專利名稱：用于純化多肽多聚體的多肽的修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽多聚體的制備方法和純化方法、以及與蛋白A的結(jié)合力被改變的多肽多聚體等。
背景技術(shù)：
作為具有人恒定區(qū)的IgG型雙特異性抗體(一臂具有與抗原A的結(jié)合特異性、另一臂具有與抗原B的結(jié)合特異性的具有人恒定區(qū)的IgG型抗體)的制作方法，迄今為止報道了幾種方法。通常，IgG型雙特異性抗體由兩種H鏈(即抗抗原A的H鏈和抗抗原B的H鏈)和兩種L鏈(即抗抗原A的L鏈和抗抗原B的L鏈)構(gòu)成。為了在這樣的IgG型雙特異性抗體表達時使兩種H鏈和兩種L鏈表達，作為H2L2的組合，認(rèn)為有10種組合。其中一種為具有目標(biāo)特異性(一臂具有與抗原A的結(jié)合特異性，另一臂具有與抗原B的結(jié)合特異性)的組合。因此，為了獲得目標(biāo)雙特異性抗體，必須從10種抗體中純化出一種目標(biāo)抗 體，效率極低而且困難。作為解決該問題的方法，報道了使用抗抗原A的L鏈和抗抗原B的L鏈形成相同的氨基酸序列的共通L鏈的方法(專利文獻1、2)。為了在具有這樣的共通L鏈的IgG型雙特異性抗體表達時使兩種H鏈和一種共通L鏈表達，作為H2L2的組合，認(rèn)為有三種組合。其中一種為目標(biāo)雙特異性抗體。這三種組合為抗抗原A的單特異性抗體(抗抗原A的H鏈的同源抗體(homomeric antibodies))、抗抗原A和抗原B的雙特異性抗體(抗抗原A的H鏈和抗抗原B的H鏈的異源抗體(heteromeric antibody))和抗抗原B的單特異性抗體(抗抗原B的H鏈的同源抗體)。由于它們的比率通常為1:2:1，因此目標(biāo)雙特異性抗體的表達效率為約50%。報道了使兩種H鏈異源締合化以進一步提高該效率的方法(專利文獻3)。由此可以將目標(biāo)雙特異性抗體的表達效率提高至約90 95%。另外，作為有效率地除去這兩種同源抗體的雜質(zhì)的方法，報道了下述方法通過向兩種H鏈的可變區(qū)中導(dǎo)入氨基酸取代以賦予等電點之差，從而可以通過離子交換層析純化兩種同源抗體和目標(biāo)雙特異性抗體(異源抗體)的方法(專利文獻4)。通過組合這些方法，可以有效率地制備IgG型具有人恒定區(qū)的抗體的雙特異性抗體(異源抗體)。另一方面，在IgG型抗體的商業(yè)化制備中，必須采用利用蛋白A層析進行的純化步驟，但是在純化步驟中未必使用離子交換層析。因此，為了高純度地制備雙特異性抗體而采用離子交換層析會導(dǎo)致制備成本的增加。另外，在只采用離子交換層析的純化方法中，有可能無法確保作為藥品的純化方法的頑健性，希望通過多個層析步驟除去雜質(zhì)。無論如何，即使在與離子交換層析具有不同的分離模式的層析步驟中，也優(yōu)選可以將雙特異性抗體高純度化，作為其分離模式，希望通過在IgG型抗體的商業(yè)化制備中必須使用的蛋白A層析可以將雙特異性抗體高純度化。作為使用蛋白A來純化雙特異性抗體(異源抗體)的方法，迄今為止報道了 使用由與蛋白A結(jié)合的小鼠IgG2a的H鏈和不與蛋白A結(jié)合的大鼠IgG2b的H鏈構(gòu)成的雙特異性抗體的方法。據(jù)報道，在該方法中只利用蛋白A純化步驟即可將目標(biāo)雙特異性抗體純化至95%的純度(非專利文獻I、專利文獻5)。但是，在該方法中，為了進一步提高雙特異性抗體的純度，采用離子交換層析。即，僅憑利用蛋白A層析進行的純化步驟無法達成高純度的雙特異性抗體的純化。而且，通過上述方法制作的由小鼠IgG2a的H鏈和大鼠IgG2b的H鏈構(gòu)成的雙特異性抗體即卡妥索單抗(Catumaxomab)在人體內(nèi)的半衰期為約2. I天,與通常的人IgGl的半衰期為2 3周相比極短(非專利文獻2)。除了半衰期短以外，還由于使用小鼠和大鼠的恒定區(qū)，因此免疫原性極高(非專利文獻3)。因此，認(rèn)為通過這種方法得到的雙特異性抗體不適合作為藥品。另一方面，從免疫原性的角度考慮，暗示可以使用人IgG3恒定區(qū)作為不與蛋白A結(jié)合的恒定區(qū)的可能性(非專利文獻I)。但是，已知在人IgGl和人IgG3中幾乎不會發(fā)生H鏈間的締合(非專利文獻I)，因此無法通過與由小鼠IgG2a的H鏈和大鼠IgG2b的H鏈構(gòu)成的雙特異性抗體相同的方法使用人IgGl的H鏈和人IgG3的H鏈來制備目標(biāo)雙特異性抗體。而且，有報道稱人IgG3在人體內(nèi)的半衰期通常較人IgGl、人IgG2、人IgG4的短(非 專利文獻4、5)。因此，認(rèn)為使用人IgG3的雙特異性抗體有可能與使用小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的雙特異性抗體一樣在人體內(nèi)的半衰期短。作為在人IgGl和人IgG3中幾乎不會發(fā)生H鏈間的締合的理由，暗示有可能是由于人IgG3的鉸鏈序列(非專利文獻I)，但人IgG3恒定區(qū)的半衰期短的理由尚未充分明確。因此，迄今為止尚無有關(guān)使用人IgG3恒定區(qū)作為不與蛋白A結(jié)合的恒定區(qū)的雙特異性抗體的報道。況且，也沒有關(guān)于只通過蛋白A純化步驟高純度且有效率地純化或制備顯示出與人IgGl —樣長的半衰期且具有人恒定區(qū)的雙特異性抗體的方法的報道?，F(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻
專利文獻 I W098050431 ；
專利文獻 2 W02006109592 ；
專利文獻 3 W02006106905 ；
專利文獻 4 W02007114325 ；
專利文獻 5 W095033844 ；
非專利文獻
非專利文獻 I :The Journal of Immunology, 1995, 155: 219-225 ；
非專利文獻 2 :J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 14006)；
非專利文獻 3:Clin Cancer Res 2007 13: 3899-3905 ；
非專利文獻 4 :Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12) : 1369-72 ；
非專利文獻 5 :J. Clin Invest 1970; 49: 673-80。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
通常，可以通過蛋白A純化步驟以高純度的IgG的形式有效率地制備普通的IgG型抗體。但是，為了制備高純度的雙特異性抗體，必須追加通過離子交換層析進行的純化步驟。追加通過離子交換層析進行的純化步驟會增加制造的復(fù)雜性和制造成本。因此，優(yōu)選只通過蛋白A純化步驟來制備高純度的雙特異性抗體。本發(fā)明的目的在于提供只通過蛋白A純化步驟來高純度且有效率地純化或制備具有人抗體重鏈恒定區(qū)的IgG型抗體的雙特異性抗體的方法。另外，由于Fe區(qū)中的蛋白A結(jié)合位點與Fe區(qū)中的FcRn結(jié)合位點相同，因此預(yù)料難以保持與人FcRn的結(jié)合力不變而調(diào)整與蛋白A的結(jié)合活性。保持與人FcRn的結(jié)合力對于IgG型抗體的特征即在人體內(nèi)的長血漿中滯留性(長半衰期)極為重要。本發(fā)明提供只通過蛋白A純化步驟高純度且有效率地純化或制備維持與人IgGl同等以上的血漿中滯留性的雙特異性抗體的方法。解決課題的方法
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了 通過改變與蛋白A的結(jié)合力，只通過蛋白A純化步驟高純度且有效率地純化或制備可與兩種以上的抗原結(jié)合的多肽多聚體、特別是具有人恒定區(qū)的IgG型多特異性抗體的方法。
而且，通過將上述方法與修飾構(gòu)成在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽與具有抗原結(jié)合活性的第2多肽締合時形成的界面的氨基酸、并調(diào)節(jié)上述多肽間的締合的方法組合，可以高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)多肽多聚體。本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)通過修飾重鏈恒定區(qū)中的EU編號第435位的氨基酸殘基，可以一邊維持與人IgGl同等以上的血漿中滯留性一邊調(diào)整與蛋白A的結(jié)合力。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，可以高純度且有效率地純化或制備與人IgGl具有同等以上的血漿中滯留性的雙特異性抗體。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)，提供以下的[I] [55]。[I]包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的多肽多聚體的制備方法，該方法包括
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差
巳[2] [I]所述的方法，其中，在步驟(b)中，利用蛋白A親和層析來回收表達產(chǎn)物。[3] [I]或[2]所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的溶劑的pH、和從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的溶劑的pH存在差異。[4] [I] [3]中任一項所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方與蛋白A的結(jié)合力增強或降低。[5] [I] [4]中任一項所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增強、使另一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低。[6] [I] [5]中任一項所述的方法，其中，回收的多肽多聚體的純度為95%以上。[7] [I] [6]中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。[8] [7]所述的方法，其中，選自抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少一個氨基酸殘基被修飾。[9] [I] [8]中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
[10] [9]所述的方法，其中，在抗體重鏈可變區(qū)的FR1XDR2和FR3的氨基酸序列
中有至少一個氨基酸殘基被修飾。[11] [I] [10]中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體包含一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達。[12] [11]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[13] [11]或[12]所述的方法，其中，多肽多聚體進一步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達。[14] [13]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中的至少一個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[15] [13]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[16] [I] [15]中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體為多特異性抗體。[17] [16]所述的方法，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。[18] [I] [8]中任一項所述的方法，其中包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體Fe區(qū)的氨基酸序列，不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)的氨基酸序列。[19] [7] [18]中任一項所述的方法，其中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人 IgG0[20]多肽多聚體，該多肽多聚體是通過[I] [19]中任一項所述的方法來制備的。[21]多肽多聚體的純化方法，所述多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，該方法包括
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)通過蛋白A親和層析回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟；其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差
巳[22] [21]所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力增強或降低。[23] [20]或[21]所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增強、使另一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低。

[24] [21] [23]中任一項所述的方法，其中，回收的多肽多聚體的純度為95%以上。[25] [21] [24]中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。[26] [25]所述的方法，其中，選自抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少一個氨基酸殘基被修飾。[27] [21] [26]中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。[28] [27]所述的方法，其中，在抗體重鏈可變區(qū)的FR1、⑶R2和FR3的氨基酸序列中至少有一個氨基酸殘基被修飾。[29] [21] [28]中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體包含一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達。[30] [29]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[31] [29]或[30]所述的方法，其中，多肽多聚體進一步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達。[32] [31]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中的至少一個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[33] [31]所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[34] [21] [33]中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體為多特異性抗體。[35] [34]所述的方法，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。
