專利名稱：從大豆工藝流中回收鮑曼-貝克抑制劑蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開提供了從大豆工藝流中回收純化的鮑曼-貝克抑制劑(BBI)蛋白的方法。具體地講，本公開提供的方法包括層析分離，以及任選地，分離和移除BBI產(chǎn)品的一種或多種分離技術(shù)，所述BBI產(chǎn)品具有以總BBI蛋白濃度表示的至少90重量％的純度。
背景技術(shù)：
大豆工藝流包含顯著量的蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制調(diào)控一些關(guān)鍵代謝功能的多種其它關(guān)鍵跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部給藥對(duì)于例如特應(yīng)性皮炎的病癥是有用的，特應(yīng)性皮炎是皮膚炎癥的一種普通形式，其可以局限于少數(shù)區(qū)塊或者涉及身體的大部分。蛋白酶抑制劑的褪色活性和它們防止紫外線導(dǎo)致的色素沉著的能力在體外和體內(nèi)均已被證明(參見例如，Paine等人，J. Invest.Dermatol. ,116 :587-595[2001])。蛋白酶抑制劑還被報(bào)道有利于創(chuàng)傷愈合。例如，分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑被證明當(dāng)被局部施用時(shí)逆轉(zhuǎn)了組織的破壞并加速了創(chuàng)傷愈合過程。此夕卜，絲氨酸蛋白酶抑制劑還能夠有助于在紅斑狼瘡病人中降低疼痛(參見例如，美國專利6，537，968)。天然存在的蛋白酶抑制劑可見于多種食物中，例如糧谷類(燕麥、大麥和玉米)、芽甘藍(lán)、洋蔥、甜菜根、小麥、龍爪稷和花生。所關(guān)注的一個(gè)來源是大豆。大豆中存在的蛋白酶抑制劑的平均水平，兩種對(duì)于庫尼茲和鮑曼-貝克最重要的蛋白酶抑制劑分別是約
I.4%和 0. 6%。稱為鮑曼-貝克(Bowman-Birk)蛋白酶抑制劑(BBI)的蛋白酶抑制劑，是從大豆分離的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的低分子量蛋白(7-8kDa)雙頭抑制劑。它最早是在超過六十年前被發(fā)現(xiàn)的(Bowman, Proc. Soc. Exptl. Med.，1946,63, 574 ;并隨后還被 Birk, Y. Biochim. Biophys. Acta,1961,54,378-381 ；和 Birk Y.等人，BiochemicalPreparations, 1968,第12卷,第25-29頁表征)，并且由于發(fā)現(xiàn)其在多種實(shí)驗(yàn)體系中有效的抗癌效應(yīng)，已重新吸引了科學(xué)界的興趣。除了抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶外，BBI還具有抑制其它蛋白酶活性的能力，例如組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和類糜蛋白酶(Birk Y.，Int J Pept Protein Res, 1985, 25 113-131 ;Larionova 等人,Biokhimiya, 1993, 58 :1437-1444 ;和 Ware 等人,Archives ofBiochemistry and Biophysics 1997, 344 :133-138,它們每個(gè)均以引用方式并入本文)。BBI蛋白由大約65-77個(gè)氨基酸殘基和大約七個(gè)二硫鍵組成。BBI是蛋白，其特征在于高的半胱氨酸氨基酸濃度( 20重量％ )、高的水溶性、對(duì)熱變性的抗性和具有在獨(dú)立的抑制位點(diǎn)抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的能力。在培養(yǎng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，粗制的或純化的BBI阻止或減少多種類型的誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化是普遍已知的(Kennedy，A. R，The Bowman-Birk Inhibitorfrom soybeans as an anticarcinogenic agent， Am J of Clinical Nutr，1998 :68，1406S-1412S)。 也參見例如(I)Kennedy，A. R. Chemopreventive agents protease inhibitors.PharmacoIogy&Therapeutics78 167-209,1998 ； (2)Kennedy,A. R. Overview Anticarcinogenic activity of protease inhibitors. In ProteaseInhibitors as Cancer Chemopreventive Agents ； (3)Troll, W.，Kennedy, A.R (編輯);Plenum Publishing Corporation New York，9-64，1993 ; (4)Kennedy，A. R.，Szuhaj, B. F.，Newberne，P. M.，Billings，P. C. Preparation and production ofa cancer chemopreventive agent，Bowman-Birk Inhibitor Concentrate. Nutr.Cancerl9 :281-302,1993 ； (5)Kennedy, A. R. Prevention ofcarcinogenesis by proteaseinhibitors. Cancer Res. (suppl.). 54 :1999s_2005s，1994 ； (6)Kennedy, A. R. In vitrostudies of anticarcinogenic protease inhibitors. In Protease Inhibitors asCancer Chemopreventive Agents ;Troll，W.，Kennedy, A. R.(編輯)；Plenum PublishingCorporation New York，65-91，1993 (7)Kennedy，A. R.，The Status of Human Trials Utilizing Bowman-Birk Inhibitor Concentrate from Soybeans. In Soy in Health andDisease Prevention,Michihiro Sugano (編輯)，CRC Press LLC，Boca Raton，F(xiàn)lorida，第12章，第 207-223 頁，2005 ; (8) Kennedy，A. R. Status of current human trials utilizingBowman Birk Inhibitor Concentrate. Proceedings of a Symposium,Soy&Health 2006 ；Dietetic Applications-Dietetic Applications，，，在 2006 年 10 月 12 日和 13 日舉行，Dusseldorf，Germany (已接受);(9)Bartsch 矛口Gerhauser5 Molecular Mechanisms ofCancer Induction and Chemoprevention. In Chemoprevention of Cancer and DNADamage by Dietary Factors， Siegfried KnasmulIer, Ian Johnson， David DeMarini 和Clarissa Gerhauser (編輯)，Wiley-VCH Verlag, GmbH&Co.，KGaA，Weinheim，2009。富集了 BBI的大豆提取物，通常稱為鮑曼-貝克抑制劑濃縮物(BBIC)，已于1992年4月取得了美國食品與藥品管理局(FDA)的研究中新藥(IND)地位。BBIC已顯示在某些條件下表現(xiàn)出針對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的抑制性活性，并且其施用已顯示影響多種形式的癌癥。參見例如美國專利7，404，973。又如，終生以1.0%膳食BBIC維持生存的動(dòng)物已顯示不具有生長異常并且發(fā)現(xiàn)具有顯著延長的壽命(Kennedy等人，Nutr Cancer, 1993，19 :281-302)。BBIC也顯示出在動(dòng)物模型和人類臨床試驗(yàn)中具有在治療口腔癌、肌肉萎縮癥和預(yù)防肌肉消耗方面的活性、抗炎性活性、輻射防護(hù)活性。(參見例如Kennedy，A. R.，Soy and Health and Disease Prevention，2005 和 Sweeney 等人的美國專利公布 US2008/0300179A1)。在小鼠中，BBIC還已顯示能夠在腹膜內(nèi)注射之后在肺、腎和肝臟組織中抑制蛋白分解活性(Oreffo等人，Toxicology，1991,69 :165-176) c^BBIC還已顯示減輕了神經(jīng)肌肉疾病的影響(美國專利申請(qǐng)公布20080300179，Morris等人，J Appl Physiol. 2005年 11 月；99(5) : 1719-27，Arbogast 等人，JAppl Physiol. 2007 年 3 月；102(3) :956-64)。上文提及的美國專利5，338，547公開了用高度活性的BBI濃縮物(BBIC)產(chǎn)品阻止和抑制癌生成的方法，其中生物活性的水平通過胰凝乳蛋白酶抑制劑含量測量。這些BBI濃縮物產(chǎn)品是由從脫脂的大豆粉或大豆柏獲得的酸性大豆可溶物制得的，所述酸性大豆可溶物是用PH 4-5的含水的酸提取的，并且不溶物已通過離心從其中移除。使所述大豆可溶物經(jīng)過超濾以制備粗制的BBI濃縮物，所述粗制的BBI濃縮物被稀釋和噴霧干燥以制備最終的干燥的BBI濃縮物產(chǎn)品。在本專利中公開的優(yōu)選的方法實(shí)施方案中，用丙酮處理所述粗制的BBI濃縮物以產(chǎn)生BBI濃縮物沉淀，所述沉淀被空氣干燥、研磨、用水再漿化、過濾然后凍干或噴霧干燥，以制備最終的BBI濃縮物產(chǎn)品。該產(chǎn)品被聲明是癌發(fā)生的改善的抑制齊[I。Kennedy還提及BBI濃縮物產(chǎn)品能夠通過Odani等人(J. Biochem. 1973, 74,857)所述的方法被進(jìn)一步純化，該方法涉及將所述BBIC產(chǎn)品片段化為兩個(gè)分離的片段，一個(gè)片段具有胰蛋白酶抑制性位點(diǎn)，而另一個(gè)片段具有胰凝乳蛋白酶抑制性位點(diǎn)。然而，具有胰凝乳蛋白酶抑制性位點(diǎn)的級(jí)份的抑制性活性是被嚴(yán)重破壞的。BBIC也顯示出在動(dòng)物模型和人類臨床試驗(yàn)中具有在治療口腔癌、肌肉萎縮癥和預(yù)防肌肉消耗方面的活性、抗炎性活性、輻射防護(hù)活性。(參見例如Kennedy，A. R.，Soy and Health and Disease Prevention, 2005 和 Sweeney 等人的美國專利公布 US2008/0300179A1)。在小鼠中，BBIC還已顯示能夠在腹膜內(nèi)注射之后在肺、腎和肝臟組織中抑制蛋白分解活性(Oreffo 等人，Toxicology, 1991,69 :165-176)。
鑒于BBIC產(chǎn)品可以提供用于阻止或減緩癌發(fā)生的潛在療法的可能性，已嘗試通過多種方法制備純的和各種各樣的BBIC制備物來作為用于各種不同癌癥的潛在的治療藥物(美國專利5，217，717 ；Kennedy等人在美國專利5，338，547中提供了對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的綜述，其全文以引用方式并入本文)。同樣授予Kennedy等人的美國專利4，793，996公開了用丙酮處理大豆、然后是乙醇萃取和丙酮沉淀的用于獲得BBIC的方法。Kennedy等人發(fā)現(xiàn)通過在 Perlmann 等人，Methods in Enzymology, 19 :860-861 (1970)提出的乙醇萃取步驟之前用丙酮處理大豆，所得BBIC在抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化方面較有效。當(dāng)前在本領(lǐng)域使用的純化方法有多種。一些方法使用利用固載化胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的親和純化。固載化胰蛋白酶將結(jié)合BBI和庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)，因此未分離出特別純的BBI產(chǎn)品。作為另外一種選擇，涉及使用固載化胰凝乳蛋白酶的方法，雖然它不結(jié)合KTI，具有多個(gè)問題，例如胰凝乳蛋白酶在多個(gè)使用和清潔步驟后可能從樹脂中濾掉。許多以前的BBI純化方法使用陰離子交換層析，該技術(shù)能夠引起B(yǎng)BI異構(gòu)體的精餾，此夕卜，用陰離子交換層析獲取無KTI的BBI級(jí)份、同時(shí)不顯著損失BBI的產(chǎn)量一直是困難的。因此，迄今使用的方法尚不能產(chǎn)生如本文所述的純化BBI。本領(lǐng)域已知的目前用于獲得純化的BBI蛋白的方法受困于因庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)蛋白對(duì)BBI的污染導(dǎo)致的低純度水平。取決于所使用的分離方法，內(nèi)毒素水平同樣是問題。目前的方法使用完整大豆作為原料，其可以隨后通過多種方法脫脂。與此相對(duì)，本發(fā)明的方法使用脫脂的白大豆柏作為原料。因此，現(xiàn)有技術(shù)尚未描述具有高純度水平的BBI產(chǎn)品，并且具體地，現(xiàn)有技術(shù)尚未描述從大豆獲得的具有高純度水平的BBI產(chǎn)品。此外，這里我們指出BBI是在二十世紀(jì)四十年代由Bowman鑒定的，并且還在二十世紀(jì)六十年代由Birk 表征(Bowman D. E. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. , 63 :547-550,1946 ；Birk, Y. Biochim.Biophys. Acta, 1961，54，378-381 jPBirk.Y.等人，Biochemical Preparations, 1968, %12卷，第25-29頁)。然而，在文獻(xiàn)中或商業(yè)上沒有任何BBI產(chǎn)品具有如本文所述的純度水平。因此，需要一種可用于從大豆工藝流中回收純化BBI蛋白、以及其它組分的方法。因此，本發(fā)明描述了分離包含高純度BBI蛋白的BBI產(chǎn)品的新方法。此外，本發(fā)明的方法利用比本領(lǐng)域當(dāng)前已知方法更少的步驟，從而減少了時(shí)間和成本需求。此外，因?yàn)榇蠖狗蛛x物的加工需要水，本發(fā)明的方法通過減少用于大豆分離物加工的水處理所需的水量減少了產(chǎn)生的污染。發(fā)明概沭本發(fā)明描述了用于純化具有指定的總BBI蛋白濃度和其它BBI特性(包括例如胰凝乳蛋白酶抑制劑活性和內(nèi)毒素含量)的BBI產(chǎn)品的新方法。在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明涉及純化具有指定的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，所述方法包括使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受層析分離處理，以及任選地，附加地使所述大豆工藝流經(jīng)受一種或多種分離技術(shù)處理。在特定方面，BBI產(chǎn)品具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度。在本發(fā)明的某些其它方面，所述層析分離選自離子交換層析、吸附層析、尺寸排阻 層析、反相層析和親和層析。在特定方面，所述層析分離是離子交換層析。在其它特定方面，所述層析分離是包括離子交換柱的離子交換層析。在其它特定方面，所述離子交換柱包含陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、或它們的組合。在其它特定方面，所述方法包括控制PH以保持其低于BBI蛋白的等電點(diǎn)，使得通過所述離子交換樹脂保留BBI蛋白。在其它特定方面，所述方法包括控制PH以保持其高于BBI蛋白的等電點(diǎn)，使得通過所述離子交換樹脂不保留BBI蛋白。在本發(fā)明的某些其它方面，所述一種或多種分離技術(shù)在所述層析分離之前被執(zhí)行。在本發(fā)明的某些其它方面，所述一種或多種分離技術(shù)在所述層析分離之后被執(zhí)行。