。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑 和材料。
[0019] 實施例1 一種檢測器官移植患者巨細胞病毒感染的試劑盒，該試劑盒以GAPDH和NR_073415.2為 檢測指標(biāo)，試劑盒具體包括兩對檢測引物、Q-PCR檢測用試劑、1份使用說明書。 兩對檢測引用的序列如下： GAPDH Primer-F序列：5'_ CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT -3' GAPDH Primer-R序列：5 ' -AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3 ' NR_073415 · 2-F序列：5 ' - TGGGTTCCGATGAGGAGGAT-3 ' NR_073415 · 2-R 序列：5 ' -AAGGGAGCCTGATGAGGGAT-3 ' 該試劑盒的判斷方法為:分別檢測待測患者外周血單核細胞中的GAPDH和NR_073415.2 的Cq值，GATOH和NR_073415.2的Cq值至少測定3次，取平均值后按照下列公式和方法判斷結(jié) 果： Λ CT 值=AVERAGE (NR_0 7 3415 · 2 的 Cq值）一 AVERAGE (GAPDH的 Cq值） 結(jié)果判斷：ACT值大于或等于11時，考慮患者存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陽性;ACT 值小于11時，考慮患者不存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陰性。
[0020]上述試劑盒的使用步驟如下： 用EDTA管收集待檢測患者外周血2~4ml，可置于4°C冰箱中保存24小時；用巴氏吸管將 外周血轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，于4°C以450g離心（加速4,減速7)5min，用巴氏吸管吸走上層 液體，留下下層紅色沉淀物;加入3~5倍體積紅細胞裂解液，并用巴氏吸管輕輕吹打混勻， 靜置室溫5分鐘；將上述液體于4°C以450g離心（加速4，減速7)lOmin，用新的巴氏吸管吸走 上層液體，留下下層白色沉淀物；用巴氏吸管將l〇ml PBS緩沖液加入到白色沉淀物上，于4 °C W450g離心（加速4，減速7)lOmin，用新的巴氏吸管吸走上層液體，并再重復(fù)該步驟1次； 得到白色沉淀物即為外周血單核細胞(PBMC)。采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法提取外周血單核細胞 的總RNA。然后使用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。
[0021] 將濃度和純度較好的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄及Q-PCR擴增。反轉(zhuǎn)錄過程參照 PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)(RR036A，TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄試劑 盒說明書進行操作，將總RNA中的IncRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0022] 利用Power SYBR PCR Master Mix(4367659，Genecopoeia)等試劑完成GAPDH及 NR_073415.2表達情況的檢測（Q-PCR檢測GATOH的Cq值時使用的引物如SEQ ID N0:2~3所 示;Q-PCR檢測NR_073415.2的Cq值時使用的引物如SEQ ID N0:4~5所示XQ-PCR反應(yīng)體系 見表1，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min，以95°C變性30sec、60°C退火30sec、60°C延伸30sec反應(yīng) 50個循環(huán)，結(jié)束前72°C延伸lOmin。
[0023] 表1 Q-PCR反應(yīng)體系
*的意思為cDNA按10倍稀釋后再使用。
[0024] 數(shù)據(jù)分析及判斷：每位患者的樣品通過技術(shù)復(fù)孔檢測GAPDH及NR_073415.2各三 次，2700 PCR system(Applied Biosystem公司）將計算出每次檢測的Cq值，將NR_073415.2 的三次檢測Cq值的平均值，減去GAPDH三次檢測Cq值的平均值，可計算出其ACT值。
[0025] 公式：ΛCT值=AVERAGE(NR_073415·2Cq值）一AVERAGE(GAPDHCq值） 結(jié)果判斷：ACT值大于或等于11時，考慮患者存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陽性;ACT 值小于11時，考慮患者不存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陰性。
[0026] 實施例2 以實施例1的試劑盒檢測了 28例器官移植術(shù)后真菌感染患者外周血單核細胞中的NR_ 073415.2的ACT值情況，其中包括3例肝移植術(shù)后患者，25例腎移植術(shù)后患者。同時，我們還 檢測了74位器官移植術(shù)后正常受試者外周血單核細胞中的NR_073415.2的ACT值情況作為 對照，其中包括34位肝移植術(shù)后患者，39位腎移植術(shù)后患者及1位胰腎聯(lián)合移植術(shù)后患者。 結(jié)果見圖1和表2。
[0027]表 2
該臨床檢測中，采用的金標(biāo)準為利用Q-PCR技術(shù)檢測外周血中CMV-DNA拷貝數(shù)。通過表2 可知，該檢測方法的真陽性率為67.86%，真陰性率為87.84%，假陽性率為12.16%，假陰性率 為32.14%。
【主權(quán)項】
1. NR_073415.2在制備檢測器官移植患者巨細胞病毒感染試劑盒中的應(yīng)用。 2. NR_073415.2在作為檢測器官移植患者巨細胞病毒感染標(biāo)志物中的應(yīng)用。3. -種檢測器官移植患者巨細胞病毒感染的試劑盒，其特征在于，通過該試劑盒分別 檢測待測患者外周血單核細胞中的GATOH和NR_073415.2的Cq值，GAPDH和NR_073415.2的Cq 值至少測定3次，取平均值后按照下列公式和方法判斷結(jié)果： ACT 值=AVERAGE (NR_073415 · 2 的 Cq值）一 AVERAGE (GAPDH 的 Cq值） 結(jié)果判斷：ACT值大于或等于11時，患者存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陽性；ACT值小 于11時，患者不存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陰性。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，通過Q-PCR檢測GAPDH的Cq值，Q-PCR檢測 時的引物序列如SEQ ID N0:2~3所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，通過Q-PCR檢測NR_073415.2的Cq值，Q-PCR檢測時的引物序列如SEQ ID N0:4~5所示。
【專利摘要】本發(fā)明屬于疾病早期診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了NR_073415.2在檢測器官移植患者巨細胞病毒感染中的應(yīng)用及試劑盒。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)NR_073415.2可用于檢測器官移植患者是否感染巨細胞病毒，具體為檢測待測患者外周血單核細胞中的內(nèi)參基因GAPDH和NR_073415.2的Cq值，GAPDH和NR_073415.2的Cq值至少測定3次，取平均值后按照下列公式和方法判斷結(jié)果：△CT值=AVERAGE（NR_073415.2？Cq值）－AVERAGE（GAPDH？Cq值）；△CT值大于或等于11時，考慮患者存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陽性；△CT值小于11時，考慮患者不存在巨細胞病毒感染，結(jié)果為陰性。本發(fā)明在感染早期（感染第1～3天）即可檢測到NR_073415.2的表達變化，而且不受免疫抑制狀態(tài)的影響，對于早期診斷、早期治療，具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105567804
【申請?zhí)枴緾N201510888722
【發(fā)明人】何曉順, 郭志勇, 楊安力, 陳茂根, 王東平, 張傳釗, 胡安斌, 高燕娜, 周健, 邰強
【申請人】中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月7日