[36] [25] [35]中任一項所述的方法，其中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人IgG。[37]多肽多聚體，該多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，
其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。[38] [37]所述的多肽多聚體，其中，從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的溶劑的pH、和從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的溶劑的PH不同。[39] [37]或[38]所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，
在該抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中選自EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少一個氨基酸殘基被修飾。[40] [37] [39]中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，
在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸或精氨酸，
在另一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基是與一方的多肽不同的氨基酸殘基。[41] [37] [40]中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，
在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸，
在另一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為精氨酸。[42] [37] [41]中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，
在該重鏈可變區(qū)的FR1、⑶R2和FR3的氨基酸序列中至少有一個氨基酸殘基被修飾。[43] [37] [42]中任一項所述的多肽多聚體，其中，多肽多聚體進一步包含一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽。[44] [43]所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[45] [43]或[44]所述的多肽多聚體，其中，多肽多聚體進一步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽。
[46] [45]所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中的至少一個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[47] [45]所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。[48] [37] [47]中任一項所述的多肽多聚體，該多肽多聚體為多特異性抗體。[49] [48]所述的多肽多聚體，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。[50] [37] [41]中任一項所述的多肽多聚體，其中包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體Fe區(qū)的氨基酸序列，不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe 區(qū)的氨基酸序列。[51] [39] [50]中任一項所述的多肽多聚體,其中,抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人IgG。[52]核酸，該核酸編碼構(gòu)成[20]、[37] [51]中任一項所述的多肽多聚體的多肽。[53]載體，該載體插入有[52]所述的核酸。[54]細(xì)胞，該細(xì)胞包含[52]所述的核酸或[53]所述的載體。[55]藥物組合物，該藥物組合物含有[20]、[37] [51]中任一項所述的多肽多聚體作為有效成分。發(fā)明效果
在本發(fā)明中提供通過改變與蛋白A的結(jié)合力，只通過蛋白A純化步驟高純度且有效率地純化或制備與兩種以上的抗原具有結(jié)合活性的多肽多聚體(多特異性抗體)的方法。通過利用本發(fā)明的方法，不會損及其他目標(biāo)氨基酸修飾的效果，可以高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)多肽多聚體。特別是通過與調(diào)節(jié)兩種蛋白結(jié)構(gòu)域間的締合的方法組合，可以以更高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)多肽多聚體。本發(fā)明的多特異性抗體的純化和制備方法，其特征在于修飾抗體重鏈恒定區(qū)和/或抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基。通過向這些區(qū)中導(dǎo)入本發(fā)明的氨基酸殘基的修飾，與蛋白A的結(jié)合力被改變。而且，還可以取得其他目標(biāo)氨基酸修飾的效果、例如與人IgGl同等以上的血漿中滯留性。利用本發(fā)明的方法，可以高純度且有效率地取得具有這樣的氨基酸修飾效果的多特異性抗體。通常，為了以高純度制備IgG型多特異性抗體，必須進行通過離子交換層析進行的純化步驟。但是，追加該純化步驟會增加制備的復(fù)雜性和制備成本。另一方面，僅依賴于單一的離子交換層析的純化，其作為藥品的純化方法有可能缺少頑健性。因此，開發(fā)只通過蛋白A純化步驟來制備IgG型雙特異性抗體的方法、或者采用蛋白A純化步驟和離子交換層析步驟這兩個步驟的頑健性高的制備方法成為課題。本發(fā)明是解決上述課題的發(fā)明。


圖I是顯示MRA-IgGl和MRA_zl06/zl07k在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中的血漿中滯留性的評價的曲線 圖2是顯示抗體的Fe區(qū)的相同位點與蛋白A和FcRn結(jié)合的方式的 圖3是顯示對人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠給予Q499-zll8/J339-zll9/ L377_k和Q499_zl21/J339-zll9/L377-k后血漿中濃度變化的 圖4是以二價與癌特異性抗原即磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)結(jié)合、以一價與T細(xì)胞抗原即CD3結(jié)合的GC33-IgGl-CD3-scFV分子的模式 圖5是顯示利用蛋白A進行純化的NTAlL/NTAlR/GC33-kO和NTA2L/NTA2R/GC33_kO的尺寸排阻層析分析結(jié)果的圖； 圖6是以一價與磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3結(jié)合的抗GPC3 IgG抗體分子的模式 圖 7 是顯示利用蛋白 A 進行純化的 NTA4L-cont/NTA4R- cont/GC33_kO、NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-kO和NTA4L/NTA4R/ GC33_kO的尺寸排阻層析分析結(jié)果的圖 8 是顯示 NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-kO、NTA4L-G3/ NTA4R-cont/GC33_kO 和NTA4L/NTA4R/GC33-kO在pH梯度洗脫條件下的蛋白A柱層析純化的層析圖的 圖9是以一價與IgA結(jié)合的Fcalpha受體Fe融合蛋白分子的模式 圖10是顯示利用蛋白A進行純化的IAL-cont/IAR-cont和IAL/IAR的尺寸排阻層析分析結(jié)果的 圖11是天然型抗IL-6受體 抗GPC3雙特異性抗體即nol的模式 圖12是在nol中交換抗GPC3抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域而得到的no2的模式圖； 圖13是向no2中導(dǎo)入改變各鏈的等電點的修飾而得到的no3的模式 圖14是向no3中導(dǎo)入促進H鏈異源締合化的修飾和用于純化利用蛋白A進行異源締合化的抗體的修飾而得到的no5的模式 圖15是向no5中導(dǎo)入促進目標(biāo)H鏈和目標(biāo)L鏈的締合的修飾而得到的no6的模式圖；圖16是顯示通過陽離子交換層析評價作為抗IL-6受體 抗GPC3雙特異性抗體的nol、no2、no3、no5、no6的表達模式的層析圖的 圖17是顯示使用HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare)對no6的CM進行pH梯度洗脫的層析圖的 圖18是顯示通過陽離子交換層析分析評價使用SP Sepharose HP柱(GE Healthcare)純化no6的蛋白A純化組分得到的主峰組分的層析圖的圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的多肽多聚體的制備方法。本發(fā)明的多肽多聚體的制備方法，其特征在于，包括
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差巳本發(fā)明的多肽多聚體的制備方法還可以表達為與蛋白A的結(jié)合力被改變的多肽多聚體的制備方法。此外，在本發(fā)明中，“具有第I抗原結(jié)合活性的多肽”可以表達為“具有抗原結(jié)合活性的第I多肽”。“具有第2抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的多肽”可以表達為“具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽”。后述的“具有第3抗原結(jié)合活性的多肽”、“具有第4抗原結(jié)合活性的多肽”也可以同樣表達。在本發(fā)明中，“包含”是指“包含”或“由 構(gòu)成”。本發(fā)明還提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的多肽多聚體的純化方法。本發(fā)明的多肽多聚體的純化方法，其特征在于，包括 (a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)通過蛋白A親和層析回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差
巳一個或多個氨基酸殘基被修飾的、具有抗原結(jié)合活性的多肽可以如下獲得制備編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的多肽的DNA，修飾該DNA的一個或多個核苷酸，之后將其導(dǎo)入本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的細(xì)胞中，培養(yǎng)該細(xì)胞使這些DNA表達，之后回收表達產(chǎn)物，由此即可獲得。因此，本發(fā)明的多肽多聚體的制備方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽的DNA和編碼第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將步驟(b)的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。此外，本發(fā)明的多肽多聚體的純化方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽的DNA和編碼第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將步驟(b)的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及(d)通過蛋白A親和層析從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。在本發(fā)明中，多肽多聚體是指包含第I多肽和第2多肽的異源多聚體。優(yōu)選第I多肽和第2多肽彼此對不同的抗原顯示出結(jié)合活性。彼此顯示出不同的抗原結(jié)合活性的第I多肽和第2多肽只要是一方的多肽與另一方的多肽具有不同的抗原結(jié)合位點(氨基酸序列)即可，沒有任何限定。例如，如后述的圖4所示，一方的多肽可以和不同于另一方的多肽的抗原結(jié)合活性位點融合?；蛘撸绾笫龅膱D4、圖6或圖9所示，一方的多肽可以是不具有另一方的多肽所具有的抗原結(jié)合活性位點的、以一價與抗原結(jié)合的多肽。本發(fā)明的多肽多聚體也包括包含這樣的第I多肽和第2多肽的多肽多聚體。作為多聚體，可以列舉二聚體、三聚體、四聚體等，但并不限于這些。另外，本發(fā)明的第I多肽和/或第2多肽可以和一個或兩個第3多肽形成多聚體。因此，本發(fā)明提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽、和一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的多肽多聚體的 制備方法，該方法包括以下步驟
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
或者
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼一個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差