在本發(fā)明的某些其它方面，所述一種或多種分離技術(shù)選自膜分離、電泳、滲析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、重力分離、以及它們的任何組合。在特定方面，所述一種或多種分離技術(shù)是膜分離。在其它特定方面，所述膜分離包括微量過濾膜、超濾膜、或它們的組合。在本發(fā)明的某些其它方面，所述純化的BBI產(chǎn)品包含至少一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQID NO :6、以及它們的任何組合具有至少90%的同一性。在本發(fā)明的某些其它方面，本發(fā)明涉及純化具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括(a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受一種或多種分離技術(shù)處理；以及(b)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受層析分離處理，其中獲得具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品。在特定方面，步驟(a)在步驟(b)之前被執(zhí)行。在本發(fā)明的某些其它方面，本發(fā)明涉及分離和純化具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括(a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成第一透過物和第一保留物，所述第一透過物包含所述大豆蛋白，并且所述第一保留物包含所述雜質(zhì)；(b)使所述第一透過物經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成第二透過物和第二保留物，所述第二保留物包含大部分蛋白，并且所述第二透過物包含雜質(zhì)；(C)使所述第二保留物與載體流混合用于通過至少一種層析分離，以使BBI蛋白流與所述工藝流中的其它蛋白分離；(d)使所述BBI蛋白流與液體沉淀介質(zhì)混合并使它們經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成沉淀的BBI蛋白級(jí)份；(e)使所述沉淀的BBI蛋白級(jí)份與液體洗滌介質(zhì)混合以形成溶解的BBI蛋白級(jí)份；(f)使所述溶解的蛋白級(jí)份經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成純化的溶解的BBI蛋白級(jí)份；以及(g)使所述純化的溶解的BBI蛋白級(jí)份經(jīng)受至少一種分離操作處理以形成所述純化的BBI產(chǎn)品。附圖簡沭圖IA是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟0至4的流程示意圖。圖IB是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟5、6、14、15、16和17的流程示意圖。圖IC是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟7至13的流程示意圖。
圖2是描述用于從大豆乳清流中回收BBI蛋白的基于膜的方法的流程示意圖。圖3描述了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，所述十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)描述了根據(jù)本發(fā)明的BBI純化過程中產(chǎn)生的多種保留物和透過物，包括所得的BBI產(chǎn)品。圖4示出了用于確定通過本發(fā)明的方法分離的新型BBI蛋白序列的MALDI-T0F質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖5描述了雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)之后的本發(fā)明的BBI蛋白。圖6描述了市售的BBI產(chǎn)品的2D-PAGE分析結(jié)果。圖7描述了根據(jù)Odani和Ikenaka在本領(lǐng)域中已知的來自大豆的BBI的初級(jí)結(jié)構(gòu)。圖8描述了新型BBI蛋白亞型。發(fā)明詳述本文所述的是從蛋白制造中生成的多種豆科和非豆科植物工藝流中回收高純度BBI蛋白和其它產(chǎn)品的新方法。例如，本公開的方法包括一種或多種分離技術(shù)或方法(例如層析分離或膜分離)，選擇并設(shè)計(jì)所述分離技術(shù)或方法以回收BBI蛋白或其它產(chǎn)品、或分離所述大豆乳清流的多種組分、或上述兩者皆有?；厥誃BI蛋白和所述大豆乳清流的一種或多種其它組分(例如多種糖，包括低聚糖)可利用多種分離技術(shù)。所述特定的分離技術(shù)取決于擬回收的期望組分，期望該組分與所述工藝流中的其它組分分離開來。例如，純化的BBI級(jí)份通常通過下列步驟制備首先移除一種或多種雜質(zhì)(例如，微生物或礦物)，然后移除包括一種或多種大豆貯藏蛋白(即，大豆球蛋白和￠-伴球蛋白)的附加的雜質(zhì)，然后移除一種或多種大豆乳清蛋白(包括例如KTI和其它非BBI的蛋白或肽)，和/或然后從大豆乳清中移除一種或多種附加的雜質(zhì)，包括糖類。通過稀釋，移除使純度降低的乳清流的其它主要組分(例如，礦物、糖類和貯藏蛋白)，同時(shí)同樣地通過純化蛋白級(jí)份改善純度，改進(jìn)了高純度形式的BBI蛋白的回收，其中所述純化蛋白級(jí)份通過移除作為所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效應(yīng)的組分(例如，內(nèi)毒素)進(jìn)行。大豆乳清的多種組分的移除通常包括在所述大豆乳清的組分的移除之前和/或過程中對(duì)所述大豆乳清的純化。貯藏蛋白、糖類、礦物和其它雜質(zhì)的移除產(chǎn)生富集了所期望的BBI蛋白，并且不含可能是拮抗劑或毒素或者可能在其它方面具有有毒效應(yīng)的雜質(zhì)的級(jí)份。例如，大豆貯藏蛋白富集的級(jí)份通?？梢耘c富集了一種或多種大豆乳清蛋白級(jí)份一起被回收。富集了一種或多種糖類(例如低聚糖和/或多糖)的級(jí)份也通常被制備。因此，本方法提供適合作為用于回收BBI蛋白級(jí)份，并且還提供能夠被用于從含水的大豆乳清中回收其它有用產(chǎn)品的其它級(jí)份。例如，糖類和/或礦物從大豆乳清流中的移除產(chǎn)生了有用的級(jí)份，糖類能夠從其中被進(jìn)一步分離，從而產(chǎn)生附加的有用的級(jí)份濃縮的糖和礦物級(jí)份(可以包括檸檬酸)，以及可以最低限度的處理(如果存在的話)被處置或作為工藝用水被回收的相對(duì)純的工藝流。如此產(chǎn)生的工藝用水在本方法的實(shí)施中可以是尤其有用的。因此，本方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)可以是與常規(guī)的分離制備方法相比降低的工藝用水需求。本公開的方法以至少兩種方式提供了高于制造大豆蛋白分離物和濃縮物的常規(guī)方法的優(yōu)點(diǎn)。如所指出的，制造大豆蛋白材料的常規(guī)方法通常處理大豆乳清流(例如含水的大豆乳清或大豆糖漿)。因此，通過本公開的方法回收的產(chǎn)品代表了附加的產(chǎn)品，和目前在與常規(guī)的大豆蛋白分離物和大豆蛋白濃縮物制造的關(guān)聯(lián)中未實(shí)現(xiàn)的收益來源。此外，對(duì)大豆乳清流或大豆糖漿進(jìn)行的用于回收可出售的產(chǎn)品的處理，可取地降低了與對(duì)大豆乳清流或大豆糖漿的處理或處置相關(guān)的成本。例如，如本文中其它地方所詳述的，本發(fā)明的多種方法提供了相對(duì)純的工藝流，所述工藝流可以在多種其它方法中被容易地利用或者以最低限度的處理(如果存在的話)被處置，從而降低所述方法對(duì)環(huán)境的影響。某些成本與本公 開的方法相關(guān)聯(lián)地存在，但所分離的附加的產(chǎn)品和廢物處理的最小化的益處據(jù)信彌補(bǔ)了任何增加的成本。A.酸可溶的蛋白大豆蛋白分離物通常在大豆貯藏蛋白的等電點(diǎn)(例如，約4.5的pH)從脫脂大豆柏或大豆粉的水提物中沉淀。因此，大豆蛋白分離物一般包括在酸性液體介質(zhì)中不可溶的蛋白。類似地，大豆蛋白濃縮物(第二精純的大豆蛋白材料)的蛋白同樣在酸性液體介質(zhì)中是不可溶的。然而，通過本公開的方法回收的大豆乳清蛋白一般是酸可溶的，意味著它們?cè)谒嵝砸后w介質(zhì)中是可溶的。例如，本公開提供了來源于含水大豆乳清，并且在環(huán)境條件(例如，約25°C的溫度)下表現(xiàn)出跨越相對(duì)寬范圍PH的含水(通常為酸性的)介質(zhì)(例如具有約2至約10、約2至約7、或約2至約6的pH的含水介質(zhì))中的優(yōu)越溶解度的大豆蛋白組合物。通常所述大豆蛋白組合物的溶解度為至少約10克每升(g/L)，更典型至少約15g/L，以及更典型至少約20g/L。應(yīng)當(dāng)了解，提及跨越pH范圍的溶解度時(shí)(包括在所附權(quán)利要求中)是指所指定的溶解度是在落在所指定的PH范圍內(nèi)的任何和全部的pH值達(dá)到的。例如，提及在約2至約10的pH范圍至少約10g/L的溶解度表示所指定的溶解度是在3、4、5、6等pH達(dá)到的。通過本公開的方法回收的酸可溶的大豆蛋白代表著本領(lǐng)域中的顯著改進(jìn)。如本文所指出的，所述酸可溶的蛋白是從通常被丟棄的大豆乳清流中回收的。B.鮑曼-貝克蛋白酶抑制劑如本文所討論的，大豆工藝流(其包括例如大豆乳清流和大豆糖漿流)包含顯著量的鮑曼-貝克蛋白酶抑制劑(BBI)。這種蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和潛在地多種其它關(guān)鍵蛋白酶，例如調(diào)控一系列關(guān)鍵代謝功能的組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和糜酶。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案分離的BBI蛋白可以包含與選自SEQ ID N0U SEQ ID NO 2,SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、以及它們的組合的氨基酸序列具有至少 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%的同一性的氨基酸序列的多肽。圖4描述了通過本發(fā)明分離的新型BBI蛋白亞型的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述BBI蛋白可包含與選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少70%的同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選地可包含與選自SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少80%的同一性的氨基酸序列，甚至更優(yōu)選地可包含與選自SEQ ID NO=USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少90%的同一丨丨生的氨基酸序列，并且最優(yōu)選地可包含與選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID N0:1至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID勵(lì)2至少50%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID勵(lì)3至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID勵(lì)4至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID勵(lì)5至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本實(shí)施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID勵(lì)6至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本發(fā)明的某些方面，兩種氨基酸序列之間的序列同一性通過比較所述氨基酸序列來確定。在本發(fā)明的其它方面，序列同一性能夠通過比較氨基酸序列與其保守的氨基酸取代物來確定。在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的蛋白能夠具有一個(gè)或多個(gè)保守取代。在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的蛋白能夠具有一個(gè)或多個(gè)非保守的取代。天然存在的氨基酸包括例如丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。保守的和非保守的氨基酸取代是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，例如，酸性氨基酸對(duì)另一種酸性氨基酸的取代可以被認(rèn)為是保守取代而堿性氨基酸對(duì)酸性氨基酸的取代可以被認(rèn)為是非保守取代；類似地，極性氨基酸對(duì)另一種極性氨基酸的取代可以被認(rèn)為是保守取代而非極性氨基酸對(duì)極性氨基酸的取代可以被認(rèn)為是非保守取代。氨基酸一般被分為下列類別(這能夠被用作指導(dǎo)，用于確定取代是保守的還是非保守的)(1)極性的/親水性的:N、Q、S、T、K、R、H、D、E、C和 Y ;(2)非極性的 / 疏水性的:G、A、L、V、I、P、F、W 和 M ;
(3)酸性的D、E和C ;⑷堿性的K、R和H ; (5)芳香族的F、W、Y和H ;和(6)脂族的G、A、L、V、I 和 Po在本發(fā)明的某些方面，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列與SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、或 SEQID NO :6 不同，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列也行使BBI蛋白的功能，已知它們抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性。用于確定這些功能的方法描述于本文中并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的其它方面，其中的組合物包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :5、或 SEQ ID NO:6不同，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列也行使BBI蛋白的功能，已知它們抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。用于確定這些功能的方法描述于本文中并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。BBI蛋白由大約65個(gè)至77個(gè)氨基酸殘基和大約七個(gè)二硫鍵組成。BBI蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)自 1972 年起即是已知的(Odani S.和 T. Ikenaka, J. Biochem. 197374 :6971972)并且如圖7中所示。與其它BBI產(chǎn)品相比，目前據(jù)信，本公開的BBI產(chǎn)品的純度代表著此前未達(dá)到的水平的純度。BBI級(jí)份的純度是總BBI蛋白濃度、比活性(如以胰凝乳蛋白酶抑制劑單位/克蛋白測量的)和具有BBI拮抗劑功能的組分、毒素、或在單純的對(duì)每單位數(shù)量的BBI的功效 的稀釋之外還具有有毒效應(yīng)的其它組分的不存在的函數(shù)。一般而言，本公開的BBI產(chǎn)品的總BBI蛋白濃度是至少約70重量％，或至少約80重量％。通常，本公開的BBI產(chǎn)品的總BBI蛋白濃度是至少約90重量％，至少約91重量％，至少約92重量％，至少約93重量％，至少約94重量％，至少約95重量％，至少約96重量％，至少約97重量％，至少約98重量％和至少約99重量％?！凹兊摹眴误w蛋白在單向或雙向SDS-PAGE凝膠上電泳之后將產(chǎn)生一條單獨(dú)的條帶，將作為單獨(dú)的對(duì)稱吸收峰從凝膠過濾、高效液相色譜(HPLC)或離子交換柱上洗脫，將產(chǎn)生單獨(dú)的一組質(zhì)譜、核磁共振(NMR)、或W吸收光譜信號(hào)，并且在適當(dāng)?shù)那闆r下將沒有對(duì)酶活性的污染。