合的原理，因此 對(duì)標(biāo)本的要求較高，新鮮的血液標(biāo)本要求在8 h內(nèi)送檢，陽(yáng)性檢出率與標(biāo)本新鮮程度直接相 關(guān)。此外，該檢測(cè)手段操作繁瑣、技術(shù)要求高，受實(shí)驗(yàn)人員主觀經(jīng)驗(yàn)影響多。因此，該檢測(cè)方 法未得到廣泛推廣與應(yīng)用。
[0007] 4、其他檢測(cè)方法:病毒分離培養(yǎng)將標(biāo)本接種于人成纖維母細(xì)胞后，通過(guò)觀察細(xì)胞 的病理變化來(lái)判斷是否存在巨細(xì)胞病毒病毒，但因巨細(xì)胞病毒在人成纖維母細(xì)胞的增殖較 為緩慢，對(duì)技術(shù)要求高，病毒敏感度低，培養(yǎng)周期大約4~6周，因此不適合在臨床診斷中使 用。移植物組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)可以明確診斷移植器官是否感染巨細(xì)胞病毒病，但該方 法需要對(duì)移植物進(jìn)行有創(chuàng)性檢測(cè)，而且在國(guó)內(nèi)尚無(wú)于臨床診斷用的試劑盒，因此該方法僅 用于科研。免疫學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)移植受者的外周血中的T淋巴細(xì) 胞，分析巨細(xì)胞病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)可以反映出巨細(xì)胞病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。但該方法技術(shù)要 求高，尚未用于臨床診斷中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢測(cè)器官移植患者巨細(xì) 胞病毒感染標(biāo)志物。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種檢測(cè)器官移植患者巨細(xì)胞病毒感染的試劑盒。 本發(fā)明專(zhuān)利由國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的： 器官移植術(shù)后患者長(zhǎng)期服用免疫抑制劑，機(jī)體對(duì)于巨細(xì)胞病毒感染的抵抗力薄弱，疾 病進(jìn)展迅速，而其早期診斷更加困難。在缺乏足夠診斷依據(jù)的情況下，加用抗病毒藥物不僅 增加了患者的治療成本和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也增加了不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明通過(guò)建立 巨細(xì)胞病毒感染的移植術(shù)后小鼠模型，將其感染早期的外周血單核細(xì)胞(PBMC)保存，運(yùn)用 基因芯片方法篩選其差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，最后在臨床感染患者外周血標(biāo) 本中進(jìn)行確證，從而發(fā)現(xiàn)NR_073415.2可以用于早期診斷器官移植患者是否感染巨細(xì)胞病 毒。NR_073415.2的基因序列如SEQ ID N0:1所示。
[0011] 因此，本發(fā)發(fā)明要求保護(hù)NR_073415.2在制備檢測(cè)器官移植患者巨細(xì)胞病毒感染 試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] NR_073415.2在作為檢測(cè)器官移植患者巨細(xì)胞病毒感染標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0013] -種檢測(cè)器官移植患者巨細(xì)胞病毒感染的試劑盒，通過(guò)該試劑盒分別檢測(cè)待測(cè)患 者外周血單核細(xì)胞中的GATOH和NR_073415.2的Cq值，GAPDH和NR_073415.2的Cq值至少測(cè)定 3次，取平均值后按照下列公式和方法判斷結(jié)果： Λ CT 值=AVERAGE (NR_0 7 3415 · 2 的 Cq值）一 AVERAGE (GAPDH的 Cq值） 結(jié)果判斷：ACT值大于或等于11時(shí)，考慮患者存在巨細(xì)胞病毒感染，結(jié)果為陽(yáng)性;ACT 值小于11時(shí)，考慮患者不存在巨細(xì)胞病毒感染，結(jié)果為陰性。
[0014] 優(yōu)選地，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)GAPDH的Cq值，Q-PCR檢測(cè)時(shí)的引物序列如SEQIDNO:2~3 所示。
[0015] 優(yōu)選地，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)NR_073415.2的Cq值，Q-PCR檢測(cè)時(shí)的引物序列如SEQ ID NO: 4~5所示。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明首次提出通過(guò)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中NR_073415.2的表達(dá)情況，來(lái)明確器官移 植術(shù)后患者的巨細(xì)胞病毒感染情況，從而為早期診斷提供一種新思路。本發(fā)明的試劑盒能 在感染早期(感染第1~3天）即可檢測(cè)到NR_073415.2的表達(dá)變化，而且不受免疫抑制狀態(tài) 的影響，對(duì)于早期診斷、早期治療，具有重要意義。另外，本發(fā)明相較于常規(guī)的抗體檢測(cè)或 DNA拷貝數(shù)檢測(cè)的陽(yáng)性率高，檢測(cè)樣品為患者外周血，易于取材，創(chuàng)傷小，技術(shù)方便簡(jiǎn)單，便 于推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為器官移植術(shù)后患者外周血單核細(xì)胞NR_073415.2的ACT值。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