巳升。上述方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽和第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將編碼第I多肽、第2多肽和兩個第3多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。或者
(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼一個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽和第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；(C)將編碼第I多肽、第2多肽和第3多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。另外，本發(fā)明的第I多肽和第2多肽可以與第3多肽和第4多肽形成多聚體。因此，本發(fā)明提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性的第2多肽、具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的多肽多聚體的制備方法，該方法包括以下步驟
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或另一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異。上述方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽和第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將編碼第I多肽、第2多肽、第3多肽和第4多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。本發(fā)明提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽和一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的多肽多聚體的純化方法，該方法包括以下步驟
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
或者
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼一個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達的；以及
(b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異。上述方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽和第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將編碼第I多肽、第2多肽和兩個第3多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及 (d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟?；蛘?br> (a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA和編碼一個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽和第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將編碼第I多肽、第2多肽和第3多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。本發(fā)明還提供包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性的第2多肽、具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的多肽多聚體的純化方法，該方法包括以下步驟
(a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA和編碼具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達的步驟；以及
(b)通過蛋白A親和層析回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟，
其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異。上述方法還可以表達為包含以下(a) (d)的步驟的方法。(a)提供編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA、編碼具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA和編碼具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA的步驟；
(b)在步驟(a)的編碼第I多肽的DNA和編碼第2多肽的DNA的雙方或任一方中修飾一個或多個核苷酸，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的步驟；
(c)將編碼第I多肽、第2多肽、第3多肽和第4多肽的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使DNA表達的步驟；以及
(d)通過蛋白A親和層析從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收步驟(c)的表達產(chǎn)物的步驟。在本發(fā)明的包含第I多肽、第2多肽、和一個或兩個第3多肽的多肽多聚體中，第I多肽和第2多肽分別可以與第3多肽形成多聚體(二聚體)。另外，所形成的二聚體彼此之間可以形成多聚體。兩個第3多肽可以具有完全相同的氨基酸序列(可以對相同的抗原具有結(jié)合活性)?；蛘?，雖然是相同的氨基酸序列，但可以具有兩種以上的活性(例如可以對2種以上的不同抗原具有結(jié)合活性)。另外，當(dāng)?shù)?多肽為一個時，第3多肽可以與第I多肽或第2多肽中的任一方形成二聚體，進而形成多肽多聚體。在本發(fā)明的多肽多聚體中，優(yōu)選第I多肽和第2多肽與不同的抗原具有結(jié)合活性。一方的第3多肽可以和第I多肽或第2多肽中的任一個或雙方對相同抗原具有結(jié)合活性的多肽?；蛘?，一方的第3多肽可以是和第I多肽或第2多肽對不同的抗原具有結(jié)合活性的多肽?；蛘?，本發(fā)明的多肽多聚體還可以是包含第I多肽、第2多肽、第3多肽和第4多肽的多肽多聚體。在這樣的多肽多聚體中，第I多肽和第2多肽分別可以與第3多肽和第4多肽形成多聚體(二聚體)。例如，通過在第I多肽和第3多肽、第2多肽和第4多肽之間形成二硫鍵，可以形成二聚體。
在本發(fā)明的多肽多聚體中，優(yōu)選第I多肽和第2多肽對不同的抗原具有結(jié)合活性。 一方的第3多肽可以是和第I多肽或第2多肽中的任一方或雙方對相同抗原具有結(jié)合活性的多肽?；蛘撸环降牡?多肽可以是與第I多肽或第2多肽對不同抗原具有結(jié)合活性的多肽。另外，第4多肽可以是與第I多肽或第2多肽中的任一方對相同抗原具有結(jié)合活性的多肽?；蛘撸?多肽可以是與第I多肽或第2多肽對不同抗原具有結(jié)合活性的多肽。具體而言，例如，當(dāng)?shù)贗多肽和第2多肽分別為包含抗抗原A的抗體重鏈的氨基酸序列的多肽和包含抗抗原B的抗體重鏈的氨基酸序列的多肽時，可以使第3多肽成為包含抗抗原A的抗體輕鏈的氨基酸序列的多肽、使第4多肽成為包含抗抗原B的抗體輕鏈的氨基酸序列的多肽。當(dāng)本發(fā)明的多肽多聚體分別具有包含不同的兩種抗體輕鏈的氨基酸序列的第3多肽和第4多肽時，除第I多肽和第2多肽與蛋白A的結(jié)合力之差外，還可以按照后述的方法，使第3多肽和第4多肽的pi值達到不同的值；或者，通過使與蛋白L的結(jié)合力產(chǎn)生差異，可以更高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)多肽多聚體。另外，例如當(dāng)?shù)贗多肽為包含抗抗原A的抗體重鏈的氨基酸序列的多肽、第2多肽為包含抗抗原B的抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的多肽、第3多肽為包含抗抗原A的抗體輕鏈的氨基酸序列的多肽、第4多肽為包含抗抗原B的抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的多肽時，通過利用本發(fā)明，也可以以更高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)的具有第I多肽 第4多肽的多肽多聚體。此時，如后述的實施例12所述，通過向本發(fā)明的與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的多肽中導(dǎo)入改變多肽的Pl值的氨基酸突變或促進目標(biāo)多肽的締合的氨基酸突變(W02006/106905)，可以以更高純度且有效率地純化或制備目標(biāo)的具有第I多肽 第4多肽的多肽多聚體。作為為了促進多肽締合而導(dǎo)入的氨基酸突變，還可以采用下述方法Protein Eng. 1996Jul; 9(7) : 617-21. ,Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202.、J Biol Chem.2010 Jun 18; 285(25) : 19637-46.、W02009080254等中記載的通過修飾重鏈恒定區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域使兩種包含重鏈恒定區(qū)的多肽發(fā)生異源締合化的方法；以及W02009080251、W02009080252, W02009080253等中記載的促進重鏈與輕鏈的特定組合的締合化的方法等。在本發(fā)明中，“具有抗原結(jié)合活性的多肽”是指具有可與抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)、受體、受體與Fe區(qū)的融合肽、Scaffold以及它們的片段等抗原、配體等蛋白或肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(區(qū))、且具有5個氨基酸以上的長度的肽和蛋白。即，具有抗原結(jié)合活性的多肽可以包含抗體可變區(qū)、受體、受體與Fe區(qū)的融合肽、Scaffold或這些片段的氨基酸序列。作為scaffold，只要是可以與至少一個抗原結(jié)合的立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多肽，可以使用任何多肽。作為這樣的多肽，例如除了抗體可變區(qū)片段、纖連蛋白、蛋白A結(jié)構(gòu)域、LDL受體A結(jié)構(gòu)域、脂籠蛋白等以外,還可以列舉Nygren等人在(Current Opinion in StructuralBiology, 7: 463-469 (1997)、Journal of Immunol Methods, 290: 3-28(2004))中、Binz等人在(Nature Biotech 23: 1257-1266 (2005))中以及 Hosse 等人在(Protein Science15: 14-27(2006))中記載的分子，但并不限于這些?？贵w的可變區(qū)、受體、受體與Fe區(qū)的融合肽、Scaffold以及它們的片段的獲取方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。該具有抗原結(jié)合活性的多肽可以是來源于生物的多肽，也可以是人工設(shè)計的多肽。還可以是來源于天然蛋白、來源于合成蛋白、來源于重組蛋白等的任一種多肽。而且，只 要具有與抗原的結(jié)合能力，可以是具有可與抗原、配體等蛋白或肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(區(qū))、且具有10個氨基酸以上的長度的肽和蛋白的片段，還可以包含多個可與抗原(還包括配體)結(jié)合的區(qū)。具有抗原結(jié)合活性的多肽還可以表達為具有抗原結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。在本發(fā)明中，“不具有抗原結(jié)合活性的多肽”是指不具有抗原結(jié)合活性的抗體的片段、Fe區(qū)、Scaffold以及它們的片段等具有5個氨基酸以上的長度的肽和蛋白。S卩，不具有抗原結(jié)合活性的多肽可以包含抗體恒定區(qū)、Fe區(qū)、Scaffold或它們的片段的氨基酸序列，但并不限于這些。通過將不具有抗原結(jié)合活性的多肽和具有抗原結(jié)合活性的多肽組合，還可以制備以一價與抗原結(jié)合的多肽多聚體。另外，本發(fā)明的具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽可以包含抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列或抗體Fe區(qū)的氨基酸序列。作為抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可以列舉人IgG型的恒定區(qū)或Fe區(qū)的氨基酸序列，但并不限于這些。作為IgG型的恒定區(qū)或Fe區(qū)，可以是天然型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的同源型中的任一種?；蛘?，可以是它們的變體。另外，本發(fā)明的具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽可以包含抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。作為抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可以列舉人K、人、型的恒定區(qū)的氨基酸序列，但并不限于此?；蛘撸梢允撬鼈兊淖凅w。另外，本發(fā)明的具有抗原結(jié)合活性的多肽可以包含抗體可變區(qū)的氨基酸序列(例如 CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4 的氨基酸序列)。另外，本發(fā)明的具有抗原結(jié)合活性的多肽可以包含抗體重鏈的氨基酸序列或抗體輕鏈的氨基酸序列。