由于絕對(duì)的純度不能被確定，一個(gè)簡單的純度標(biāo)準(zhǔn)被常規(guī)地使用，即在SDS-PAGE之后不能檢測到多于一個(gè)的蛋白條帶。(參見Mohan, Determination of purity andyield. Methods in Molecular Biology, 11, 307-323 (1992))。圖 3 描述了單向凝膠電泳之后的本發(fā)明的BBI蛋白。圖5描述了雙向凝膠電泳(2D-PAGE)之后的本發(fā)明的BBI蛋白。如圖3和5所示，本發(fā)明的BBI蛋白表現(xiàn)為6. 5kDa和14. 4kDa的分子量標(biāo)準(zhǔn)之間的單一條帶并且具有不同的等電點(diǎn)。僅有單一條帶的存在表明在所述產(chǎn)品中沒有污染物。與此相比，圖6描述了對(duì)由Sigma Aldrich, St. Louis, MO商品化銷售的BBI產(chǎn)品(產(chǎn)品號(hào)T9777)的2D-PAGE分析的結(jié)果。在圖6中，顯著不同的是，雖然樣品BBI蛋白被發(fā)現(xiàn)與圖5中的BBI蛋白介于相同的分子量標(biāo)準(zhǔn)之間，但它們沒有表現(xiàn)為單一條帶。這表明與本發(fā)明的BBI蛋白中相比，Sigma BBI樣品中存在更多的污染物，包括殘余的庫尼茲胰蛋白酶抑制劑蛋白以及非蛋白組分。除BBI純度之外，本公開的BBI產(chǎn)品的總蛋白含量也是有利的和/或代表了本領(lǐng)域的改進(jìn)。本公開的產(chǎn)品的BBI蛋白含量可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測定，包括例如描述于 Ohnishi, S. T.和 Barr,J.K.,A simplified method of quantitating proteins usingthe biuret and phenol reagents. Anal. Biochem. , 86,193 (1978)中的 Lowry 方法。一般而言，本公開的BBI產(chǎn)品的總蛋白含量為至少約60重量％ (基于干重)，至少約70重量％，至少約80重量％，或至少約85重量％。通常，本公開的BBI產(chǎn)品的總蛋白含量為至少約90重量至少約91重量％，至少約92重量％，至少約93重量％，至少約94重量％，至少約95重量％，至少約96重量％，至少約97重量％，至少約98重量％和至少約99重量％。BBI產(chǎn)品目前據(jù)信適合的多種應(yīng)用要求相對(duì)低的內(nèi)毒素含量。例如，多種治療應(yīng)用要求BBI產(chǎn)品滿足藥品等級(jí)材料適用的規(guī)章。因此，在多個(gè)優(yōu)選的方面，所述BBI產(chǎn)品的總內(nèi)毒素含量為優(yōu)選不超過約5. OEU/克蛋白，不超過約4. 5EU/克蛋白，不超過約4. OEU/克蛋白，不超過約3. 5EU/克蛋白，不超過約3. OEU/克蛋白，不超過約2. 5EU/克蛋白，不超過約2. OEU/克蛋白，不超過約I. 5EU/克蛋白，不超過約I. OEU/克蛋白和不超過約0. 5EU/克蛋白。例如，根據(jù)多個(gè)此類方面，通常所述BBI產(chǎn)品的總內(nèi)毒素含量為約0. 5EU/克蛋白至約5EU/克蛋白，更典型為約0. 5EU/克蛋白至約2. 5EU/克蛋白，以及更典型為約0. 5EU/克蛋白至約IEU/克蛋白。BBI蛋白已知既抑制胰凝乳蛋白酶又抑制胰蛋白酶，而包含蛋白的組合物的其它組分(例如KTI蛋白)已知僅抑制胰蛋白酶。因此，目前據(jù)信胰凝乳蛋白酶抑制劑活性對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的比率是BBI蛋白的存在的指標(biāo)。一般而言，胰凝乳蛋白酶抑制劑活性對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的比率為至少約I : I、至少約I : 2、至少約I : 3、至少約I : 4、 至少約I : 5、至少約I : 6、至少約I : 7、至少約I : 8、至少約I : 9、或至少約I : 10。在本發(fā)明的特定方面，胰凝乳蛋白酶抑制劑活性對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的比率為約I : I、約 I : I. I、約 I : I. 2、約 I : I. 3、約 I : I. 4、約 I : I. 5、約 I : I. 6、約 I : I. 7、約I I. 8、或約 I : I. 9。本公開的BBI產(chǎn)品的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性(表示為胰凝乳蛋白酶抑制劑單位/克蛋白，或CIU/克蛋白)可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測定。一般而言,本公開的BBI產(chǎn)品的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性為至少約500CIU/克蛋白，更通常為至少約1000CIU/克蛋白，更通常為至少約1200CIU/克蛋白。通常，本公開的BBI產(chǎn)品的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性為至少約1600CIU/克蛋白，至少約2500CIU/克蛋白，至少約2700CIU/克蛋白，或至少約3000CIU/克蛋白。胰凝乳蛋白酶活性如此前所述(Ware等人，1997Arch. Biochem. Biophys.第344卷，第I期，第133-138頁)進(jìn)行，包括下列的改變。來自牛胰腺的a-胰凝乳蛋白酶購自Sigma Chemical Co.(目錄號(hào)C4129, St. Louis, MO),其活性胰凝乳蛋白酶通過用甲基傘形基對(duì)-三甲基氨基肉桂酰氯(MUTMAC,目錄號(hào) M5407，Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)的活性位點(diǎn)滴定，基于Jameson等人(Biochem. J. 1973131 :107-117)所述的方法進(jìn)行定量。用去離子蒸餾水(dI)H20將BBI樣品稀釋至大約Img BBI/mL(例如，稱取lmg/ml純化的BBI，SWP為10mg/ml)。在硅化微量離心管中混合以下物質(zhì)a)BBI樣品，0_5ul ；b)0. IM磷酸鈉和IM NaCl，pH7，5ul ;和c) IOul 50uM活性胰凝乳蛋白酶(溶解在ImM HCl和2mM CaCl2中)?；旌喜⑹覝叵路跤?0分鐘。為了檢測殘余的胰凝乳蛋白酶活性，用dl H2O按I : 40稀釋樣品，將25ul稀釋的樣品轉(zhuǎn)入包含895ul檢測緩沖液(0. 5M Tris,20mM CaCl2, IMNaCl,pH8. 0)和 80ul IOmM sucAAPF-pNA (目錄號(hào) S7388, Sigma chemical Co. , St. Louis,MO)的1.5ml玻璃比色杯中，混合并立即在Ab410nm以10秒間隔開始測量I分鐘。調(diào)節(jié)抑制劑溶液的濃度，使得在40-80%抑制范圍內(nèi)獲得結(jié)果，并加以外推以確定完全抑制胰凝乳蛋白酶所需的樣品量。胰凝乳蛋白酶抑制活性(Cl單位/克)被定義為能夠完全抑制Img活性胰凝乳蛋白酶的樣品的量，如Ware等人此前所描述的(1997Arch. Biochem. Biophys.第344卷，第I期，第133-138頁)。
類似地，本公開的BBI產(chǎn)品的胰蛋白酶抑制劑活性(按照胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白，或TIU/克蛋白表示)可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測定，包括例如在其中一個(gè)TIU被定義為能夠抑制Img的胰蛋白酶的底物的量，而一個(gè)胰蛋白酶單位等于在pH8. 2和37°C以苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)-硝基苯胺(BAPA)作為底物每10分鐘0. 019的A A410。一般而言，本公開的BBI產(chǎn)品的胰蛋白酶抑制劑活性為至少約400TIU/克蛋白，更通常為至少約600TIU/克蛋白，更通常為至少約800TIU/克蛋白。通常，本公開的BBI產(chǎn)品的胰蛋白酶抑制劑活性為至少約1000TIU/克蛋白，至少約1200TIU/克蛋白，至少約1400TIU/克蛋白，或至少約1600TIU/克蛋白。胰蛋白酶抑制劑活性優(yōu)選不超過約3000TIU/克蛋白(即，理論上純的)。應(yīng)當(dāng)了解，本公開的BBI產(chǎn)品可表現(xiàn)出以上指定的特征中的一種、它們的組合、或它們的全部。例如，本公開的BBI產(chǎn)品可表現(xiàn)出所指定的BBI純度和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性。BBI還可表現(xiàn)出所指定的BBI純度、胰蛋白酶抑制劑活性或胰凝乳蛋白酶抑制劑活性和本文所公開的序列。又如，所述BBI產(chǎn)品可表現(xiàn)出所指定的BBI蛋白濃度和總內(nèi)毒素 含量。在這些以及另外的方面，本公開的BBI產(chǎn)品可表現(xiàn)出所指定的總大豆蛋白濃度和胰蛋白酶抑制劑活性。BBI廣品還可表現(xiàn)出所指定的總大ii蛋白濃度和膜凝乳蛋白酶抑制劑活性。又如，本公開的BBI產(chǎn)品可表現(xiàn)出所指定的總大豆蛋白濃度和總內(nèi)毒素含量。所述BBI產(chǎn)品的特性的這些組合是示例性的，并且這一列舉并不旨在是詳盡的。也就是說，根據(jù)本公開，BBI產(chǎn)品可以任何上文所指定范圍內(nèi)的任何上文所指定的值表現(xiàn)出上文提及的特性的任何組合。本公開的BBI產(chǎn)品可用于多種藥物組合物中，所述藥物組合物可以被包括在藥物制劑中，所述藥物制劑以選自口服、局部給藥、腸胃外給藥、皮下給藥、肌內(nèi)注射、靜脈注射和腹膜內(nèi)注射中的至少一種模式被施用于患者。在本發(fā)明的某些方面，給藥途徑包括口服或腸胃外給藥。在本發(fā)明的其它方面，給藥途徑包括通過食物的方式口服。取決于治療所期望的持續(xù)時(shí)間和效果，本發(fā)明的組合物可以被施用一次或多次，以及間歇地施用，例如以不同的劑量和通過不同途徑的組合每天或每周一次，持續(xù)若干天、若干周、或若干月。本公開的BBI產(chǎn)品還可用于飲食補(bǔ)充制劑中。藥物和飲食補(bǔ)充劑組合物的適當(dāng)形式包括例如糖漿、粉末、霜膏、注射劑、懸浮液、乳液、片劑、膠囊、錠劑、栓劑和漱口劑。本發(fā)明的另一方面是提供包含本文所述的BBI產(chǎn)品的食品。此類食品可以包括但不限于飲料、塊狀加工食品、或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其它消費(fèi)品，使得當(dāng)所述食品被食用時(shí)，本文所述的BBI產(chǎn)品也被食用。在一個(gè)實(shí)施方案中，食品可以是飲料。優(yōu)選的飲料包括即飲型(RTD)飲料或干混型飲料(DBB)。該飲料可以是基本上渾濁的飲料或基本上清澈的飲料。合適飲料的非限制性實(shí)例包括牛奶飲料、類牛奶飲料(例如豆奶、米奶等)、體重控制飲料、蛋白混合飲料、代餐飲料、咖啡飲料、營養(yǎng)飲料、能量飲料、嬰兒代乳品、果汁飲料、水果飲料、果味飲料、蔬菜飲料、運(yùn)動(dòng)飲料等。飲料的PH可以變化，并且可以是酸性的、中性的、或堿性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食品可以是食物棒(壓成塊的加工食品)，如格蘭諾拉棒、谷類食物棒、營養(yǎng)棒、或能量棒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食品可以是基于谷類的食品?；诠阮惖氖称返姆窍拗菩詫?shí)例包括早餐谷類食物、意大利面食、面包、焙烤產(chǎn)品(即，粉餅、餡餅、卷狀食品、餅干、薄脆餅干)和小吃品(例如炸土豆片、脆餅干等)?；诠阮惖氖称返目墒秤貌牧峡蓙碓从谛←?例如漂白面粉、全麥面粉、麥芽精、麥麩等)、玉米(例如玉米面、玉米粗粉、玉米淀粉等)、燕麥(例如膨化燕麥、燕麥片、燕麥粉等)、大米(例如膨化大米、米粉、大米淀粉)等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述食品可以是營養(yǎng)補(bǔ)充劑。營養(yǎng)補(bǔ)充劑可以是液體或固體。除了多種藥物用途之外，本公開的BBI產(chǎn)品還適合摻入到各種個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中。例如，本公開的BBI產(chǎn)品目前據(jù)信降低了皮膚的光老化(參見例如Paine C.等人，J. Invest. Dermatol. 116 :587-595 (2001)，并因此適合摻入到化妝品和皮膚護(hù)理產(chǎn)品中。本發(fā)明的BBI能夠從任何來源或者允許從天然的基于植物的基質(zhì)離析、分離、或純化BBI的任何方法獲得。以非限制性實(shí)例的方式，天然的基于植物的基質(zhì)能夠來源于豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點(diǎn)香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風(fēng)樹、綠藻、以及它們的混合物。在本發(fā)明的特定方面，BBI是在多種工藝流中 從大豆獲得的。多種大豆工藝流包括，例如，含水的大豆提取物流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的任何流。例如來自脫脂大豆材料)、含水的豆?jié){提取物流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的來自全部或部分脫脂的大豆材料的任何流)、含水的大豆乳清流(其是由貯藏蛋白的沉淀或鹽析得到的任何乳清流；沉淀方法能夠包括高溫以及化學(xué)方法)、含水的大豆糖漿流(其是通過從含水的大豆乳清流中移除水產(chǎn)生的任何流)、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流(其是來自對(duì)來自大豆蛋白濃縮方法的可溶性糖的醇提取物的任何流)、含水的大豆透過流(其是由不同分子量的蛋白級(jí)份的分離得到的任何流，所述分離中較小分子量的蛋白通過膜)和含水的豆腐乳清流(其包括來源于豆腐凝結(jié)過程的任何乳清流。通過本發(fā)明的方法分離的BBI產(chǎn)品的量可以是低至克級(jí)(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離)或可以是若干公噸(工業(yè)或大規(guī)模分離)。C.用于獲得大豆乳清蛋白的方法分離技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，由于分離不會(huì)是100%，在每一流中能夠存在殘余的組分。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，分離技術(shù)能夠根據(jù)起始的原材料而變化。步驟0(參見圖IA)-乳清蛋白預(yù)處理能夠從包括但不限于大豆分離蛋白(ISP)糖漿、ISP乳清、大豆蛋白濃縮物(SPC)糖漿、SPC乳清、功能性大豆蛋白濃縮物(FSPC)乳清、以及它們的組合的進(jìn)料流開始。能夠用于乳清蛋白預(yù)處理步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、水、蒸汽、以及它們的組合。在調(diào)節(jié)PH之后，步驟0的pH能夠是介于約3. 0和約6. 0，或介于3. 5和5. 5之間，或約5. 3。溫度能夠是介于約70°C和約95°C之間，或約85°C。溫度保持時(shí)間可在約0分鐘至約20分鐘之間變化，或約10分鐘。在保留時(shí)間之后，所述流通過一個(gè)離心分離步驟(通常在間歇放電圓盤式凈化離心機(jī)中)以從所述乳清流分離沉淀物。來自乳清蛋白預(yù)處理的產(chǎn)物包括但不限于流Oa中的乳清流(預(yù)處理的大豆乳清)的水相中的可溶性組分(分子量等于或小于約50千道爾頓(kD))和流Ob中的不溶性大分子量蛋白(介于約300kD和約50kD之間)，例如預(yù)處理的大豆乳清、貯藏蛋白、以及它們的組合。步驟1(參見圖IA)-微生物的降低可以所述乳清蛋白預(yù)處理步驟的產(chǎn)物開始，包括但不限于預(yù)處理的大豆乳清。本步驟涉及預(yù)處理的大豆乳清的微量過濾。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離心、死端過濾、加熱滅菌、紫外滅菌、微量過濾、錯(cuò)流膜過濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟I的PH能夠是介于約2. O和約12. O，或介于約3. 5和約5. 5之間，或約5. 3。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，或介于約250C和75°C之間，或約50°C。來自步驟I的產(chǎn)物包括但不限于流Ia中的貯藏蛋白、微生物、硅、以及它們的組合和流Ib中的純化的預(yù)處理的大豆乳清。步驟2 (參見圖IA)-水和礦物的移除可以來自流Ib或4a的純化的預(yù)處理的大豆乳清、或來自流Ob的預(yù)處理的大豆乳清開始。其包括用于水的移除和部分礦物的移除的納米過濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯(cuò)流膜過濾、反向滲透、蒸發(fā)、納米過濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟2的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約3. 5和約5. 5之間，或約5. 3。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，或介于約25°C和75°C之間，或約50°C。來自這一水移除步驟的產(chǎn)物包括但不限于流2a中的純化的預(yù)處理的大豆乳清和流2b中的水、一些礦物、一價(jià)陽離子、以及它們的組合。 步驟3 (參見圖IA)-礦物沉淀步驟可以來自流2a的純化的預(yù)處理的大豆乳清或來自流Oa或Ib的預(yù)處理的大豆乳清開始。其包括通過pH和/或溫度變化沉淀的步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于攪拌的或再循環(huán)的反應(yīng)槽。能夠用于礦物沉淀步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、氯化鈉、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟3的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約8. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，或介于約25°C和75°C之間，或約50°C。pH保持時(shí)間能夠是介于約0分鐘至約60分鐘，或介于約5分鐘和約20分鐘之間變化，或約10分鐘。流3的產(chǎn)物是純化的預(yù)處理的大豆乳清和沉淀的礦物的懸液。步驟4(參見圖IA)-礦物移除步驟可以來自流3的純化的預(yù)處理的大豆乳清和沉淀的礦物的懸液開始。其包括離心步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離心、過濾、死端過濾、錯(cuò)流膜過濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。來自礦物移除步驟的產(chǎn)物包括但不限于流4a中的去礦物化的預(yù)處理的乳清和流4b中的不溶性礦物與一些蛋白礦物復(fù)合物。步驟5 (參見圖IB)-蛋白分離和濃縮步驟可以來自流4a的純化的預(yù)處理的乳清或來自流0a、lb或2a的乳清開始。其包括超濾步驟。能夠用于超濾步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、以及它們的組合。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯(cuò)流膜過濾、超濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟5的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約8. O。溫度能夠是介于約5 V和約90 V，或介于約25°C和75°C之間，或約50°C。來自流5a的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。來自流5b的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、礦物、以及它們的組合。步驟6 (參見圖IB)-蛋白洗滌和純化步驟可以來自流4a或5a的大豆乳清蛋白、BBI, KTI、貯藏蛋白、其它蛋白或純化的預(yù)處理的乳清、或來自流Oa、lb、或2a的乳清開始。其包括滲濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于再漿化、錯(cuò)流膜過濾、超濾、水滲濾、緩沖液滲濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用于蛋白洗滌和純化步驟中的加工助劑包括但不限于水、流、以及它們的組合。步驟6的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，介于約25°C和75°C之間，或約50°C。來自流6a的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。來自流6b的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。步驟7 (參見圖IC)-水移除步驟可以來自流5b和/或流6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括納米過濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、蒸發(fā)、納米過濾、水滲濾、緩沖液滲濾、以及它們的組合。步驟7的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，介于約25°C和75°C之間，或約50°C。來自流7a的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流7b的產(chǎn)物包括但不限于水、礦 物、以及它們的組合。步驟8 (參見圖IC)-礦物移除步驟可以來自流5b、6b、7a和/或12b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括電滲析膜步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離子交換柱、層析、以及它們的組合。能夠用于這一礦物移除步驟中的加工助劑包括但不限于水、酶、以及它們的組合。酶包括但不限于蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟8的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，介于約25°C和50°C之間，或約40°C。來自流8a的產(chǎn)物包括但不限于去礦物化的大豆低聚糖，所述去礦物化的大豆低聚糖具有介于約10毫西門子/厘米(mS/cm)和約0. 5mS/cm之間，或約2mS/cm的電導(dǎo)率。來自流8b的產(chǎn)物包括但不限于水、礦物、以及它們的組合。步驟9 (參見

圖10_顏色移除步驟可以來自流8&、513、613、1213和/或7&的去礦物化的大豆低聚糖開始。其利用活性炭床。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離子交換。能夠用于這一顏色移除步驟中的加工助劑包括但不限于活性炭、離子交換樹脂、以及它們的組合。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間，或約40°C。來自流9a的產(chǎn)物包括但不限于顏色化合物。流9b為脫色的溶液。來自流9b的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖及其組合。步驟10 (參見圖1C)-大豆低聚糖分級(jí)步驟可以來自流9b、5b、6b、7a和/或8a的大豆低聚糖及其組合物開始。其包括層析步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于層析、納米過濾、以及它們的組合。能夠用于這一大豆低聚糖分級(jí)步驟中的加工助劑包括但不限于酸或堿，以如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知地基于所使用的樹脂調(diào)節(jié)pH。來自流IOa的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。來自流IOb的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。步驟11 (參見圖IC)-水移除步驟可以來自流9b、5b、6b、7a、8a和/或IOb的大豆
低聚糖開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、蒸發(fā)、納米過濾、以及它們的組合。能夠用于這一水移除步驟中的加工助劑包括但不限于消泡劑、流、真空、以及它們的組合。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間，或約60°C。來自流Ila的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流Ilb的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。 步驟12 (參見圖1C)-附加的從大豆低聚糖分離蛋白的步驟可以來自流7a、5b和/或6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括超濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯(cuò)流膜過濾、孔徑介于約50kD和約IkD之間的超濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用于這一從糖類分離蛋白的步驟的加工助劑包括但不限于酸、堿、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟12的pH能夠是介于約
2.0和約12. 0之間，或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，介于約25°C和75°C之間，
或約50°C。來自流12b的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流12a的產(chǎn)物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟13(參見圖IC)-水移除步驟可以來自流12a的肽和其它蛋白開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、納米過濾、噴霧干燥、以及它們的組合。來自流13a的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流13b的產(chǎn)物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟14 (參見圖1B)-蛋白分級(jí)步驟可通過以來自流6a和/或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合開始進(jìn)行。其包括超濾(具有300kD至IOkD的孔徑)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯(cuò)流膜過濾、超濾、納米過濾、以及它們的組合。錯(cuò)流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動(dòng)態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟14的pH能夠是介于約2. 0和約12. 0，或介于約6. 0和約9. 0之間，或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C，介于約25°C和75°C之間，或約50°C。來自流14a的產(chǎn)物包括但不限于貯藏蛋白。來自流14b的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟15 (參見圖IB)-水移除步驟可以來自流6a、5a和/或14b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于蒸發(fā)、納米過濾、R0、以及它們的組合。來自流15a的產(chǎn)物包括但不限于水。流15b產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟16(參見圖IB)-熱處理步驟和瞬間冷卻步驟可以來自流6a、5a、14b和/或15b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括超高溫步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于加熱滅菌、蒸發(fā)、以及它們的組合。能夠用于這一熱處理和瞬間冷卻步驟中的加工助劑包括但不限于水、流、以及它們的組合。所述加熱步驟的溫度能夠是介于約129°C和約160°C之間，或約152°C。溫度保持時(shí)間能夠是介于約8秒和約15秒之間，或約9秒。瞬間冷卻后，溫度能夠是介于約50°C和約95°C之間，或約82V。來自流16的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白。步驟17 (參見圖1B)-干燥步驟可以來自流6a、5a、14b、15b和/或16的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括干燥步驟。液體進(jìn)料溫度能夠是介于約50°C和約95°C之間，或約82°C。入口溫度能夠是介于約175°C和約370°C之間，或約290°C。排氣溫度能夠是介于約65°C和約98°C之間，或約88°C。來自流17a的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流17b的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白，其包括BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白以及它們的組合。D.含水的乳清流含水的乳清流和糖漿流是大豆工藝流的類型，它們是從精煉完整豆類或油料種子的方法產(chǎn)生的。完整的豆類或油料種子可以來源于多種適合的植物。以非限制性實(shí)例的方式，適合的植物包括豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點(diǎn)香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風(fēng)樹、綠藻、以及它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述豆科植物是大豆，并且從精煉大豆的方法產(chǎn)生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。在大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流一般是相對(duì)稀釋的并且通常作為廢物被丟棄。更具體地，通常所述含水的大豆乳清流具有小于約10重量％，通常小 于約7. 5重量％，以及更典型小于約5重量％的總固體含量。例如，在多個(gè)方面，所述含水的大豆乳清流的固體含量為約0. 5重量％至約10重量％，約I重量％至約4重量％，或約I重量％至約3重量％ (例如，約2重量％)。因此，在商業(yè)化的大豆蛋白分離物生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了必須被處理或處置的顯著體積的廢水。大豆乳清流通常包含大部分起始大豆材料的初始大豆蛋白含量。如本文所用，術(shù)語“大豆蛋白”一般是指來源于大豆的任何和全部的蛋白。天然存在的大豆蛋白一般是具有被親水外殼圍繞的疏水核心的球狀蛋白。大量的大豆蛋白已被鑒定，包括例如貯藏蛋白如大豆球蛋白和￠-伴球蛋白。大豆蛋白同樣包括蛋白酶抑制劑，如上文提及的BBI蛋白。大豆蛋白也包括血球凝集素如凝集素、脂氧合酶、3-淀粉酶和露那辛。值得注意的是，大豆植物可以被轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生通常不被大豆植物表達(dá)的其它蛋白。應(yīng)當(dāng)了解，本文提及“大豆蛋白”時(shí)同樣設(shè)想了如此產(chǎn)生的蛋白?；诟芍?，大豆蛋白占大豆乳清流的至少約10重量％，至少約15重量％，或至少約20重量％ (基于干重)。通常大豆蛋白占大豆乳清流的約10重量％至約40重量％，或約20重量％至約30重量％ (基于干重)。大豆蛋白分離物通常包含大部分大豆的貯藏蛋白。然而，在分離物沉淀之后剩余的大豆乳清流同樣包含一種或多種大豆貯藏蛋白。除多種大豆蛋白之外，含水的大豆乳清流還同樣包含一種或多種碳水化合物(即糖類)。一般而言，糖類占大豆乳清流的至少約25重量％，至少約35重量％，或至少約45重量％ (基于干重)。通常糖類占大豆乳清流的約25重量％至約75重量％，更典型約35重量%至約65重量0Z0，更典型約40重量0Z0至約60重量0Z0 (基于干重)。大豆乳清流的糖類一般包括一種或多種單糖和/或一種或多種低聚糖或多糖。例如，在多個(gè)方面，所述大豆乳清流包含選自葡萄糖、果糖、以及它們的組合的單糖。通常單糖占大豆乳清流的約0. 5重量％至約10重量％，更典型約I重量％至約5重量％ (基于干重)。還根據(jù)這些以及多個(gè)其它方面，所述大豆乳清流包含選自蔗糖、棉子糖、水蘇糖、以及它們的組合的低聚糖。通常低聚糖占大豆乳清流的約30重量％至約60重量％，更典型約40重量％至約50重量％ (基于干重)。