更具體而言，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽可以包含抗體重鏈的氨基酸序列，而且具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽可以包含抗體輕鏈的氨基酸序列。另外，當(dāng)目標(biāo)多肽多聚體為以第I多肽和第3多肽形成二聚體、以第2多肽和第4多肽形成二聚體、而且這些二聚體彼此之間形成多聚體的四聚體時，作為本發(fā)明的多肽多聚體，例如既可以使用具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列的多肽、具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列的多肽，也可以使用具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列的多肽、具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的多肽、具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列的多肽、具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的多肽。S卩，本發(fā)明的多肽多聚體可以是多特異性抗體。在本發(fā)明中，“多特異性抗體”是指能夠與至少兩種不同的抗原特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中，“不同的抗原”除了包含抗原分子本身不同的情 形，還包含抗原分子相同而抗原決定簇不同的情形。因此，本發(fā)明的“不同的抗原”例如包含單一分子內(nèi)的不同的抗原決定簇。另外，在本發(fā)明中，識別這樣的單一分子內(nèi)的各個不同的抗原決定簇的抗體被視為“能夠與不同的抗原特異性結(jié)合的抗體”。作為本發(fā)明中的多特異性抗體，可以列舉能夠與兩種抗原特異性結(jié)合的雙特異性抗體，但并不限于此。作為本發(fā)明的優(yōu)選的雙特異性抗體，可以列舉具有人IgG恒定區(qū)的H2L2型(由兩種H鏈和兩種L鏈構(gòu)成)的IgG抗體。更具體而言，例如可以列舉IgG型的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體等，但并不限于這些。另外，具有抗原結(jié)合活性的多肽例如可以是重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)中的至少兩個以單鏈的形式連接的結(jié)構(gòu)的分子?；蛘撸梢允侵劓溈勺儏^(qū)、輕鏈可變區(qū)、Fe區(qū)(缺失CHl結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū))、輕鏈恒定區(qū)中的至少兩個以單鏈形式連接的結(jié)構(gòu)的抗體。在本發(fā)明中，“具有抗原結(jié)合活性的多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異”是指，通過進行具有抗原結(jié)合活性的多肽的表面氨基酸的修飾，在兩種以上的多肽之間，與蛋白A的結(jié)合力變得不等(不同)。更具體而言，例如是指具有抗原結(jié)合活性的第I多肽與蛋白A的結(jié)合力和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。與蛋白A的結(jié)合力之差例如可以通過采用蛋白A親和層析來確認(rèn)。具有抗原結(jié)合活性的多肽與蛋白A的結(jié)合力的強弱與用于洗脫的溶劑的pH有關(guān)，多肽與蛋白A的結(jié)合力越強，則用于洗脫的溶劑的pH越低。因此，“具有抗原結(jié)合活性的多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異”還可以表達為“利用蛋白A親和層析洗脫具有抗原結(jié)合活性的兩種以上的多肽時，在各多肽之間洗脫溶劑的PH不同”。作為洗脫溶劑的pH之差，可以列舉0. I以上、優(yōu)選0. 5以上、進一步優(yōu)選I. 0以上，但并不限于這些。另外，在本發(fā)明中，優(yōu)選在不降低該具有抗原結(jié)合活性的多肽的其他活性(例如血漿中滯留性)的情況下改變其與蛋白A的結(jié)合力?？梢岳镁哂锌乖Y(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力之差，采用蛋白A親和層析，制備或純化目標(biāo)的包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的多肽多聚體。具體而言，例如當(dāng)本發(fā)明的多肽多聚體為L鏈共通化(第3多肽和第4多肽具有相同的氨基酸序列)的雙特異性抗體時，可以利用以下方法制備或純化多肽多聚體。首先，將抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸為精氨酸(R)的編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽(更具體是指第I抗體重鏈)的核酸、第435位的氨基酸為組氨酸(H)的編碼具有抗原結(jié)合活性的第2多肽(更具體是指第2抗體重鏈)的核酸和編碼具有抗原結(jié)合活性的第3多肽(共通L鏈)的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)該細(xì)胞，使DNA—過性表達。接下來，將得到的表達產(chǎn)物負(fù)載到蛋白A柱上，清洗后按照從pH高的洗脫液到pH低的洗脫液的順序洗脫。在由兩條第I抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的同源抗體中，在重鏈恒定區(qū)不存在蛋白A的結(jié)合位點。在由第I抗體重鏈、第2抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的雙特異性抗體中，在重鏈恒定區(qū)存在一個蛋白A的結(jié)合位點。在由兩條第2抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的同源抗體中，在重鏈恒定區(qū)存在兩個蛋白A的結(jié)合位點。如上所述，多肽與蛋白A的結(jié)合力，與蛋白A親和層析中洗脫多肽的溶劑的pH有關(guān)，多肽與蛋白A的結(jié)合力越強，則洗脫溶劑的PH越低。由此，若按照從pH高的洗脫液到pH低的洗脫液的順序進行洗脫，則抗體按照以下的順序洗脫
由兩條第I抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的同源抗體；
由第I抗體重鏈、第2抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的雙特異性抗體；
由兩條第2抗體重鏈和兩條共通L鏈構(gòu)成的同源抗體。 由此，可以制備或純化目標(biāo)多肽多聚體(雙特異性抗體)。按照本發(fā)明的制備方法或純化方法得到的多肽多聚體具有至少為95%以上(例如96%、97%、98%、99% 以上)的純度。作為使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差異的氨基酸殘基的修飾，可以列舉下述的(I)
(3)，但并不限于這些。(I)以具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增加的方式，修飾該任一方的多肽的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基；
(2)以具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低的方式，修飾該任一方的多肽的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基；
(3)以具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增強、而另一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低的方式，修飾具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的一個或多個氨基酸殘基。在本發(fā)明中，優(yōu)選修飾位于具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的多肽表面的氨基酸。另外，優(yōu)選考慮減少由修飾對多肽的其他活性產(chǎn)生的影響。因此，在本發(fā)明中，例如優(yōu)選修飾以下氨基酸殘基抗體的Fe區(qū)或重鏈恒定區(qū)中的 EU 編號第 250-255 位的 TLMISR、第 308-317 位的 VLHQDWLNGK、第 430-436 位的 EALHNHY ；
優(yōu)選第250-254位的TLMIS、第309-312位的LHQD、第314-315位的LN、第430位的E、第 432-436 位的 LHNHY ；
進一步優(yōu)選第251-254位的LMIS、第309-311位的LHQ、第314位的L、第432-435位的LHNH ；
特別是第252-254位的MIS、第309位的L、第311位的Q、第434-436位的NHY的氨基
酸殘基。關(guān)于抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸的修飾，作為優(yōu)選的修飾位置，可以列舉FR1XDR2、FR3。作為更優(yōu)選的修飾位置，例如可以列舉EU編號H15-H23、H56-H59、H63-H72、H79-H83。作為上述的氨基酸的修飾，更優(yōu)選不降低與FcRn的結(jié)合的修飾、不使人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中滯留性惡化的修飾。更具體而言，作為增強多肽與蛋白A的結(jié)合力的修飾，可以列舉將抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基取代成組氨酸(His)，但并不限于此。另外，作為降低多肽與蛋白A的結(jié)合力的修飾，可以列舉將抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基取代成精氨酸，但并不限于這些。另外，在抗體的重鏈可變區(qū)中，由于VH3亞類(subclass)的重鏈可變區(qū)與蛋白A具有結(jié)合性，因此為了提高與蛋白A的結(jié)合力，優(yōu)選上述修飾位點的氨基酸序列與VH3亞類的重鏈可變區(qū)序列相同；為了降低與蛋白A的結(jié)合力，優(yōu)選與其他亞類的重鏈可變區(qū)序列相同。 如后所述，氨基酸殘基的修飾可以通過在編碼多肽的DNA中修飾一個或多個核苷酸、并使該DNA在宿主細(xì)胞中表達來進行。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)修飾后的氨基酸殘基的種類，可以容易地確定應(yīng)該修飾的核苷酸的數(shù)目、位點或種類。在本發(fā)明中，修飾是指取代、缺失、添加、插入中的任一種或它們的組合。另外，具有抗原結(jié)合活性的多肽除了包含上述的氨基酸序列的修飾外，還可以進一步包含附加的修飾。附加的修飾例如可以是氨基酸的取代、缺失和修飾中的任一種、或者選自它們的組合。具體而言，在氨基酸序列中包含下述修飾的多肽均包含在本發(fā)明中
用于提高雙特異性抗體的兩種H鏈的異源締合率的氨基酸修飾；
用于使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽間的二硫鍵穩(wěn)定的氨基酸修飾；
用于改善抗體的血漿中滯留性的氨基酸修飾；
用于提高酸性條件下的穩(wěn)定性的修飾；
用于降低異質(zhì)性的修飾；
用于抑制脫酰胺反應(yīng)的修飾；
用于向兩種多肽間導(dǎo)入等電點差異的修飾；
用于改變與Fe Y受體的結(jié)合性的修飾。以下，對這些氨基酸修飾進行闡述。用于提高雙特異性抗體的兩種H鏈的異源締合率的氨基酸修飾
可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與W02006106905中記載的氨基酸修飾組合起來。對修飾位點沒有限定，只要是形成兩個具有抗原結(jié)合活性的多肽內(nèi)的界面的氨基酸即可。具體而言，例如當(dāng)修飾重鏈恒定區(qū)時，可以列舉在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第356位和第439位、第357位和第370位、以及第399位和第409位的組合中，將至少一個組合修飾成帶有相同電荷的氨基酸；在具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的重鏈恒定區(qū)的EU編號第356位和第439位、第357位和第370位、以及第399位和第409位的組合中，將至少一個組合修飾成與具有抗原結(jié)合活性的第I多肽具有相反電荷的氨基酸。更具體而言，例如在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中，向任一方的多肽中導(dǎo)入將EU編號第356位的Glu取代成Lys的突變、向另一方的多肽中導(dǎo)入將EU編號第439位的Lys取代成Glu的突變。通過將這樣的修飾與本發(fā)明的修飾組合，僅通過使用蛋白A的純化，即可以更高的純度得到目標(biāo)多肽。另外，通過將具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的重鏈可變區(qū)的Kabat編號第39位和/或重鏈恒定區(qū)的EU編號第213位、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的重鏈可變區(qū)的Kabat編號第39位和/或重鏈恒定區(qū)的EU編號第213位分別修飾成帶有相反電荷的氨基酸，將具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的輕鏈可變區(qū)的Kabat編號第38位和/或EU編號第123位、和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的輕鏈可變區(qū)的Kabat編號第38位和/或EU編號第123位分別修飾成帶有相反電荷的氨基酸，也可以以更高的純度且有效率地純化或制備包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽 第4多肽的目標(biāo)多肽多聚體。用于使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽間的二硫鍵穩(wěn)定的氨基酸修飾如公知文獻(Mol. Immunol. 1993，30，105-108 和 Mol. Immunol. 2001，38，1-8)所記載，通過將IgG4重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第228位的Ser取代成Pro，消除了 IgG4的異質(zhì)性，可以維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。用于改善抗體的血■漿中滯留性的氨基酸修飾