含水的大豆乳清流還通常包含包括多種組分的灰分，所述組分包括例如多種礦物、植酸、檸檬酸和維生素。通常存在于大豆乳清流中的礦物包括鈉、鉀、鈣、磷、鎂、氯、鐵、錳、鋅、銅、以及它們的組合。存在于大豆乳清流中的維生素包括例如硫胺素和核黃素。無論其確切的組成如何，通常灰分占大豆乳清流的約5重量％至約30重量％，更典型約10重量％至約25重量％ (基于干重)。含水的大豆乳清流還通常包含脂肪級(jí)份，一般脂肪級(jí)份占大豆乳清流的約0. I重量％至約5重量(基于干重)。在本發(fā)明的某些方面，脂肪含量通過酸水解測量，并且占大豆乳清流的約3重量％ (基于干重)。除了上述組分之外，含水的大豆乳清流通常還包含一種或多種微生物，包括例如多種細(xì)菌、霉菌和酵母。這些組分的比例通常為約1X102至約IXlO9菌落形成單位數(shù)(CFU)每毫升不等。如本文中其它地方所詳述的，在多個(gè)方面，在蛋白回收和/或分離之前，含水的大豆乳清流被處理以移除這些組分。
如所指出的，大豆蛋白分離物的常規(guī)的生產(chǎn)通常包括處理大豆蛋白分離物的分離之后剩余的含水的大豆乳清流。根據(jù)本公開，一種或多種蛋白和多種其它組分(例如，糖類和礦物)的回收導(dǎo)致相對(duì)純的含水的大豆乳清流。蛋白和一種或多種組分未被移除的常規(guī)的大豆乳清流一般要求在處置和/或再利用之前進(jìn)行處理。根據(jù)本公開的多個(gè)方面，所述含水的乳清流可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被利用。例如，所述含水的乳清流可以在本公開的一個(gè)或多個(gè)過濾(例如，滲濾)操作中被使用。除了從大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流回收BBI蛋白之外，應(yīng)當(dāng)了解，本文所述的方法還同樣適合用于回收大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的大豆糖漿流的一種或多種組分，因?yàn)榇蠖固菨{流是附加類型的大豆工藝流。F. BBI蛋白的回收本文所述的方法涉及純化的BBI蛋白的回收和分離，所述BBI蛋白存在于產(chǎn)生自完整的豆類或油料種子的精煉方法的含水的乳清流中。如上文所論及，所述完整的豆類或油料種子可以來源于多種適合的植物。以非限制性實(shí)例的方式，適合的植物包括豆科或非豆科的植物，包括如大豆、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點(diǎn)香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風(fēng)樹、綠藻、以及它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述豆科植物是大豆，并且從精煉大豆的方法產(chǎn)生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。本公開包括多種適用于從在大豆蛋白分離物的生產(chǎn)中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流回收BBI蛋白的方法。一般而言，本公開的方法包括一個(gè)或多個(gè)操作，所述操作被設(shè)計(jì)和配置為分離出大豆工藝流(包括例如含水的大豆乳清流)的特定組分。—般而言，根據(jù)本公開，任何本領(lǐng)域中熟知的多種分離和純化技術(shù)可以被用于移除存在于含水的大豆乳清中的多種干擾組分和從其分離純化的BBI蛋白，所述技術(shù)包括例如膜分離技術(shù)(例如，過濾，如超濾、微量過濾、納米過濾和/或反向滲透)、層析分離技術(shù)(例如，離子交換層析、膜層析、吸附層析、尺寸排阻層析、反相層析和親和層析，其包括例如陰離子或陽離子交換層析、模擬移動(dòng)床層析、膨脹床吸附層析、凝膠過濾、反相層析、離子交換膜層析和/或混合床離子交換層析)、電泳、滲析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、以及它們的組合。上述多種組分的分離的主要原理是分子大小，盡管在過濾應(yīng)用中，過濾介質(zhì)的滲透性能夠被樣品的化學(xué)、分子或靜電特性影響。如本文中其它地方所詳述的(例如，下文提及圖2時(shí))，本公開的方法通常利用多于一種的取決于待移除的乳清流的特定組分的分離膜。例如，所述方法的一個(gè)步驟可以利用超濾分離膜，然后的一個(gè)或多個(gè)步驟利用納米過濾分離膜。在多個(gè)方面，本公開提供了用于回收和分離純化的BBI蛋白的方法，所述BBI蛋白存在于大豆蛋白分離物的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流中。應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的方法不限于大豆乳清或大豆糖漿流，并且可被用于從很多種豆科或非豆科植物工藝流回收蛋白和多種其它組分。在多個(gè)方面，包含高比例的BBI蛋白級(jí)份被從大豆乳清流回收。例如，如本文其它地方所詳述的，本公開的方法提供了具有此前未達(dá)到的水平的純度的BBI蛋白組合物。
通過本公開的方法處理的大豆乳清流一般是相對(duì)稀釋的。為了有利于BBI蛋白的回收和/或分離，所述乳清流優(yōu)選在所述方法的初始步驟中被濃縮。大豆乳清流的濃縮有助于從所述乳清流回收和分離BBI蛋白。例如，在本公開的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在回收BBI蛋白之前，通過使含水的大豆乳清或其級(jí)份與分離膜接觸以形成包含含水的大豆乳清的保留物和包含水的透過物，從所述含水的大豆乳清移除了水。在本公開的其它實(shí)施方案中，水可通過本領(lǐng)域已知的任何方法例如通過蒸發(fā)從所述大豆乳清移除。隨著BBI蛋白的回收，本公開的方法通常將蛋白自存在于大豆乳清流中的糖類分離。任選地，本公開的方法可以被配置和控制以將大豆乳清流中的糖分離至一種或多種級(jí)份(例如，單糖富集的級(jí)份和/或低聚糖富集的級(jí)份)。這可以在多個(gè)步驟中完成以將不同的糖類從蛋白分離。因此，糖類從大豆乳清流的回收提供了進(jìn)一步的產(chǎn)品流。如所指出的，糖類的移除通常產(chǎn)生糖類能夠被從其分離的級(jí)份，所述分離產(chǎn)生濃縮的糖類級(jí)份和可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被回收利用的相對(duì)純的含水級(jí)份。在處理所述保留物以移除糖類之后，所述保留物被進(jìn)一步處理以移除附加的組分。如所指出的，可通過本公開被處理的多種大豆乳清流包括一種或多種礦物(例如，磷和鈣)。已經(jīng)注意到，一種或多種礦物的存在可通過例如膜的污染和從所期望回收的組分(即，KTI蛋白)分離方面的困難而對(duì)下游的處理構(gòu)成挑戰(zhàn)。除了一般地回收這些所期望的組分之外，從大豆乳清移除礦物目前據(jù)信還有助于回收具有較高純度的BBI產(chǎn)品。如本文中其它地方所詳述的，從大豆乳清移除礦物一般可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行，所述方法包括例如沉淀和離心。由于植酸通常存在于通過本發(fā)明的方法處理的含水的大豆乳清流中，礦物如鈣和鎂通常以植酸鈣和植酸鎂的形式被回收。其它被移除的礦物還可包括例如鈉、鉀、鋅、鐵、錳和銅。在關(guān)于不溶性固體的移除的某些方面，微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、以及它們的組合可以被使用。通過這些方法移除的不溶性固體通常大于5微米。微量過濾是通過使用微量過濾膜將固體顆粒從流體分離的方法。適合的微量過濾膜由本領(lǐng)域已知的適當(dāng)材料構(gòu)成，所述材料包括例如聚砜、改性聚砜、陶瓷和不銹鋼。微量過濾膜通常具有約0. I微米至約20微米范圍的孔徑。在某些方面，微量過濾膜具有約0. 2微米至約2微米范圍的孔徑。
超濾與微量過濾類似，但在分離膜的孔徑方面不同。超濾膜通常被用于從具有較低分子量的分子分離具有較高分子量的分子(包括例如蛋白。適合的超濾膜通常由本領(lǐng)域已知的適當(dāng)材料構(gòu)成，所述材料例如聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、再生纖維素、陶瓷、不銹鋼、或薄膜復(fù)合材料。超濾膜通常具有約I千道爾頓(kDa)至約300kDa或約5kDa至約50kDa的阻隔分子量。除此之外或作為另外一種選擇，適合的超濾膜可具有約0. 002微米至約0. 5微米的孔徑。納米過濾被用于流體移除小分子。適合的納米過濾膜通常由本領(lǐng)域已知的適當(dāng)材料構(gòu)成(例如聚醚砜、聚砜、陶瓷和聚酯上的聚酰胺型薄膜復(fù)合材料)并且通常具有約0. IkDa至約5kDa或約IkDa至約4kDa的MWC0。除此之外或作為另外一種選擇，適合的納米過濾膜可具有約0. 9納米至約9納米的孔徑。反向滲透(或超濾)通常被用于糖類的濃縮。適合的反向滲透膜包括本領(lǐng)域一般已知的那些(例如，具有小于0. 5nm的孔徑的膜)。本發(fā)明的過濾步驟中利用的分離膜可以單獨(dú)地或以組合方式根據(jù)本領(lǐng)域已知的一種或多種配置方式被布置。例如，膜可以平板的形式、或者以多層膜在其中被組合到一起(連同分離器篩網(wǎng)的任選的層)的盒模塊的形式被配置。含水的大豆乳清通常在膜堆的一端被引入交替通道，并且流體通過膜進(jìn)入一個(gè)或多個(gè)濾液或透過物通道。分離膜也可被布置在螺旋狀的模塊中，在其中交替的膜的層圍繞著中空的中心核。含水的大豆乳清被引入所述模塊的一個(gè)末端，而流體通過所述交替的膜的層流向并進(jìn)入所述模塊的核心。又如，分離膜可被布置在中空纖維模塊中，所述模塊包括一束相對(duì)窄的膜管。含水的大豆乳清被引入所述模塊中，并且流體沿痛過所述模塊的大豆乳清的流的橫向通過膜管束。適合的膜的布置描述于例如美國專利6，946，075中，其全文以引用方式并入本文。如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明的過濾步驟可以采用直接(常規(guī)流)過濾或切向(錯(cuò) 流)過濾。在直接或常規(guī)流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)被直接向著分離膜運(yùn)送。作為另外一種選擇，在切向或錯(cuò)流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)可以沿分離膜表面的切向被運(yùn)送。切向或錯(cuò)流過濾的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，含水的大豆乳清的流切向施加在膜上的摩擦或掃刮力通常有助于維持流量。相應(yīng)地，在多個(gè)方面，本公開的方法中的一個(gè)或多個(gè)步驟、以及它們的組合按照錯(cuò)流過濾操作。適合的錯(cuò)流過濾器包括本領(lǐng)域中一般已知的那些，包括美國專利6，946，075中描述的那些。應(yīng)當(dāng)了解，流體的通過可以根據(jù)常規(guī)的和/或切向的(即，交錯(cuò)的)流適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。還應(yīng)當(dāng)了解，流體穿越其它膜分離單元的通過可以根據(jù)這些機(jī)制中的一種或全部兩種進(jìn)行，所述其它膜分離單元詳述于本文中與2中描述的實(shí)施方案以及其它方面相關(guān)的其它地方。本發(fā)明所描述的方法涉及選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x操作或操作的組合，以從大豆乳清流順序移除多種組分和回收或分離純化的BBI產(chǎn)品，所述BBI產(chǎn)品包含本領(lǐng)域此前尚未達(dá)到的水平的純度。在本發(fā)明的某些方面，并且如本文其它地方所詳述的，用于回收BBI蛋白的方法利用膜分離和層析分離(例如離子交換)操作的組合。在多個(gè)方面，單獨(dú)的BBI蛋白的回收通過模擬移動(dòng)床操作(本領(lǐng)域中經(jīng)常稱為“SMB”配置)進(jìn)行。如本文中其它地方所指出的，通過本公開的方法處理的含水的大豆乳清流一般是相對(duì)稀釋的。在多個(gè)方面，在回收作為靶標(biāo)的個(gè)別的蛋白之前，含水的大豆乳清通過例如水的移除，以至少約2 (例如，約3或約6)的系數(shù)被濃縮。
與用于回收BBI蛋白的其它方法相比，至少部分地由于其處理含水的大豆乳清的多個(gè)樣品的能力，使用模擬移動(dòng)床回收非BBI的蛋白一般也可以提供低成本、通量和/或靈活性的優(yōu)勢。已經(jīng)注意到，大豆乳清流的一種或多種組分可干擾BBI蛋白的回收。例如，在大豆蛋白分離物制造過程中，硅化合物(通常為硅氧烷)經(jīng)常作為消泡劑被引入，通常是以包含娃的化合物的形式，例如可從Hydrite Chemical或Emerald Performance Materials商購獲得的那些。無論確切的來源如何，有機(jī)硅化合物通常以按硅含量計(jì)最高約15份每一百萬份(ppm)、最高約lOppm、或最高約5ppm的濃度存在于大豆乳清流中。有機(jī)娃化合物的存在一般是不可取的，因?yàn)樗赡軙?huì)干擾大豆乳清流的BBI蛋白的回收。相應(yīng)地，在多個(gè)方面，在用于回收和分離BBI蛋白的操作之前，硅氧烷和/或其它有機(jī)硅化合物從大豆乳清流移除，如本文中其它地方所詳述的。優(yōu)選地，硅化合物被移除至使得大豆乳清包含不超過痕量級(jí)有機(jī)硅的程度，如本文中進(jìn)一步所詳述的。除此之外或作為另外一種選擇，含水的大豆乳清可包含一種或多種微生物，所述微生物可干擾所述含 水的大豆乳清的所期望的組分的回收，和/或在所述方法的最終的回收的產(chǎn)品中是不可取的。為了移除這些干擾組分，可使用選擇性保留硅消泡劑和/或一種或多種微生物的分離膜過濾所述大豆乳清流，以產(chǎn)生包含硅和/或一種或多種微生物的保留物和包含含水的大豆乳清的透過物。這一初始純化中使用的特定膜(包括例如微量過濾)是根據(jù)待移除的組分選擇的。無論所選擇的膜的類型和從大豆乳清流移除的組分如何，優(yōu)選所期望的BBI蛋白的至少主要部分、并且優(yōu)選所期望的BBI蛋白的基本上全部存在于保留物中。進(jìn)而就這一點(diǎn)而言，應(yīng)當(dāng)注意的是，提及包含含水的大豆乳清的透過物時(shí)表示用于移除一種或多種雜質(zhì)的對(duì)乳清流的處理對(duì)所述大豆乳清流的其它組分具有很小的(如果存在的話)影響。在多個(gè)供選擇的替代方面，所述乳清流中包含的細(xì)菌可在蛋白的回收之前通過加熱被殺死。加熱大豆乳清流以殺滅細(xì)菌的方式是不嚴(yán)格的，并且一般可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行。然而，加熱大豆乳清流以殺滅微生物可能引入蛋白變性的風(fēng)險(xiǎn)。相應(yīng)地，通過不包括對(duì)大豆乳清流的加熱的方法將細(xì)菌和其它微生物從大豆乳清流移除一般是優(yōu)選的。圖2描述了用于從在大豆蛋白分離物的生成中產(chǎn)生的大豆乳清流中回收一種或多種單獨(dú)的蛋白的本公開的方法的實(shí)施方案。如圖2中所示，含水的大豆乳清I被引入包含第一過濾進(jìn)料區(qū)域6的膜分離單元5中，所述第一過濾進(jìn)料區(qū)域6以比分離膜7另一側(cè)的第一透過區(qū)域8中的壓力更高的壓力與所述膜的一側(cè)接觸。優(yōu)選地，膜分離單元5包含至少一種微量過濾膜?？缭侥し蛛x單元5中的分離膜7的跨膜壓力一般為至少約5psi、至少約25psi、至少約50psi、至少約lOOpsi、或至少約150psi。流體通常以至少約I升流體/小時(shí)-平方米、或約I升流體/小時(shí)-平方米至約200升流體/小時(shí)-平方米橫截面膜區(qū)域(橫向于流動(dòng)方向)的體積流量或流量通過所述膜。流量可以被例如過濾的類型、膜的污染等影響。大豆乳清通常以約0°C至約100°C，更典型以約25°C至約60°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進(jìn)料區(qū)域。通常，含水的大豆乳清I由于保留物的原因體積減少約5%。
流體穿越分離膜的通過導(dǎo)致第一保留物9和第一透過區(qū)域8中的第一透過物13。所述第一保留物9將主要包含一種或多種微生物和不溶性材料。更具體地，所述第一保留物9通常相對(duì)于所述第一透過物13富集了微生物。優(yōu)選地，所述第一保留物9包含所述含水的大豆乳清的微生物含量的主要部分或全部。甚至更優(yōu)選地，所述第一保留物9還包含消泡劑(例如，存在于所述含水的大豆乳清中的有機(jī)硅的硅或包含脂質(zhì)的化合物)的主要部分。更具體地，基于消泡劑含量，所述第一保留物9包含至少約70重量％，更優(yōu)選至少約80重量％，甚至更優(yōu)選至少約90重量％的含水的大豆乳清的消泡劑含量。所述第一透過物13將主要包含所述含水的大豆乳清流的全部的多種剩余組分，例如可溶性大豆貯藏蛋白、大豆乳清蛋白、多種糖類、水、礦物、異黃酮素和維生素。再次就圖2而言，所述第一透過物13被引入包含第二過濾進(jìn)料區(qū)域18的膜分離單元17中，所述第二過濾進(jìn)料區(qū)域18以比第二透過區(qū)域20中的壓力更高的壓力與分離膜 19的一側(cè)接觸。膜分離單元17優(yōu)選包含至少一種超濾膜作為分離膜19。跨越膜分離單元17中的分離膜19的跨膜壓力一般為至少約5psi、至少約lOpsi、至少約25psi、至少約50psi、至少約lOOpsi、或至少約150psi。流體通常以至少約I升流體/小時(shí)-平方米、或約I升流體/小時(shí)-平方米至約150升流體/小時(shí)-平方米橫截面膜區(qū)域(橫向于流動(dòng)方向)的體積流量或流量通過所述膜。大豆乳清通常以約0°C至約100°C，更典型以約25°C至約60°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進(jìn)料區(qū)域。通常含水的大豆乳清I以至少約5、或約5至約75(例如，約25)的濃縮系數(shù)被濃縮。超濾步驟可以任選地包括滲濾。滲濾體積通常為約I份直到約10份滲濾體積每份保留物范圍。流體穿越所述分離膜的通過導(dǎo)致第二保留物21和第二透過物25。所述第二保留物21包含大部分所述含水的大豆乳清的蛋白含量，并因此被進(jìn)一步處理以回收BBI蛋白。優(yōu)選地，所述第二保留物21包含存在于被引入所述第一過濾進(jìn)料區(qū)域6的含水的大豆乳清中的多種大豆乳清蛋白的至少約25重量％至至少約90重量％ (例如，至少約50重量％ )(基于干重)。再次就圖2而言，所述第二透過物25 —般包含沒有被回收至第二保留物21中的任何蛋白和所述大豆乳清流的多種其它組分(例如，多種糖類、水、礦物、維生素和異黃酮素)。盡管未圖示于圖2中，所述第二透過物25的組分可按照適當(dāng)?shù)姆蛛x操作被進(jìn)一步處理，以分離和/或移除來自所述含水的乳清流的單獨(dú)的組分。在附加的分離步驟之后，將優(yōu)選地形成相對(duì)純的水流，其在被處置或使用之前需要最低限度的處理(如果存在的話)。因此，本文所述的發(fā)明還通過例如改善環(huán)境品質(zhì)而具有環(huán)境有益效果。將所述第二保留物21與載體流23混合以形成進(jìn)料24，通向包含至少一種離子交換樹脂30的離子交換柱或單元29。所述載體流的確切位置不被嚴(yán)格要求。因此，本文所述的發(fā)明還通過例如改善環(huán)境品質(zhì)而具有環(huán)境有益效果。在BBI蛋白的回收的多個(gè)方面，所述載體流包括非揮發(fā)性的緩沖液，包括如檸檬酸鈉，或揮發(fā)性的緩沖液，包括如甲酸銨。例如，在多個(gè)方面，所述載體流包括在含水混合物中以約10毫摩爾每升至約30毫摩爾每升(例如，20mM)。所述第二保留物21和/或進(jìn)料流24的pH影響大豆蛋白的溶解度，而沉淀的蛋白可以導(dǎo)致離子交換樹脂的污染。因此，可能期望將流向離子交換柱的進(jìn)料的PH控制在某些范圍內(nèi)(例如，通過緩沖作用)。如果必要，可通過例如稀釋所述第二保留物、載體流和/或通過所述保留物和載體流的混合提供的進(jìn)料，將所述進(jìn)料的PH維持在所述范圍內(nèi)。稀釋劑的組成沒有嚴(yán)格要求，通常為可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地選擇的含水介質(zhì)(例如，去離子水)。除了影響所述進(jìn)料的PH外，稀釋還通常降低所述進(jìn)料的內(nèi)在離子強(qiáng)度，這促進(jìn)了蛋白與離子交換樹脂的結(jié)合。除此之外或作為另外一種選擇，所述進(jìn)料的PH可通過載體流的選擇來控制。離子交換樹脂被選擇為適用于第二保留物21和進(jìn)料24中存在的一種或多種蛋白的選擇性保留和回收。在多個(gè)方面，所述離子交換樹脂被選擇用于BBI蛋白的選擇性保留或非BBI蛋白的保留，使得BBI蛋白與非BBI蛋白分離。以下的討論聚焦在從含水的大豆乳清(例如，第二保留物21)回收和分離BBI蛋白上。然而，應(yīng)當(dāng)了解，下列的流程能夠容易地適應(yīng)其它靶蛋白(例如KTI蛋白)的回收以及含水的之外的其它類型的輸入流(例如，從噴霧干燥的復(fù)原的)。無論離子交換單元的確切配置如何，適用于BBI蛋白的回收的離子交換樹脂包括多種陽離子和陰離子交換樹脂。取決于進(jìn)入離子交換柱的進(jìn)料，盡管陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂均適用于回收BBI蛋白，所述離子交換樹脂在多個(gè)方面包括陽離子交換樹 月旨。例如，暴露于低于其等電點(diǎn)(Pl)的PH中的蛋白更加可能具有帶正電荷的區(qū)域，并因此更加牢固地與陽離子交換樹脂結(jié)合。所述進(jìn)料流中的大多數(shù)蛋白具有比BBI的pi和所述進(jìn)料通常的PH更高的pi。因此，這些蛋白通常更加牢固地與所述樹脂結(jié)合。包含BBI蛋白級(jí)份可通過使樹脂與適當(dāng)?shù)南疵搫┙佑|而被容易地從離子交換柱上洗脫。作為另外一種選擇，所述進(jìn)料的pH可以被控制為低于BBI蛋白的pl，以通過離子交換樹脂提供BBI蛋白的保留。其它蛋白(例如KTI蛋白)也與所述樹脂結(jié)合。然而，所期望的級(jí)份的回收可通過使離子交換樹脂與用于蛋白級(jí)份的差別洗脫的適當(dāng)?shù)南疵搫┙佑|進(jìn)行。適當(dāng)?shù)年栯x子交換樹脂包括本領(lǐng)域所熟知的多種樹脂。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換樹脂包括Poros 20HS-由Applied Biosystems制造的交聯(lián)的多聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)，其表面涂覆了用磺基丙基(例如，丙烷磺酸，-CH2CH2CH2S(V)官能化的多羥基聚合物。已經(jīng)觀察到，調(diào)節(jié)保留物和/或進(jìn)料的pH可以導(dǎo)致非BBI蛋白的沉淀。在這樣的實(shí)例中，沉淀的蛋白可以在引入離子交換柱之前通過任何的膜分離技術(shù)(例如，過濾，如超濾、微量過濾、納米過濾和/或反向滲透)、層析分離技術(shù)(例如，離子交換層析、吸附層析、尺寸排阻層析、反相層析和親和層析，其包括例如陰離子或陽離子交換層析、模擬移動(dòng)床層析、膨脹床吸附層析、凝膠過濾、反相層析、離子交換膜層析和/或混合床離子交換層析)、電泳、滲析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、重力分離(包括分別使用例如硫酸銨或氯化銨的鹽析或鹽溶)、或它們的組合從所述進(jìn)料分離(未顯示于圖2中)。分離可以在約I至10的pH范圍在約0°C至100°C的溫度下進(jìn)行。再次就圖2而言，在進(jìn)料24通過了離子交換柱30之后，回收了洗脫的BBI蛋白流33。如果必要的話，使離子交換樹脂與適當(dāng)?shù)南疵搫┙佑|，以產(chǎn)生包含洗脫的BBI蛋白的流33和包含KTI蛋白的流37。蛋白從離子交換柱的洗脫通常通過多階段的方法進(jìn)行。根據(jù)多個(gè)方面，在第一階段，所述柱與用于從離子交換樹脂移除BBI蛋白的洗脫劑接觸。適當(dāng)?shù)南疵搫├绨然c與檸檬酸鈉的混合物。例如，適當(dāng)?shù)南疵搫┠軌虬ㄊ褂肐mM和400mM之間的溶液、氯化鈉對(duì)檸檬酸鈉的體積比為約15 I至約25 I的氯化鈉和檸檬酸鈉的混合物。除如此洗脫的BBI蛋白之外，取決于條件(例如，pH、離子強(qiáng)度等)，包含BBI蛋白的流能夠通過離子交換柱(例如，流穿)。洗脫緩沖液包括例如緩沖液和適當(dāng)?shù)姆措x子，這能夠由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。在第二階段，離子交換樹脂與用于以例如包含KTI蛋白的流37的形式移除非BBI蛋白的洗脫劑接觸。在本發(fā)明的某些方面，在其中使用不保留BBI蛋白(既，流穿)的離子交換柱獲得BBI蛋白，BBI蛋白具有與柱的固定相相同的電荷并因此流穿而不被保留。然而，非BBI的蛋白被所述柱保留。再次就圖2而言，包含BBI蛋白的流33與液體沉淀介質(zhì)45 —起被引入包含沉淀區(qū)域的分離單元41中。一般而言，所述液體沉淀介質(zhì)45包含沉淀劑。通常，所述液體沉淀劑包含硫酸銨以從BBI蛋白流33沉淀BBI蛋白。在多個(gè)方面，所述液體沉淀介質(zhì)以約30% 至約60% (例如約40%至約50% )的濃度或其在所述液體沉淀介質(zhì)中的飽和濃度包含硫酸銨。BBI蛋白級(jí)份33與沉淀介質(zhì)45在沉淀區(qū)域內(nèi)的接觸形成了沉淀的BBI蛋白級(jí)份49和被從分離單元41移除的上清液53。在鹽或緩沖液的存在或不存在下，所述沉淀的BBI蛋白級(jí)份49與含水的洗漆介質(zhì)57混合以形成溶解的BBI蛋白級(jí)份61。所述BBI蛋白級(jí)份61可以包含殘余的沉淀劑(例如硫酸銨)和一種或多種其它雜質(zhì)。如圖2中所示，溶解的蛋白級(jí)份61被引入滲析或滲濾單元65中以移除任何殘余的沉淀劑和一種或多種雜質(zhì)。所述滲析或滲濾單元的形式或配置無嚴(yán)格要求，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇所述單元。例如，可以使用包括適當(dāng)?shù)臐B析盒(例如Slide-A-Lyzer,由 Thermo Scientific Pierce Protein Research Products 制造，具有2000道爾頓的阻隔分子量)的滲析單元或包括錯(cuò)流過濾膜(其可以更適合用于大規(guī)模分離)的滲濾單元。殘余的沉淀劑和/或雜質(zhì)的移除通過監(jiān)測溶解的蛋白級(jí)份61的電導(dǎo)率來確定。一旦實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)移除，即從滲析或滲濾單元65移走純化的BBI溶解的蛋白級(jí)份73。純化的溶解的BBI蛋白級(jí)份73可以被引入干燥單元77 (例如冷凍干燥單元或噴霧干燥單元)以形成干燥的純化的BBI蛋白產(chǎn)品81。任選地，對(duì)純化的溶解的BBI蛋白級(jí)份73的處理從所述BBI蛋白級(jí)份移除了一種或多種剩余的雜質(zhì)，以形成本發(fā)明的純化的BBI蛋白產(chǎn)品81。例如，使用丁Htonli X114進(jìn)行處理以移除一種或多種內(nèi)毒素。圖3示出了對(duì)如圖2所示的本發(fā)明的方法過程中分離的多種保留物和透過物的SDS-PAGE純度分析，包括最終的BBI產(chǎn)品。泳道I描述了分離之前的大豆乳清的組成并且顯示了多重組分的存在。與此相對(duì)，泳道8描述了按照本發(fā)明的分離方法從大豆乳清分離的BBI蛋白并且?guī)缀醪缓郊拥慕M分，這意味著高水平的純度。圖2中所描述的方法設(shè)計(jì)不限于原料或以上所示的大豆乳清組分的分離和回收的順序，并且可被用于制備與上文所論及的那些不同的工藝流，包括例如如所附權(quán)利要求中所示的。F.制備BBI蛋白的附加的方法在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的BBI蛋白通過例如重組方法或合成產(chǎn)生。本發(fā)明的蛋白的重組制備使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。此類方法包括例如制備一種或多種編碼核酸序列，這能夠通過基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法用全長cDNA序列作為模板進(jìn)行。在制備了所期望的核酸序列之后，該序列被插入表達(dá)載體(包括，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)pCAL_n表達(dá)質(zhì)粒)中,然后將其轉(zhuǎn)入微生物；然后，使用選擇標(biāo)記(包括，例如，抗生素抗性選擇標(biāo)記或突光選擇標(biāo)記)，進(jìn)行對(duì)包含含有所期望序列的質(zhì)粒的克隆的選擇；然后大量制備包含含有所期望序列的質(zhì)粒的克隆；并從所期望的克隆純化肽(參加，例如，Gorlatov等人所述的方法，Biochemistry (2002)41,4107-4116 ;美國專利4，980，456)。作為另外一種選擇，本發(fā)明的肽能夠通過合成方法或半合成方法(例如，重組制備和合成方法的組合)制備。合成制備能夠通過例如應(yīng)用根據(jù)Carpino L. A.和Han. G Y, J. (Amer. Chem.Soc. 1981 ；37 ；3404-3409)的芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)策略或叔-丁氧羰基(t-Boc)-保護(hù)基團(tuán)策略進(jìn)行。肽使用多重肽合成儀合成例如通過根據(jù)Merrifield R. B. (J. Amer. Chem.Soc. 1963 ;85，2149-2154)的固相肽合成方法。然后對(duì)粗制肽進(jìn)行純化。用于本發(fā)明的蛋白的合成制備的示例性方法描述于下文中。IOOmgTentagel-S-RAM (Rapp-Polymere)以0. 24mmol/g的載量被轉(zhuǎn)入可商購獲得的肽合成設(shè)備 (PSMM(Shimadzu))中，其中肽序列根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法被逐步構(gòu)建。FMOC-氨基酸衍生物通過加入5倍克分子數(shù)相等的過量二異丙基碳二亞胺(DIC)、二異丙基乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)，然后轉(zhuǎn)入反應(yīng)容器，與樹脂載體混合30分鐘而被預(yù)激活。洗滌步驟通過例如添加DMF并徹底混合I分鐘進(jìn)行。裂解步驟通過例如在DMF中添加哌啶并徹底混合4分鐘進(jìn)行。單個(gè)反應(yīng)的移除和洗滌溶液通過迫使溶液通過反應(yīng)容器的底部玻璃料實(shí)現(xiàn)。使用了氨基酸衍生物 FM0C-Ala、FM0C-Arg (Pbf),FMOC-Asp,FMOC-Gly,FMOC-His (Trt)、FMOC-Ile, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)和 FMOC-Tyr (tBu)(Orpegen)。當(dāng)合成完成時(shí)，干燥肽樹脂。隨后通過在室溫用三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積比95 : 2 : 2 : I)處理2小時(shí)來裂解肽酰胺。通過過濾、濃縮所述溶液和通過加入冰冷的乙醚沉淀，獲得固體形式的粗產(chǎn)物。在0. 1% TFA中以5-60%梯度乙腈在40分鐘內(nèi)以12ml/min的流量通過RP-HPLC純化肽，并通過UV檢測器方法在215nm評(píng)估洗脫液。通過分析型RP-HPLC和質(zhì)譜測定了單種級(jí)份的純度。為了更好的理解本發(fā)明，下文定義了幾個(gè)術(shù)語。如本文所用，術(shù)語“酸可溶的”是指物質(zhì)在具有約2至約7的pH的含水介質(zhì)中以10克每升(g/L)的濃度具有至少約80%的溶解度。如本文所用，術(shù)語“大豆分離蛋白”或“分離大豆蛋白”是指按無水計(jì)具有至少約90%的大ii蛋白的蛋白含量的大ii材料。如本文所用，術(shù)語“對(duì)象”是指需要對(duì)病理狀態(tài)進(jìn)行治療的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類)、鳥、魚、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物，所述病理狀態(tài)包括但不限于與肌肉相關(guān)的疾病、非受控的細(xì)胞生長、自身免疫疾病和癌癥。如本文所用，術(shù)語“工藝流”是指來源于精煉完整的豆類或油料種子的方法的次級(jí)或附帶的產(chǎn)物，包括含水的流、溶劑流、或從干燥的(例如噴霧干燥的)復(fù)原的流，其包括例如含水的大豆提取物流、含水的豆?jié){提取物流、含水的大豆乳清流、含水的大豆糖漿流、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流、含水的大豆透過物流和含水的豆腐乳清流，并且附加地包括例如液體和干粉形式的大豆乳清蛋白，其能夠根據(jù)本文所公開的方法被回收作為中間產(chǎn)物。如本文所用，術(shù)語“其它蛋白”被定義為包括但不限于露那辛、凝集素、脫水蛋白、脂氧合酶、以及它們的組合。如本文所用，術(shù)語“大豆乳清蛋白”或“大豆乳清”被定義為包括在大豆貯藏蛋白通常不溶解的PH可溶的蛋白，包括但不限于BBI、KTI、露那辛、脂氧合酶、脫水蛋白、凝集素、肽、以及它們的組合。大豆乳清蛋白還可以包括貯藏蛋白。如本文所用，術(shù)語“大豆低聚糖”被定義為包括但不限于糖。糖被定義為包括但不限于蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖、單糖、以及它們的組合。當(dāng)介紹本發(fā)明或其優(yōu)選實(shí)施方案的要素時(shí)，冠詞“一個(gè)”和“所述”旨在表示有一 個(gè)或多個(gè)要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外還可以有其它要素。在不脫離本發(fā)明范圍的條件下，可對(duì)以上化合物、產(chǎn)品和方法進(jìn)行各種更改，這意味著可將上文描述和下文實(shí)施例中包含的所有內(nèi)容理解為例證性的而非限定性的。