為了調(diào)節(jié)血漿中滯留性，可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與用于改變抗體Pl值的氨基酸修飾組合起來。關(guān)于恒定區(qū)的修飾，例如可以列舉公知文獻(J. Immunol. 2006, 176(1):346-356 或 Nat. Biotechnol. 1997 15(7) : 637-640 等)中記載的 EU 編號第 250 位或第428位等的氨基酸修飾。作為可變區(qū)的修飾，可以列舉W02007/114319或W02009/041643中記載的氨基酸修飾。被修飾的氨基酸優(yōu)選暴露在具有抗原結(jié)合活性的多肽表面的氨基酸。例如可以列舉重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第196位的氨基酸的取代。當(dāng)重鏈恒定區(qū)為IgG4時，例如通過將第196位的賴氨酸取代成谷氨酰胺，可以降低pi值、提高血漿中滯留性。另外，通過改變與FcRn的結(jié)合力，也可以調(diào)節(jié)血漿中滯留性。作為用于改變與FcRn的結(jié)合力的氨基酸修飾,例如有公知文獻(The Journal of Biological Chemistry,第 276 卷，No. 9 6591-6604，2001 或 Molecular Cell,第 7 卷，867-877，2001 或 CurrOpin Biotechnol. 2009, 20(6): 685-91.)中記載的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸取代。例如可以列舉EU編號第233位、第238位、第253位、第254位、第255位、第256位、第258位、第265位、第272位、第276位、第280位、第285位、第288位、第290位、第292位、第293位、第295位、第296位、第297位、第298位、第301位、第303位、第305位、第307位、第309位、第311位、第312位、第315位、第317位、第329位、第331位、第338位、第360位、第362位、第376位、第378位、第380位、第382位、第415位、第424位、第433位、第434位、第435位、第436位等位點的氨基酸取代。用于提高酸性條件下的穩(wěn)定性的修飾
當(dāng)使用IgG4作為重鏈恒定區(qū)時,優(yōu)選抑制酸性條件下的IgG4的半分子化,維持穩(wěn)定的4鏈結(jié)構(gòu)(H2L2結(jié)構(gòu))。因此，優(yōu)選將對維持4鏈結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用的EU編號第409位的氨基酸即精氨酸(Immunology 2002, 105, 9-19)取代成即使在酸性條件下也維持穩(wěn)定的4鏈結(jié)構(gòu)的IgGl型的賴氨酸。另外，為了提高IgG2的酸穩(wěn)定性，還可以將EU編號第397位的氨基酸即蛋氨酸取代成纈氨酸?？梢詫⑸鲜鲂揎椗c本發(fā)明的氨基酸修飾組合使用。用于降低異質(zhì)性的修飾
可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與W02009041613中記載的方法組合。具體而言，例如可以將使IgGl重鏈恒定區(qū)C末端的兩個氨基酸、即EU編號第446位的甘氨酸和第447位的賴氨酸缺失的修飾與基于本發(fā)明的實施例的氨基酸修飾組合。用于抑制脫酰胺反應(yīng)的修飾
可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與用于抑制脫酰胺反應(yīng)的氨基酸修飾組合。有報道稱，脫酰胺反應(yīng)特別是在天冬酰胺(N)與甘氨酸(G)相鄰的位點( NG )容易發(fā)生(Geiger等人，J. Bio. Chem. 1987; 262: 785-794)。當(dāng)本發(fā)明的多肽多聚體(多特異性抗體)中存在天冬酰胺與甘氨酸相鄰的位點時，通過修飾該氨基酸序列，可以抑制脫酰胺反應(yīng)。具體而言，例如將天冬酰胺和甘氨酸中的任一方或雙方的氨基酸取代成其他的氨基 酸。更具體而言，例如可以列舉將天冬酰胺取代成天冬氨酸。用于向兩種多肽間導(dǎo)入等電點的差異的修飾
可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與用于導(dǎo)入等電點的差異的氨基酸修飾組合。具體方法例如記載在W02007/114325中。除本發(fā)明的修飾外，還修飾具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的氨基酸序列，使這些多肽的等電點值產(chǎn)生差異，從而可以以更高的純度且有效率地純化或制備目標(biāo)多肽。另外，通過使具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的等電點產(chǎn)生差異，也可以以更高的純度且有效率地純化或制備包含第I多肽 第4多肽的目標(biāo)多肽多聚體。作為具體的修飾位點，當(dāng)?shù)贗多肽和第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列時，可以列舉如=Kabat編號中的第 1、3、5、8、10、12、13、15、16、19、23、25、26、39、42、43、44、46、68、71、72、73、75、76、81、82b、83、85、86、105、108、110、112位。當(dāng)?shù)?多肽和第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列時，可以列舉如Kabat 編號中的第 1、3、7、8、9、11、12、16、17、18、20、22、38、39、41、42、43、45、46、49、57、60、63、65、66、68、69、70、74、76、77、79、80、81、85、100、103、105、106、107、108位。通過使一方的多肽中的上述位點的至少一個氨基酸殘基成為帶有電荷的氨基酸、使另一方的多肽中的上述位點的至少一個氨基酸殘基成為帶有與該電荷相反的電荷的氨基酸殘基或不帶電荷的氨基酸殘基，可以使等電點產(chǎn)生差異。用于改變與Fe Y受體的結(jié)合件的修飾
可以將本發(fā)明的氨基酸修飾與用于改變(增加或者降低)與Fe Y受體的結(jié)合性的氨基酸修飾組合。作為改變與Fe Y受體的結(jié)合性的修飾,可以列舉Curr Opin Biotechnol.2009，20(6): 685-91.中記載的修飾，但并不限于此。具體方法例如有通過將本發(fā)明的修飾與將IgGl重鏈恒定區(qū)的EU編號第234位和第235位的亮氨酸以及第272位的天冬酰胺取代成其他氨基酸的修飾組合，可以改變與Fe Y受體的結(jié)合性。作為取代后的氨基酸，例如有丙氨酸，但并不限于此。以下，對編碼具有抗原結(jié)合活性的多肽的DNA的制備、一個或多個核苷酸的修飾、DNA的表達、表達產(chǎn)物的回收進行說明。編碼具有抗原結(jié)合活性的多狀的DNA的制備
在本發(fā)明中，編碼具有抗原結(jié)合活性的多肽的DNA或編碼不具有抗原結(jié)合活性的多肽的DNA可以使用已知序列(天然存在的序列、不存在的序列)的全長或一部分、或它們的組合。這樣的DNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法獲得。例如，既可以由抗體文庫獲得，也可以由產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆編碼抗體的基因而獲得。關(guān)于抗體文庫，已經(jīng)有多個抗體文庫是公知的，另外抗體文庫的制作方法也眾所周知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲取適當(dāng)?shù)目贵w文庫。例如，關(guān)于噬菌體抗體文庫，可以參照Clackson 等人，Nature 1991，352 :624-8 ；Marks 等，J. Mol. Biol. 1991,222 :581-97 ；Water houses 等人，Nucleic Acids Res. 1993,21 :2265-6 !Griffiths 等人，EMBO J.1994,13 :3245-60 ；Vaughan 等人，Nature Biotechnology 1996,14 :309-14 或日本特表平20-504970號公報等文獻。此外，可以使用以真核細(xì)胞作為文庫的方法(W095/15393號小冊子)或核糖體提示法等公知方法。而且，還已知使用人抗體文庫，通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，可以以人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法使之在噬菌體表面表達來選擇與抗原結(jié)合的曬菌體。分析所選擇的曬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。一旦清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，就可以根據(jù)該序列制作適當(dāng)?shù)谋磉_載體，獲得人抗體。上述方法已經(jīng)眾所周知，可以參考W092/01047、TO92/20791、TO93/06213、TO93/11236、TO93/19172、TO95/01438、W095/15388。
由雜交瘤獲得編碼抗體的基因的方法，基本上可以使用公知技術(shù)。具體而言，使用所需抗原或表達所需抗原的細(xì)胞作為致敏抗原，按照通常的免疫方法對其進行免疫。利用通常的細(xì)胞融合法使所得免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，再利用通常的篩選法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤)。通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄所得雜交瘤的mRNA,可以獲得抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。通過將該cDNA與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，可以獲得編碼抗體的基因。更具體而言，可以例示以下方法，但并不限于此。用于得到編碼抗體重鏈和輕鏈的抗體基因的致敏抗原，包括具免疫原性的完全抗原和不具免疫原性的不完全抗原兩者，上述不完全抗原包括半抗原等。例如，可以使用目標(biāo)蛋白的全長蛋白或部分肽等。此外，已知由多糖類、核酸、脂質(zhì)等構(gòu)成的物質(zhì)能夠成為抗原，在本發(fā)明中對抗原沒有特別限定?？乖闹苽淇梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來進行，例如可以按照使用桿狀病毒的方法(例如W098/46777等)等進行。雜交瘤的制作，例如可以按照 Milstein 等人的方法(G. Kohlei^PC. Milstein, Methods Enzymol. 1981,73 3-46)等來進行。當(dāng)抗原的免疫原性低時，可以使之與白蛋白等具免疫原性的大分子結(jié)合來進行免疫。根據(jù)需要，還可以使抗原與其他分子結(jié)合，從而成為可溶性抗原。當(dāng)使用受體等跨膜分子作為抗原時，可以使用受體的胞外區(qū)部分作為片段，或者使用在細(xì)胞表面上表達跨膜分子的細(xì)胞作為免疫原。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以通過使用上述適當(dāng)?shù)闹旅艨乖?，對動物進行免疫而得到。或者,在體外對能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞進行免疫而成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。進行免疫的動物可以使用各種哺乳動物，但通常使用嚙齒類、兔形目、靈長類動物。可以例示小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒類；兔等兔形目；食蟹猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩等猴等靈長類動物。此外，還已知具有人抗體基因的所有組成成分(repertories)的轉(zhuǎn)基因動物,通過使用上述動物，也可以得到人抗體(參照 W096/34096 ；Mendez 等，Nat. Genet. 1997，15 :146-56)。不使用上述轉(zhuǎn)基因動物，而是通過在體外用所需抗原或表達所需抗原的細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，并使致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞、例如U266融合，也可以得到具有抗原結(jié)合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878號公報)。另外，還可以通過用所需抗原對具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物進行免疫，得到所需的人抗體(參照W093/12227、W092/03918、W094/02602, W096/34096,W096/33735)。動物的免疫可如下進行將致敏抗原用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水等適當(dāng)稀釋并懸浮，根據(jù)需要混合佐劑并進行乳化，然后注射到動物的腹腔內(nèi)或皮下來進行免疫。之后，優(yōu)選每4 21天給予數(shù)次混合在弗式不完全佐劑中的致敏抗原?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法測定動物血清中目標(biāo)抗體的效價來確認(rèn)抗體的產(chǎn)生。雜交瘤可如下制備使用常用融合劑(例如聚乙二醇)，使自動物或淋巴細(xì)胞得到的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來制備，上述動物經(jīng)所需抗原免疫(Golding,Monoclonal Antibodies (單克隆抗體)Principles and Practice, Academic Press,1986,59-103)。