實(shí)施例實(shí)施例I :從大豆乳清蛋白中回收BBI蛋白具有大約3. 7重量％的總固體含量和22. 5重量％ (基于干重)的總蛋白含量的含水的大豆乳清(1451)被引入包含BTS-25或MMM 0. 45微米微量過濾膜的0PTISEP 7000過濾模塊中。含水的大豆乳清穿越膜的通過形成了包含含水的大豆乳清的透過物(1321，具有3. 2重量％的固體含量)和包含大于99%的大豆乳清初始細(xì)菌含量和大于90%的大豆乳清硅消泡劑含量的保留物。來自微量過濾模塊的透過物(1321)被引入包含具有約IOOkDa的孔徑的再生纖維素(RC)超濾膜的0PTISEP 7000過濾模塊中。透過物穿越超濾膜的通過形成了包含糖類、礦物與維生素的第二透過物，和具有大約25. 4重量％的固體含量與大約83重量％ (基于干重)的總大豆蛋白含量的第二保留物(大約21)。第二保留物(516ml)以小批量被引入包含Poros 20HS陽離子交換樹脂的離子交換柱中(68. 3ml柱床體積)，所述樹脂是以pH 3的20mM檸檬酸鈉預(yù)平衡過的。必要時(shí)，通過用20mM pH 3檸檬酸鈉進(jìn)行5x稀釋并添加HC1，將與離子交換樹脂接觸的保留物(S卩，引入離子交換柱的進(jìn)料流)的PH維持在約4. 15。每一批保留物以大約76cm/hr的線性流量通過所述柱，產(chǎn)生BBI蛋白流(大約73g)。通過用20mM pH 3檸檬酸鈉中的400mM氯化鈉洗脫，從所述離子交換柱回收了包含BBI蛋白的第二蛋白級(jí)份(大約9g)，并且通過用20mM pH 3檸檬酸鈉中的IM氯化鈉洗脫，從所述離子交換柱回收了包含其它蛋白的第三蛋白級(jí)份(大約27g)。包含BBI的級(jí)份產(chǎn)生了令人吃驚地且出乎意料地純的BBI組合物。預(yù)期這一級(jí)份將包含附加的蛋白(包括例如KTI和具有與BBI的pi相等或更低的pi的其它大豆乳清蛋白)。在大約23°C的溫度用(NH4)2SO4經(jīng)過大約30分鐘將BBI蛋白流(大約6. 451)調(diào)至40%飽和度，以形成上清液和沉淀的BBI蛋白級(jí)份，通過離心將它們分離。使沉淀的BBI蛋白級(jí)份在大約23°C的溫度與45%飽和的(NH4)2SO4洗滌介質(zhì)接觸兩次，每次大約5分鐘。沉淀的BBI蛋白級(jí)份被溶解于最小體積的去離子水中，并轉(zhuǎn)入Pierce 2K分子量阻隔Slide-a-lyzer滲析盒中，并用去離子水徹底地滲析。從所述滲析盒回收了 BBI蛋白級(jí)份，并離心移除了少量沉淀的材料?？扇艿腂BI蛋白級(jí)份被調(diào)至4°C的溫度，并加入足量的10%的TritonX114溶液(溫度為4°C )以得到I %的Triton X114終濃度。這個(gè)混合物在4°C溫度下攪拌大約60小時(shí)。加熱混合物至大約40°C 30分鐘，以達(dá)到Triton X114的池點(diǎn)沉淀(相分離)。離心所述混合物，并收集上層的BBI蛋白級(jí)份。在4°C的溫度使富集了內(nèi)毒素的下層Triton X114相與去離子水接觸30分鐘。加熱混合物至大約40°C 30分鐘，以達(dá)到TritonX114的濁點(diǎn)沉淀(相分離)。離心所述混合物，收集上層殘余的BBI蛋白級(jí)份相并與之前的BBI蛋白級(jí)份材料合井。令人吃驚地且出乎意料地，就內(nèi)毒素的移除而言，TritonX114溶
液表現(xiàn)得比其它溶液好得多?？偟腂BI 蛋白級(jí)份通過 Pall Life Sciences 0. 2 微米 HT Tuffryn 膜 Acrodisc針式過濾器進(jìn)入こ醇清洗過的玻璃小瓶中。將小瓶在-80 °C冷凍,并在Labconco Freezone4. 5冷凍干燥系統(tǒng)上冷凍干燥。回收了大約2. 9g的BBI (>95%純度，如通過SDS-PAGE測定的)。表I示出了在根據(jù)實(shí)施例I中所述的方法的每ー純化步驟獲得的結(jié)果，最終得到了高純度的產(chǎn)品。表I
比活性
體積[蛋白]總蛋白蛋白 Ci活性 (Ci單位/克總Ci法性純度
卡"_(L) _(mg/ml) (gm) 一回收。/。(單位/L)蛋白)_單位回收。/。倍數(shù)
大豆乳清 _37.41_8.3 —310.503 __952 _I 14.7 _35615 __
微量過濾 _34.056 6.7 —228.1752 73.5 _801 _I 19.6 _27290 76.6 _ 1.0 _
超濾 _0.516 210.8 _ 108.7728 35.0 _43509 —206_2245 I 63.0 _ 1.8 _
CE 層析—6.45 _ 1.52 _9.804 _3.2 _3069 —2019 _19794 .55.6 _ 17.6
硫酸銨 pptn 0.2 _16.2 _3.24 —1.0 _ 35932 —2218 _7186 _20.2 _ 19.3
內(nèi)毒素移除 0.22 _ 13.2 _2.904 _0.9 _3 1020 —2350 _6824 _ 19.2—20.5實(shí)施例2 :從大豆乳清蛋白中回收BBI蛋白具有86. 2重量％ (基于干重，如通過氮燃燒檢測法，標(biāo)準(zhǔn)的凱氏(Kjeldahl)方法所測定的)的總蛋白含量的噴霧干燥的大豆乳清蛋白(44gm)被重懸于去離子水中至終濃度為10% (w/v),并于室溫?cái)嚢?小時(shí)。在Beckman JA-10轉(zhuǎn)子中以4000XG離心懸浮液10分鐘以移除不溶物。用4倍體積的10mM，pH 3.0檸檬酸鈉緩沖液稀釋上清液，并用濃鹽酸進(jìn)ー步調(diào)節(jié)至3. 0的最終pH。在Jouan C60轉(zhuǎn)子中以4000RPM室溫離心所述調(diào)節(jié)了 pH的上清液30分鐘，倒出上清液并用作柱的載樣。用于柱展開的溶液如下溶液A :去離子水；溶液B :梓檬酸鈉，500mM，pH 2.1。21. 6 X 5cm 柱的 SP Sepharose Fast Flow 樹月旨(424ml)在 Axichrom 50/300 柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)中以3倍柱體積的98 %溶液A、2 %溶液B進(jìn)行平衡。上一段中描述的最終的大豆乳清蛋白溶液(2. 29升,采用改進(jìn)的Lowry方法，Sigma-Aldrich TotalProtein Kit, Micro-Lowry, Onishi 和 Barr 改進(jìn)，估算為 14. 2mg/ml 蛋白)以 50ml/min 的流量被施加至柱上。用98%溶液A、2%溶液B (20倍柱體積)洗滌所述柱，然后以2-15%的溶液B線性梯度用5倍柱體積洗脫，然后是無梯度的15%溶液B洗脫附加的20倍柱體積。然后，以無梯度的20%溶液B進(jìn)行附加的20倍柱體積的洗脫，之后是100%溶液B、5倍柱體積。在整個(gè)柱洗脫階段收集代表性的級(jí)份。從297ml至2120ml收集級(jí)份I (1740ml)。整個(gè)的15%無梯度洗脫步驟被收集為級(jí)份2 (8500ml)。整個(gè)的20%溶液B無梯度步驟被收集為級(jí)份3 (8500ml)。級(jí)份4 (2120ml)包括100%溶液B洗脫液。在級(jí)份2中，根據(jù)10-20%Criterion Tris-HCl 凝膠(Bio-Rad Labs, Hercules, CA)上的 SDS-PAGE 分析鑒定了純化的 BBI。
可溶的BBI蛋白級(jí)份被調(diào)至4°C的溫度，并加入足量的10%的TritonX114溶液(溫度為4°C )以得到I %的Triton X114終濃度。這個(gè)混合物在4°C溫度下攪拌大約60小時(shí)。加熱混合物至大約40°C 30分鐘，以達(dá)到Triton X114的池點(diǎn)沉淀(相分離)。離心所述混合物，并收集上層的BBI蛋白級(jí)份。在4°C的溫度使富集了內(nèi)毒素的下層Triton X114相與去離子水接觸30分鐘。加熱混合物至大約40°C 30分鐘，以達(dá)到Triton X114的池點(diǎn)沉淀(相分離)。離心所述混合物，收集上層殘余的BBI蛋白級(jí)份相并與之前的BBI蛋白級(jí)份材料合并。然后,使用Virtis Freezemobile 25XL將所述材料部分地冷凍干燥，以使樣品的體積減少至大約150ml?？偟腂BI蛋白級(jí)份通過PalI Life Sciences 0.2微米HT Tuffryn膜Acrodisc針式過濾器進(jìn)入こ醇清洗過的玻璃小瓶中。將小瓶在-80°C冷凍,并在Virtis Freezemobile25XL冷凍干燥系統(tǒng)上冷凍干燥?；厥樟舜蠹s3. 6g的BBI (>95%純度，如通過SDS-PAGE測定的)。表2示出了在根據(jù)實(shí)施例2中所述的方法的每ー純化步驟獲得的結(jié)果，最終得到了高純度的產(chǎn)品。表2
比活性
體積[蛋白]總蛋白蛋白Ci活性 (Ci単位/克總Ci活性純度
步驟_(L) _(nm/ml) (grn) _回收。/。(單位/じ)—蛋白'')_單位回收％倍數(shù)
大豆乳清蛋白 2.29 J4.2—32.5 _ 100 — 4019 _283 _9203 100 _I_
CE 層析 _8.5 _0.565 _4.8 —14.8 _919_1627 _7811 85 _5.7 _
滲濾 _0.7 _6.15 —4.3 —13.2 _ 10320 —1678 _7224 78_5.9 _
內(nèi)毒素移除—I O、4.49—4.7 —14.5 _7575 _1687 _7953 86_6.0 _實(shí)施例3 BBI蛋白樣品與本發(fā)明的BBI蛋白的比較作為已知的BBI蛋白結(jié)構(gòu)和本發(fā)明的BBI蛋白之間的比較，表3列出了每種之中存在的氨基酸殘基的摩爾百分比(mol*% )。由UC Davis的Molecular Structure Facility使用L-8800 Hitachi分析儀分析了本發(fā)明的BBI產(chǎn)品。該分析儀使用離子交換層析來分離氨基酸，之后是“柱后”卻三酮反應(yīng)檢測體系。標(biāo)準(zhǔn)的水解程序使用6N HCl在110°C進(jìn)行24小吋。在標(biāo)準(zhǔn)的酸水解之前，通過用過甲酸氧化測定了半胱氨酸(以及胱氨酸)和甲硫氨酸，這產(chǎn)生了酸穩(wěn)定的形式磺基丙氨酸和甲硫氨酸砜。色氨酸使用MES水解步驟測定。表3 :存在干P1知的BBI蛋白和BBI蛋白亞型(E113609-146)中的氡某酸殘某的臉。
IBBTS (El 13609-146) Ml
丨氨基酸丨理論的BBI摩爾％!龜 I
|AsxI 15.5I 15.31-0.2 IThr12.8!3.3丨 0.5
I SerI 12.7| 12.0|-0.7
IGlx19.8丨 9.01-0.8 I
IPro18.5!8.41-0.1 I
IGly10.0I 1.2I 1.2JAla15.615.710.1
I ValI 1,4I 1.510.1 I
!Hei2.8丨 2.810.0 I
ILeu12.813.710.9 j
ITyr12.8丨 2.810.0 I
I Phe12.8!2.910.1 I
IHis11.4I 1,510.1 [
I Lys17.0丨 6.4I -0.6 I
IArg12.813.3丨 0.5 I
I Cys 119.7I 18.4|-1.3 ||Met 11.4I 1.610.2 I I Trp 10.0 10.0 丨0.0實(shí)施例4 :用于處理病理狀杰的BBI。如之前所討論的，本發(fā)明的BBI蛋白被用于治療患者中的某些病理狀態(tài)。BBI蛋白是單ー的BBI蛋白或本文所述的BBI蛋白的任何混合物。本發(fā)明的BBI蛋白能夠作為例如包含本發(fā)明的BBI蛋白和藥用載體的組合物或者作為包含本發(fā)明的BBI蛋白的食物被施用。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的BBI蛋白阻止了功能性骨骼肌質(zhì)量和力量在停用期間的損失。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的BBI蛋白向飲食中的添加顯著地減輕了后肢懸吊之后的骨骼肌萎縮。此外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的BBI蛋白的施用在mdx小鼠中導(dǎo)致了肌營養(yǎng)不良肌肉的功能性改善，因此展示了包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物用于治療退行性肌肉紊亂(包括例如肌肉萎縮癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、脊髄性肌肉萎縮癥和脊髄損傷)的進(jìn)ー步用途。后肢懸吊實(shí)驗(yàn)和方法如上文所述并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的(參見例如，Matuszczak 等人，Aviat Space Environ Med 75 :581-588,2004 ;Arbogast 等人，Journal of Applied Physiology March 2007,第 102 卷 3 :956-964 ;美國早期公開20080300179)。神經(jīng)變性的肌肉紊亂實(shí)驗(yàn)和方法此前已被描述，并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員已知的(參見例如Morris等人，J Appl Physiol. 2010年11月；109(5) :1492-9 ;美國早期公開 20080300179)。在小鼠中，包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物抑制與停用相關(guān)的肌肉萎縮的進(jìn)程的能力，通過對(duì)已知在肌肉去負(fù)荷(例如后肢懸吊)期間變化的多種生理學(xué)參數(shù)的測量而被證明。將在BBI治療的(即，服用包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物)懸吊和未懸吊的動(dòng)物中獲得的結(jié)果，與用aBBI( S卩，服用包含經(jīng)過高溫高壓以移除抑制性活性的本發(fā)明的BBI蛋白的組合物)或標(biāo)準(zhǔn)食物飼喂的那些進(jìn)行了比較。對(duì)于每ー實(shí)驗(yàn)，飼喂了所述三種類型的飼料之一的小鼠接受了后肢懸吊或被用作未懸吊的對(duì)照物。在初始實(shí)驗(yàn)中，三月齡的小鼠被用于展示補(bǔ)充了 BBI的食物減少與后肢懸吊相關(guān)的肌肉萎縮的量的能力。對(duì)于這ー實(shí)驗(yàn)，懸吊了 14天的小鼠被給予了補(bǔ)充了 BBI或aBBI的食物。在懸吊之后，解剖了肌肉并測量了力量。在飼喂BBI的動(dòng)物中，強(qiáng)直力量比在飼喂aBBI的動(dòng)物中更高。以張カ每克肌肉重量測量的平均特異性力量，在飼喂BBI的動(dòng)物中比在飼喂aBBI的動(dòng)物中更高。飼喂BBI的動(dòng)物的肌肉重量比飼喂aBBI的動(dòng)物的肌肉重量更高。飼喂aBBI的動(dòng)物比飼喂BBI的動(dòng)物萎縮百分比更高。隨著在飼喂BBI的動(dòng)物中觀察到了肌肉重量的提高，使用六月齡的小鼠進(jìn)行了更大尺度的研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)期之前和之后，測量了懸吊和未懸吊的小鼠的體重。經(jīng)過14天后，每ー組中未懸吊的動(dòng)物表現(xiàn)出體重的少量増加。懸吊的飼喂BBI的和飼喂aBBI的動(dòng)物經(jīng)過14天的后肢懸吊之后體重降低。懸吊的飼喂對(duì)照物的動(dòng)物經(jīng)過14天的后肢懸吊之后體重降低。身體質(zhì)量的降低此前已被許多研究報(bào)道(參見Thomason，D. B.