根據(jù)需要培養(yǎng)、增殖雜交瘤細(xì)胞，再通過免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法，測定由該雜交瘤產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。之后，根據(jù)需要可以利用限度稀釋法等方法亞克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤，上述抗體的目標(biāo)特異性、親和性或活性已測定。接下來，可以使用能夠與抗體特異性結(jié)合的探針(例如與編碼抗體恒定區(qū)的序列互補的寡核苷酸等)，由雜交瘤或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(致敏淋巴細(xì)胞等)克隆編碼所選擇的抗體的基因。還可以通過RT-PCR由mRNA進行克隆。免疫球蛋白分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五個不同類別。而且，這些類別分成幾個亞類(同源型)(例如，IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ；IgA-I和IgA-2等)。本發(fā)明中，對抗體制備中使用的重鏈和輕鏈沒有特別限定，可以來源于屬于上述任一類別和亞類的抗體，特別優(yōu)選為IgG。這里，還可以通過基因工程技術(shù)修飾編碼重鏈和輕鏈的基因。例如，對于小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、山羊抗體、駱駝抗體等抗體，為了減弱其對人的異源抗原性等，可以適當(dāng)制作人工修飾的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體等。嵌合抗體是由除了人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)構(gòu)成的抗體，可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連 接，將其插入表達載體中，并導(dǎo)入宿主中而產(chǎn)生。人源化抗體也稱作重構(gòu)(reshaped)人抗體，可通過PCR法由多個寡核苷酸合成，上述寡核苷酸制作成在DNA序列的末端具有重疊部分，上述DNA序列設(shè)計成連接除人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR)。將所得DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后插入表達載體中，并將其導(dǎo)入到宿主中而產(chǎn)生人源化抗體(參照EP239400 ；W096/02576)。經(jīng)由⑶R連接的人抗體的FR，選擇互補性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合位點的FR。根據(jù)需要，可以取代抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補性決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點(K. Sato等,Cancer Res. 1993, 53 851-856)。本發(fā)明的單克隆抗體包含這樣的人源化抗體或嵌合抗體。當(dāng)本發(fā)明中的抗體為嵌合抗體或人源化抗體時，上述抗體的恒定區(qū)優(yōu)選使用來源于人抗體的恒定區(qū)。例如，在重鏈中可以使用Crl、Cr2、Cr3、Cr4 ;在輕鏈中可以使用
、(^。為了改善抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性，根據(jù)需要可以修飾人抗體恒定區(qū)。本發(fā)明中的嵌合抗體優(yōu)選由來源于人以外的哺乳動物的抗體的可變區(qū)和來源于人抗體的恒定區(qū)構(gòu)成。而人源化抗體優(yōu)選由來源于人以外的哺乳動物的抗體的CDR和來源于人抗體的FR和C區(qū)構(gòu)成。來源于人抗體的恒定區(qū)具有各IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等同源型所固有的氨基酸序列。本發(fā)明中的人源化抗體所使用的恒定區(qū)可以是屬于任意同源型的抗體的恒定區(qū)。優(yōu)選使用人IgG的恒定區(qū)，但并不限于此。對用于人源化抗體的來源于人抗體的FR也沒有特別限定，可以是屬于任意同源型的抗體的FR。本發(fā)明中的嵌合抗體和人源化抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)，只要表示原始抗體的結(jié)合特異性即可，可以通過缺失、取代、插入和/或添加等進行修飾。使用了來源于人的序列的嵌合抗體和人源化抗體，由于其在人體內(nèi)的抗原性減弱，所以認(rèn)為其在出于治療目的等對人給藥時有效。在本發(fā)明中，為了改變抗體的生物學(xué)特性，可以修飾氨基酸。關(guān)于小分子抗體，無論是從體內(nèi)動力學(xué)性質(zhì)方面考慮，還是從可以使用大腸桿菌、植物細(xì)胞等低成本地進行制備方面考慮，其作為抗體都是有用的。 抗體片段是一種小分子抗體。小分子抗體還包括以抗體片段作為其一部分結(jié)構(gòu)的抗體。本發(fā)明中的小分子抗體只要具有抗原結(jié)合能即可，對其結(jié)構(gòu)、制備方法等沒有特別限定。在小分子抗體中，還存在具有高于全長抗體的活性的抗體(Orita等人，Blood(2005)105:562-566)。本說明書中，“抗體片段”只要是全長抗體(例如全長IgG等)的一部分即可，沒有特別限定，但優(yōu)選包括重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)。優(yōu)選的抗體片段的例子有Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv等?？贵w片段中的重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列，可以通過取代、缺失、添加和/或插入來修飾。并且，只要保持抗原結(jié)合能即可，可以缺失重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列的一部分。例如，上述抗體片段中，“Fv”是包括完整的抗原識別位點和結(jié)合位點的最小抗體片段?！癋v”是一個重鏈可變區(qū)(VH)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)通過非共價鍵強力結(jié)合而成的二聚體(VH-VL 二聚體)。通過各可變區(qū)的3個互補鏈決定區(qū)(⑶R)，在VH-VL 二聚體的表面形成抗原結(jié)合位點。6個CDR賦予抗體以抗原結(jié)合位點。但是，即使是一個可變區(qū)(或者是僅包括3個抗原特異性CDR的Fv的一半)，雖然和全結(jié)合位點相比親和性低，但是也具有識別并結(jié)合抗原的能力。因此，較上述Fv小的分子也包括在本發(fā)明的抗體片段內(nèi)。還可以對抗體片段的可變區(qū)進行嵌合和人源化。小分子抗體優(yōu)選包括重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)兩者。小分子抗體的例子有Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv等抗體片段、以及使用抗體片段制作的scFv (單鏈Fv) (Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85 :5879-83 ；Pluckthun “ThePharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體藥理學(xué))”第 113 卷，Reaenburg和 Moore 編，Springer Verlag, New York,第 269-315 頁，(1994))、雙抗體(diabody)(Holliger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90 :6444-8 ;EP404097 號；W093/11161 號；Johnson 等人，Method in Enzymology (1991) 203 :88-98 ；Holliger等人，Protein Engineering (1996) 9 :299-305 ；Perisic 等人，Structure (1994) 2:1217-26 ；John 等人，Protein Engineering(1999) 12(7) :597-604 ；Atwell 等人，Mol.Immunol. (1996) 33:1301-12)、sc (Fv) 2 (Hudson 等人，J Immunol. Methods (1999) 231 177-89 ；Orita 等人，Blood (2005) 105 :562-566)、三鏈抗體(triabody) (Journal ofImmunological Mtthods (1999) 231 :177-89)和串聯(lián)雙抗體(Cancer Rrsearch (2000) 60:4336-41)等?？贵w片段可以通過將抗體用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶進行處理而得至丨J (參照 Morimoto 等人，J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24 :107-17 ;Brennan 等人，Science (1985) 229:81)。還可以根據(jù)該抗體片段的氨基酸序列通過基因重組來制備。具有修飾了抗體片段的結(jié)構(gòu)的小分子抗體，可以利用通過酶處理或基因重組得到的抗體片段來構(gòu)建。或者，還可以構(gòu)建編碼小分子抗體整體的基因，并將其導(dǎo)入表達載體中，之后使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(例如，參照Co等人，J. Immunol. (1994)152 :2968-76 ；Better 和 Horwitz, Methods EnzymoI. (1989) 178 :476-96 ；Pluckthun 和Skerra, Methods EnzymoI. (1989) 178 :497-515 ；Lamoyi, Methods EnzymoI. (1986) 121 652-63 ；Rousseaux 等人，Methods EnzymoI. (1986) 121 :663-9 ;Bird 和 Walker, TrendsBiotechnol. (1991) 9:132-7)。上述“scFv”是單鏈多肽，該單鏈多肽中兩個可變區(qū)根據(jù)需要經(jīng)由接頭等連接。scFv所含的兩個可變區(qū),通常是一個VH和一個VL,但也可以是兩個VH或兩個VL。通常，scFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間含有接頭，通過該接頭形成用于抗原結(jié)合所必需的VH和VL的成對部分。通常，為了在相同分子內(nèi)在VH和VL之間形成成對部分，一般使連接VH和VL 的接頭為10個氨基酸以上長度的肽接頭。但是，本發(fā)明中的scFv的接頭，只要不妨礙scFv的形成即可，并不限于上述肽接頭。scFv的綜述可以參照Pluckthun “The Pharmacologyof Monoclonal Antibody”第 113 卷(Rosenburg and Moore 編，Springer Verlag, NY,第269-315 頁(1994))。另外，“雙抗體(Db)”是指通過基因融合而構(gòu)建的二價的抗體片段(P. Holliger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)、EP404, 097 號、W093/11161 號等)。雙抗體是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體，每一條多肽鏈在同一鏈中輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)通過短至無法相互結(jié)合的接頭、例如5個殘基左右的接頭進行連接。編碼在同一多肽鏈上的VL和VH，由于其間的接頭短而無法形成單鏈V區(qū)片段(fragment)，從而形成了二聚體，因此雙抗體有兩個抗原結(jié)合位點。此時，若相對兩個不同表位(a，b)的VL和VH同時表達通過5個殘基左右的接頭連接的VLa-VHb和VLb-VHa的組合，則以雙特異性Db的形式分泌。雙抗體包含兩分子的scFv，因此包含四個可變區(qū)，其結(jié)果，雙抗體具有兩個抗原結(jié)合位點。與未形成二聚體的scFv的情況不同，為了形成雙抗體時，通常，當(dāng)各scFv分子內(nèi)的連接VH和VL間的接頭為肽接頭時，是5個氨基酸左右的接頭。但是，關(guān)于形成雙抗體的scFv的接頭，只要不妨礙scFv的表達和雙抗體的形成即可，并不限于上述肽接頭。需要說明的是，本發(fā)明的小分子抗體和抗體片段優(yōu)選進一步具有抗體重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。一個或多個核苷酸的改變
在本發(fā)明中，“核苷酸的改變”是指，進行在DNA中插入、缺失或取代至少一個核苷酸的基因操作或突變處理，使由DNA編碼的多肽具有目標(biāo)氨基酸殘基。即，是指將編碼原始氨基酸殘基的密碼子轉(zhuǎn)換成編碼目標(biāo)氨基酸殘基的密碼子。上述核苷酸的改變可以通過位點特異性誘變(參照例如 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488)、PCR 誘變、盒式誘變等方法來進行。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體，其相對于原始抗體可變區(qū)的氨基酸序列，具有70%以上、更優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)的氨基酸序列的同源性和/或相似性。在本說明書中，序列的同源性和/或相似性定義為根據(jù)需要進行序列排比和間隙導(dǎo)入(gap introduction)使序列同源性最大化，之后與原始氨基酸殘基相同(相同殘基)或相似(根據(jù)一般的氨基酸側(cè)鏈的特性分類為同一組的氨基酸殘基)的氨基酸殘基的比例。通常，天然氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈的性質(zhì)分為以下幾組(I)疏水性丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；(2)中性親水性天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、蘇氨酸和絲氨酸；(3)酸性天冬氨酸和谷氨酸；(4)堿性精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。被修飾的氨基酸的數(shù)目例如可以是10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、兩個或一個氨基酸，但并不限于這些。通常，存在于重鏈和輕鏈的可變區(qū)中的共6個互補性決定區(qū)(超可變區(qū)KDR)相互作用，形成抗體的抗原結(jié)合位點。已知即使是其中一個可變區(qū)，盡管與包括所有結(jié)合位點的可變區(qū)相比親和性低，但也具有識別并結(jié)合抗原的能力。因此，本發(fā)明的具有抗原結(jié)合活性的多肽，只要其維持與所需抗原的結(jié)合性即可，可以編碼包括抗體重鏈和輕鏈的各抗原結(jié)合位點的片段部分。
如上所述，通過本發(fā)明的方法，例如可以有效率地取得所期望的實際上保持活性的多肽多聚體。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，作為供給“修飾”的氨基酸殘基，例如可以從抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列、抗體輕鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列中適當(dāng)選擇。DNA的表汰
將編碼如此修飾過的多肽的DNA克隆(插入)到適當(dāng)?shù)妮d體中，并導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。對載體沒有特別限定，只要穩(wěn)定保持插入的核酸即可，例如使用大腸桿菌作為宿主時，可以列舉克隆用載體。作為克隆用載體，優(yōu)選pBluescript載體(Stratagene公司制)等,但也可以使用各種市售載體。當(dāng)為了生產(chǎn)本發(fā)明的多肽多聚體或多肽而使用載體時，表達載體特別實用。對表達載體沒有特別限定，只要是在試管內(nèi)、大腸桿菌內(nèi)、培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)、生物個體內(nèi)表達多肽的載體即可。例如，在試管內(nèi)表達多肽時，優(yōu)選pBEST載體(Promega公司制)；在大腸桿菌內(nèi)表達多肽時，優(yōu)選pET載體(Invitrogen公司制)；在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達多肽時，優(yōu)選PME18S-FL3載體(GenBank Accession No. AB009864);在生物個體內(nèi)表達多肽時，優(yōu)選PME18S載體(Mol Cell Biol. 8 :466-472 (1988))等。向載體中插入DNA，可以利用常規(guī)方法，例如通過使用限制酶位點的連接酶反應(yīng)來進行(Current protocols in MolecularBiology edit. Ausubel 等人.(1987)出版.John Wiley & Sons. Section 11. 4-11. 11)。對上述宿主細(xì)胞沒有特別限定，根據(jù)目的可以使用各種宿主細(xì)胞。作為用于表達多肽的細(xì)胞，例如可以例示細(xì)菌細(xì)胞(例如鏈球菌葡萄球菌{Staphylococcus)、大腸桿菌{E. coli)、鏈霉菌{Streptomyces)、枯草桿菌{BaciIlussubtil is));真菌細(xì)胞(例如酵母(/eaW)、曲霉{Aspergillus));昆蟲細(xì)胞(例如果蠅S2 Wrosophila S2)、草地夜蛾 ^^{Spodoptera SF9));動物細(xì)胞(例如CH0、COS、HeLa,C127、3T3、BHK, HEK293、Bowes黑色素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞。向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入載體，例如可以通過憐酸I丐沉淀法、電穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel 等人.(1987)出版.John Wiley & Sons. Section 9. 1_9. 9)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等公知的方法來進行?？梢韵蚰繕?biāo)多肽中插入適當(dāng)?shù)姆置谛盘?，以使在宿主?xì)胞中表達的多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔、周質(zhì)間隙或胞外環(huán)境中。相對于目標(biāo)多肽而言，上述信號可以是內(nèi)源性信號，也可以是異種信號。需要說明的是，在第I多肽 第4多肽的表達載體的構(gòu)建中，可以將編碼第I多肽 第4多肽的DNA導(dǎo)入到單獨的載體中，形成表達載體?；蛘?，可以將編碼第I多肽 第4多肽的DNA中的多個DNA (例如編碼第I多肽的DNA和編碼第2多肽的DNA)導(dǎo)入到一個載體中，形成表達載體。向一個載體中導(dǎo)入多個DNA形成表達載體時,對導(dǎo)入的編碼多肽的DNA的組合沒有限定。表汰產(chǎn)物的回收 關(guān)于表達產(chǎn)物的回收，當(dāng)多肽分泌到培養(yǎng)基中時，回收培養(yǎng)基。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時，首先溶解該細(xì)胞，之后再回收多肽。自重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化多肽時，可以使用以下公知方法硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親合層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。在本發(fā)明中，優(yōu)選蛋白A親和層析。作為使用蛋白A 的柱,可以列舉 Hyper D(PALL 制)、POROS(Applied Biosystems制)、Sepharose F. F. (GE制)、ProSep (Millipore制)等,但并不限于這些。另外，在蛋白A親和層析中，還可以使用結(jié)合有模擬(mimic)蛋白A的IgG結(jié)合能的配體的樹脂。使用模擬蛋白A時，也可以利用本發(fā)明的氨基酸修飾，使其結(jié)合力產(chǎn)生差異，分離、純化目標(biāo)多肽多聚體。作為模擬蛋白A,例如有mabSelect SuRE(GE Healthcare制)，但并不限于此。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明的制備方法或純化方法得到的多肽多聚體。而且，本發(fā)明還提供多肽多聚體，該多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，其中，第I多肽和第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。上述的多肽多聚體可以通過本說明書中記載的方法獲得。另外，上述的多肽多聚體的具體結(jié)構(gòu)或性質(zhì)如上所述。以下顯示其概要。本發(fā)明的多肽多聚體，與氨基酸修飾前相比，其與蛋白A的結(jié)合力發(fā)生變化。更具體而言，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方與蛋白A的結(jié)合力發(fā)生變化。本發(fā)明的多肽多聚體中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽與蛋白A的結(jié)合力、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。因此，在親和層析中，從蛋白A上洗脫第I多肽的溶劑的pH和從蛋白A上洗脫第2多肽的溶劑的pH不同。另外，第I多肽和/或第2多肽可以和一個或兩個第3多肽形成多聚體。因此，本發(fā)明涉及多肽多聚體，該多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽、以及一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽，其中，第I多肽和第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。上述的多肽多聚體也可以通過本說明書中記載的方法獲得。而且，上述多肽多聚體中可以包含第4多肽。第I多肽或第2多肽中的任一方可以與第3多肽形成多聚體，而另一方可以與第4多肽形成多聚體。因此，本發(fā)明涉及多肽多聚體，該多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽、具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽，其中，第I多肽和第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。上述的多肽多聚體也可以通過本說明書中記載的方法獲得。上述具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽可以包含抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列或抗體Fe區(qū)的氨基酸序列。作為抗體重鏈恒定區(qū)或抗體Fe區(qū)的氨基酸序列，可以列舉來自人IgG的恒定區(qū)的氨基酸序列，但并不限于此。上述具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽可以包含抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。具有抗原結(jié)合活性的多肽可以包含抗體可變區(qū)(例如OTR1XDR2XDR3、FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列)的氨基酸序列。
另外，上述具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽可以包含抗體重鏈的氨基酸序列或由抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的氨基酸序列。上述具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和具有抗原結(jié)合活性的第4多肽可以包含抗體輕鏈的氨基酸序列或由抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽多聚體可以是多特異性抗體。作為本發(fā)明中的多特異性抗體，可以列舉能夠與兩種抗原特異性結(jié)合的雙特異性抗體，但并不限于此。在本發(fā)明的多肽多聚體中，修飾一個或多個氨基酸殘基，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽與蛋白A的結(jié)合力、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同(產(chǎn)生差異)。作為修飾位點，如上所述，例如可以列舉抗體的Fe區(qū)或重鏈恒定區(qū)中的EU編號第250-255位的TLMISR、第308-317位的VLHQDWLNGK、第430-436位的 EALHNHY ;優(yōu)選第 250-254 位的 TLMIS、第 309-312 位的 LHQD、第 314-315 位的 LN、第430位的E、第432-436位的LHNHY ;進一步優(yōu)選第251-254位的LMIS、第309-311位的LHQ、第314位的L、第432-435位的LHNH ;特別是第252-254位的MIS、第309位的L、第311位的Q、第434-436位的NHY的氨基酸殘基，但并不限于這些。關(guān)于抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸的修飾，作為優(yōu)選的修飾位置，可以列舉FR1、⑶R2、FR3。更具體而言，作為本發(fā)明的多肽多聚體，可以列舉下述多肽多聚體，但并不限于此其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸或精氨酸；
在另一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基是不同于一方的多肽的氨基酸殘基。作為本發(fā)明的多肽多聚體，可以列舉下述多肽多聚體，但并不限于此其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽或具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸；
在另一方的多肽中，抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中EU編號第435位的氨基酸殘基為精氨酸。而且，作為本發(fā)明的包含第I多肽和第2多肽的多肽多聚體，可以例示以下的多肽多聚體，但并不限于這些。(I)多肽多聚體，其中包含包括下述氨基酸序列的第I多肽或第2多肽在來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成組氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列。作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含包括SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15記載的氨基酸序列的第I多肽或第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些。(2)多肽多聚體，其中包含包括下述氨基酸序列的第I多肽或第2多肽在來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)的氨基酸序列。