和Booth，F(xiàn). ff. JAppl Physiol 1990 68 :1_12中的參考文獻(xiàn))并且已被提出既是因?yàn)榭偸澄飻z入的減少也是因?yàn)槊靠耸澄飻z入的體重增加的降低(Morey E R. Bioscience 29 :168-172，1979)。為了確定本發(fā)明的BBI蛋白是否能夠減輕停用性萎縮過程中的肌肉損失，飼喂了對(duì)照食物或補(bǔ)充了 BBI的食物的動(dòng)物被懸吊了 3天、7天、或14天。已發(fā)現(xiàn)飲食補(bǔ)充BBI在每ー時(shí)間點(diǎn)均減輕了肌肉質(zhì)量的損失。在7天的后肢懸吊之后，飼喂BBI的動(dòng)物的肌肉質(zhì)量比飼喂aBBI的和飼喂對(duì)照物的動(dòng)物更高。飼喂BBI的動(dòng)物的平均比目魚肌重量比飼喂aBBI的和飼喂對(duì)照物的動(dòng)物更高。與飼喂aBBI的和飼喂對(duì)照物的動(dòng)物相比，飼喂BBI的動(dòng)物的萎縮百分比是有限的和降低的。飼喂對(duì)照物的未懸吊的、飼喂BBI的未懸吊的和飼喂aBBI的未懸吊的動(dòng)物肌肉重量沒有差異。對(duì)全部的組而言，每塊肌肉的平均纖維數(shù)量是相似的，表明后肢懸吊沒有導(dǎo)致單根肌纖維的消失。因此，以橫截面測量了單根肌纖維的纖維面積。確定纖維大小是否有任何改變的一個(gè)簡單方法是，定量強(qiáng)力區(qū)域中的纖維數(shù)量(例如40x物鏡)。提高的纖維尺寸減少了視野區(qū)域內(nèi)的纖維數(shù)量(即，肌纖維越小，纖維數(shù)量越高)。采用這一方法，與飼喂aBBI的動(dòng)物相比，飼喂BBI的動(dòng)物在后肢研究中的平均纖維數(shù)量是更低的，這展示了在飼喂BBI的動(dòng)物中萎縮的減輕。對(duì)層粘連蛋白染色的肌肉橫截面進(jìn)行了分析以直接測量纖維面積。與飼喂aBBI的動(dòng)物相比，在飼喂BBI的動(dòng)物中平均纖維面積是提高的。因此，本發(fā)明的BBI蛋白的施用，至少通過減緩纖維尺寸的降低從而維持肌肉的 總體質(zhì)量，減輕了與后肢懸吊相關(guān)的肌肉萎縮。為了確定肌肉是否依然是功能性的，在全部的飼喂組中，對(duì)非懸吊的和懸吊的動(dòng)物的比目魚肌均進(jìn)行了收縮測量。由飼喂BBI的懸吊的動(dòng)物產(chǎn)生的總的強(qiáng)直力量高于類似的飼喂對(duì)照物和飼喂aBBI的動(dòng)物。這ー結(jié)果展示了在肌肉萎縮模型中，本發(fā)明的BBI蛋白能夠維持功能性的肌肉質(zhì)量和允許肌肉產(chǎn)生總體上更強(qiáng)的力量。在小鼠中觀察到的肌肉質(zhì)量的變化是與BBI的攝入相關(guān)的。更具體地，以14天的實(shí)驗(yàn)期中消耗的食物的量對(duì)單個(gè)動(dòng)物的肌肉重量進(jìn)行了作圖。結(jié)果指示了每天消耗的BBI食物的量與肌肉重量之間的正相關(guān)性。與aBBI攝入相比，BBI對(duì)于肌肉重量的效應(yīng)作為每天的食物攝入的函數(shù)是提高的。對(duì)飼喂BBI的動(dòng)物再評(píng)估至消耗了較高量的BBI的子集，在對(duì)比目魚肌的評(píng)估中表現(xiàn)出肌肉萎縮的量的進(jìn)ー步減少。在飼喂aBBI的小鼠中的類似分析指示沒有比目魚肌的此類變化。這指示了 BBI的消耗的増加降低了肌肉萎縮的程度(即，劑量反應(yīng))。這些結(jié)果指示，所消耗的食物的量，或者更具體地講BBI的量，在與后肢懸吊相關(guān)的肌肉萎縮的量的減少中是重要的。在附加的實(shí)驗(yàn)中，插入了滲透泵以將本發(fā)明的BBI蛋白或本發(fā)明的aBBI蛋白直接 遞送至六月齡小鼠。每ー動(dòng)物在背部的前方部分具有通過手術(shù)直接插入至皮膚下的包含BBI (10% w/v)或 aBBI (10% w/v)的 Alzet 滲透泵(Alza, Palo Alto, Calif.)。所述泵經(jīng)過兩周的時(shí)間以例如0. 5. mu. 1/h的速率恒定地釋放所述溶液。BBI治療的動(dòng)物的肌肉重量比aBBI治療的動(dòng)物的肌肉重量更高。肌肉質(zhì)量通過BBI的維持導(dǎo)致了在14天的懸吊之后肌肉重量的増加。在mdx小鼠(杜氏肌營養(yǎng)不良癥的小鼠模型)中也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，用包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物對(duì)雄性mdx小鼠的治療，具體而言對(duì)其的食物補(bǔ)充，在四周齡時(shí)開始進(jìn)行，并持續(xù)了 12周。每周監(jiān)測并記錄動(dòng)物的重量。在對(duì)照組mdx小鼠和提供了補(bǔ)充了 1.0% BBI的食物的那些之間，沒有觀察到體重増加方面的差異。此外，作為進(jìn)ー步的對(duì)照，向野生型C57BL/6小鼠提供了補(bǔ)充了 BBI的食物，以確定BBI是否導(dǎo)致正常的、非營養(yǎng)不良的肌肉大小或功能方面的任何變化。mdx小鼠的隔膜在4月齡時(shí)表現(xiàn)出顯著的纖維化，這可以使用常規(guī)的蘇木精-伊紅(H&E)染色觀察到。使用將肌肉組織染為紅色而將纖維化的和結(jié)締組織染為深藍(lán)色的三色方法，能夠?qū)崿F(xiàn)來自肌肉細(xì)胞的纖維化組織的更顯著的區(qū)分。與對(duì)照組mdx小鼠相比，飼喂BBI被發(fā)現(xiàn)顯著地改善了用H&E和三色法染色的mdx小鼠隔膜的外觀。此外，mdx小鼠的肌纖維從大約4周齡起開始經(jīng)歷明顯的退化/再生循環(huán)。肌纖維的再生需要出現(xiàn)在再生中的纖維中央的衛(wèi)星細(xì)胞的激活和融合。因此,再生中肌纖維的量度是中央核肌纖維(CNF)的存在，提高的CNF比例代表著提高的再生。對(duì)肌肉截面進(jìn)行染色，層粘連蛋白顯示了肌纖維的輪廓，用核染料4，6_聯(lián)脒-2-苯基吲哚對(duì)核進(jìn)行了染色。對(duì)每ー肌肉，以占總纖維數(shù)量的比例測定了 CNF的數(shù)量，對(duì)每ー測量使用了總計(jì)2-4塊肌肉。在BBI治療之后，觀察到了脛前肌、EDL肌肉和膈膜肌肉中CNF比例的顯著降低。埃文氏藍(lán)色染料(Evan' s blue dye)被用于測定未治療的和BBI治療的mdx小時(shí)的膜完整性。在處死前二十四小時(shí)，向動(dòng)物腹膜內(nèi)注射了埃文氏藍(lán)色染料。肌肉被切割、固定和在熒光顯微鏡下觀察，以確定膜損傷的程度。在至少ー只未治療的mdx動(dòng)物的四頭肌肌肉中觀察到了申通區(qū)域的増加。與非營養(yǎng)不良的動(dòng)物相比，mdx小鼠的EDL肌肉展示了質(zhì)量和橫截面積的増加。然而，并非所有質(zhì)量的増加均與每ー橫截面積的力量的提高(特異性力量)相關(guān)聯(lián)；相反，mdx肌肉的特異性力量可存在顯著的降低。BBI治療顯著地提高了肌肉質(zhì)量、絕對(duì)力量和橫截面積，同時(shí)維持了特異性力量。這些結(jié)果顯示通過BBI治療獲得了力量的改善。盡管特異性 力量未改變，提高的肌肉質(zhì)量和絕對(duì)力量向動(dòng)物提供了更強(qiáng)的完成日常任務(wù)的能力。提高的肌肉質(zhì)量并非僅僅由于體重的總體增加，因?yàn)榇嬖诩∪庵亓繉?duì)體重的比率的顯著提高。因此，如上述每ー個(gè)實(shí)施例所展示的，在杜氏肌營養(yǎng)不良癥的該小鼠模型的小鼠攝取了十二周的BBI之后，在骨骼肌的多種形態(tài)學(xué)和功能性測量中存在顯著的改善。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了使用包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物的方法。本文還展示了，在退行性骨骼肌紊亂的小鼠模型中，服用包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物，由于力量的提高和肌肉質(zhì)量的增加而改善了骨骼月幾的功能。此外，本發(fā)明還提供了用于減輕退行性骨骼肌疾病或紊亂的癥狀和/或減緩其進(jìn)程的組合物和方法。如本文所展示的，在退行性骨骼肌紊亂杜氏肌營養(yǎng)不良癥的小鼠模型中，用包含本發(fā)明的BBI蛋白的組合物進(jìn)行的治療改善了骨骼肌功能。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地了解，本文所述的方法和組合物代表示例性的實(shí)施方案，并且不g在限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將顯而易見的是，可以對(duì)本文所公開的本公開進(jìn)行不同的替換和修改，而不會(huì)背離本發(fā)明的范圍和精神。本說明書中提及的全部專利和出版物指示本公開所屬的領(lǐng)域的那些技術(shù)人員的水平。全部專利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同每ー單獨(dú)的公布被特定和個(gè)別地以引用方式并入。本文適當(dāng)?shù)乩C性地描述的本公開可以在未具體公開于本文中的任何元件或限制的不存在下實(shí)施。因此例如在本文的每ー實(shí)例中，術(shù)語“包含/包括”、“基本上由...組成”和“由...組成”中的任何一個(gè)可以被其它兩個(gè)術(shù)語之ー替代。本文所用的術(shù)語和表述被用于描述而并非進(jìn)行限制，使用此類術(shù)語和表述并無意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但公認(rèn)的是在受權(quán)利要求書保護(hù)的本公開的范圍內(nèi)可以使用各種修改形式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征對(duì)本公開進(jìn)行了具體描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可借助本文所公開的概念的修改形式和變型形式，并且應(yīng)當(dāng)理解此類修改形式和變型形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.純化具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括 (a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受層析分離處理；以及 (b)任選地，使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受一種或多種分離技術(shù)處理， 其中獲得具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述層析分離選自離子交換層析、吸附層析、尺寸排阻層析、反相層析和親和層析。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述層析分離是包括離子交換柱的離子交換層析。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述離子交換柱包含陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、或它們的組合。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述離子交換柱保留所述BBI產(chǎn)品。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述離子交換柱不保留所述BBI產(chǎn)品。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述一種或多種分離技術(shù)選自膜分離、電泳、滲析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、重力分離、以及它們的任何組合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種分離技術(shù)是膜分離。
9.權(quán)利要求8的方法，其中使所述大豆工藝流以至少約I升流體/小時(shí)-平方米的體積流量通過膜。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述體積流量是約I至約400升流體/小時(shí)-平方米。
11.權(quán)利要求8的方法，其中使所述大豆工藝流在約0°C至約100°C的溫度下通過膜。
12.權(quán)利要求8的方法，其中使所述大豆工藝流在約25°C至約75°C的溫度下通過膜。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述膜包括微量過濾膜、超濾膜、或它們的組合。
14.權(quán)利要求3的方法，其中所述方法還包括控制pH以保持其低于BBI蛋白的等電點(diǎn)，使得通過所述離子交換樹脂保留BBI蛋白。
15.權(quán)利要求3的方法，其中所述方法還包括控制pH以保持其高于BBI蛋白的等電點(diǎn)，使得通過所述離子交換樹脂不保留BBI蛋白。
16.權(quán)利要求I的方法，其中所述一種或多種分離技術(shù)在所述層析分離之前被執(zhí)行。
17.權(quán)利要求I的方法，其中所述一種或多種分離技術(shù)在所述層析分離之后被執(zhí)行。
18.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的BBI產(chǎn)品具有至少約95重量％的總BBI蛋白濃度。
19.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的BBI產(chǎn)品包含至少一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、以及它們的任何組合具有至少90%的同一性。
20.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的BBI產(chǎn)品包含至少一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、以及它們的任何組合具有至少95%的同一性。
21.純化具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括 (a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受一種或多種分離技術(shù)處理；以及 (b)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受層析分離處理，其中獲得具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品。
22.純化具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括 (a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成第一透過物和第一保留物，所述第一透過物包含所述大豆蛋白，并且所述第一保留物包含所述雜質(zhì)； (b)使所述第一透過物經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成第二透過物和第二保留物，所述第二保留物包含大部分蛋白，并且所述第二透過物包含雜質(zhì)；以及 (c)使所述第二保留物與載體流混合用于通過至少一種層析分離，以使BBI蛋白流與所述工藝流中的其它蛋白分離； (d)使所述BBI蛋白流與液體沉淀介質(zhì)混合并使它們經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成沉淀的BBI蛋白級(jí)份； (e)使所述沉淀的BBI蛋白級(jí)份與液體洗滌介質(zhì)混合以形成溶解的BBI蛋白級(jí)份； (f)使所述溶解的蛋白級(jí)份經(jīng)受至少一種分離技術(shù)處理以形成純化的溶解的BBI蛋白級(jí)份；以及 (g)使所述純化的溶解的蛋白級(jí)份經(jīng)受至少一種分離操作處理以形成所述純化的BBI女口 其中獲得具有至少約90重量％的總BBI蛋白濃度的BBI產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明描述了純化具有指定的總BBI蛋白濃度和其它BBI特性(包括例如胰凝乳蛋白酶抑制劑活性和內(nèi)毒素含量)的BBI產(chǎn)品的新方法。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102770439SQ201080064836
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者B.塔爾克, C.S.沙斯蒂恩, D.馬什, J.吳, K.克勒, M.梅克爾 申請(qǐng)人:索萊有限責(zé)任公司