作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含包括SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:12記載的氨基酸序列的第I多肽或第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些。(3)多肽多聚體，其中包含包括下述氨基酸序列的第I多肽或第2多肽在來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列。作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含包括SEQ ID NO: 14記載的氨基酸序列的第I多肽或第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些。(4)多肽多聚體，其中包含下述多肽在第I多肽或第2多肽中的任一方的多肽中，包含來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成組氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列的多肽；以及在另一方的多肽中，包含在抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)的氨基酸序列的多肽。作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含第I多肽和第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些，其中，所述第I多肽包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15記載的氨基酸序列，所述第2多肽包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12記載的氨基酸序列。(5)多肽多聚體，其中包含下述多肽在第I多肽或第2多肽中的任一方的多肽中，包含來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成組氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列的多肽；以及在另一方的多肽中，包含抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列的多肽。作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含第I多肽和第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些，其中，所述第I多肽包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15記載的氨基酸序列，所述第2多肽包含SEQ ID NO: 14記載的氨基酸序列。(6)多肽多聚體，其中包含下述多肽在第I多肽或第2多肽的任一方的多肽中，包含來自人IgG的抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)的氨基酸序列的多肽；以及在另一方的多肽中，包含抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基分別被修飾成精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)的氨基酸序列的多肽。作為這樣的多肽多聚體，例如可以列舉包含第I多肽和第2多肽的多肽多聚體，但并不限于這些，其中，所述第I多肽包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12記載的氨基酸序列，所述第2多肽包含SEQ ID NO: 14記載的氨基酸序列。上述第I多肽和第2多肽可以進一步包含抗體重鏈可變區(qū)。另外，上述(I) (6)的多肽多聚體可以具有第3多肽和/或第4多肽。本發(fā)明還提供多肽突變體，該多肽突變體包含在EU編號第435位和第436位的氨基酸殘基中的任一方中存在突變的多肽。作為這樣的多肽突變體，可以列舉包含實施例中列舉的多肽的多肽突變體，但并不限于這些。 本發(fā)明還提供核酸，該核酸編碼構(gòu)成本發(fā)明的多肽多聚體的多肽(具有抗原結(jié)合活性的多肽)。本發(fā)明還提供擔(dān)載該核酸的載體。本發(fā)明還提供包含上述核酸或載體的宿主細(xì)胞。對該宿主細(xì)胞沒有特別限定，例如有大腸桿菌和各種植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞可以用作例如用于制備或表達本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的產(chǎn)生系統(tǒng)。用于制備多肽多聚體或多肽的產(chǎn)生系統(tǒng)包括體外(invitro)和體內(nèi)(in vivo)產(chǎn)生系統(tǒng)。體外產(chǎn)生系統(tǒng)例如有使用真核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)和使用原核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)?？捎米魉拗骷?xì)胞的真核細(xì)胞例如有動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞。動物細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞、例如 CHO(J. Exp. Med. (1995) 108 :945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤細(xì)胞、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa、Vero等；兩棲動物細(xì)胞、例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopuslaevis oocytes) (Valle 等人，Nature (1981) 291 :338-340)；以及昆蟲細(xì)胞、例如 Sf 9 >Sf21、Tn5。在本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的表達中適合使用CH0-DG44、CH0-DX11B、C0S7細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞。動物細(xì)胞中，以大量表達為目的時，特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。關(guān)于向宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入載體，例如可以通過以下方法來進行磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、使用陽離子脂質(zhì)體DOTAP (Boehringer Mannheim制)的方法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等。植物細(xì)胞例如有來源于煙草的細(xì)胞和浮萍(Lemna minor)，其作為蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)而眾所周知，利用愈傷組織培養(yǎng)該細(xì)胞的方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽多聚體或多肽。使用真菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)是公知的，這些真菌細(xì)胞可以用作產(chǎn)生本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的宿主，上述真菌細(xì)胞例如有酵母，例如酵母菌{Saccharomyces)屬的細(xì)胞(啤酒酵母、S3cchaTomycQS cereFisiae)、粟酒裂殖酵母{Saccharmyces pombe)等)；以及絲狀菌，例如曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)。使用原核細(xì)胞時，有使用細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為細(xì)菌細(xì)胞，已知除了使用上述大腸桿菌(B.colf)以外、還有使用枯草桿菌的產(chǎn)生系統(tǒng)，這些細(xì)菌細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽多聚體或多肽。使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生多肽多聚體或多肽時，可以培養(yǎng)經(jīng)表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞使多核苷酸表達，上述表達載體包含編碼本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的多核苷酸?？梢园凑展椒ㄟM行培養(yǎng)。例如，以動物細(xì)胞作為宿主時，例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640, MDM作為培養(yǎng)液。此時，可以并用FBS、胎牛血清(FCS)等血清補充液，也可以通過無血清培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)時的pH優(yōu)選為約6 8。通常是在約3(T40°C下培養(yǎng)約15 200小時，根據(jù)需要可以交換培養(yǎng)基或進行通氣、攪拌。
另一方面，作為在體內(nèi)產(chǎn)生多肽的系統(tǒng)例如有使用動物的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用植物的產(chǎn)生系統(tǒng)。向這些動物或植物中導(dǎo)入目標(biāo)多核苷酸，使在動物或植物的體內(nèi)產(chǎn)生多肽并回收。本發(fā)明中的“宿主”包括上述動物和植物。使用動物時，有使用哺乳動物和昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為哺乳動物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。另夕卜，使用哺乳動物時，可以使用轉(zhuǎn)基因動物。例如，制備編碼本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的多核苷酸，將其作為和山羊￠-酪素等乳汁中固有產(chǎn)生的編碼多肽的基因的融合基因。然后，將包括該融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，將該胚胎移植到雌山羊體內(nèi)。接受了胚胎的山羊生出轉(zhuǎn)基因山羊，從該轉(zhuǎn)基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中可以得到目標(biāo)抗體。為了使轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有抗體的乳汁量增加，可以給予上述轉(zhuǎn)基因山羊適當(dāng)?shù)募に?Ebert等人，Bio/Technology (1994) 12:699-702)。作為產(chǎn)生本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的昆蟲，例如可以使用蠶。使用蠶時，通過使 蠶感染插入有編碼目標(biāo)多肽多聚體或多肽的多核苷酸的桿狀病毒，可以從該蠶的體液中得到目標(biāo)多肽多聚體或多肽(Susumu等人，Nature (1985) 315 :592-4)。而且，將植物用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽多聚體或多肽時，例如可以使用煙草(tabacoo)。使用煙草時，將編碼目標(biāo)多肽多聚體或多肽的多核苷酸插入到植物表達用載體例如pMON 530中，再將該載體導(dǎo)入到根瘤土壤桿菌iAgrobacterium tumefaciens)等細(xì)菌中。用該細(xì)菌感染煙草例如煙草(Nicotiana,可以從該煙草的葉中得到所需的多肽多聚體或多肽(Ma等，Eur. J. Immunol. (1994) 24 :131-8)。另外，使同樣的細(xì)菌感染浮萍(Lemna minor),克隆化后可以從浮萍的細(xì)胞中得到所需的多肽多聚體或多肽(Cox KM等人.Nat. Biotechnol. 2006 Dec; 24(12) : 1591-1597)。如此操作而得到的多肽多聚體或多肽，可以將其從宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(培養(yǎng)基、乳汁等)分離，并純化成實質(zhì)上純粹且均勻的多肽多聚體或多肽。多肽多聚體或多肽的分離、純化可以使用普通多肽的純化中所使用的分離、純化方法，但沒有任何限制。例如，可以適當(dāng)選擇、組合層析柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、重結(jié)晶等來分離、純化抗體。作為層析，例如可以列舉親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization(蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南):A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshark 等人(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。上述層析可以使用液相層析、例如HPLC、FPLC等液相層析來進行。用于親合層析的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有Hyper D、P0R0S、Sepharose F. F. (Pharmacia 制)等，但并不限于這些。根據(jù)需要，可以在純化多肽多聚體或多肽之前或之后，使適當(dāng)?shù)牡鞍仔揎椕概c多肽多聚體或多肽作用，以任意地進行修飾或部分性地去除肽。作為蛋白修飾酶，例如使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。本發(fā)明的又一優(yōu)選方案為本發(fā)明的多肽多聚體或多肽的制備方法，該方法包括以下步驟按上述方式培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并自該細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物(藥物)，該藥物組合物包括本發(fā)明的多肽多聚體或多肽、以及醫(yī)藥上可接受的載體。在本發(fā)明中，藥物組合物通常是指用于疾病的治療或預(yù)防或者檢查、診斷的藥物。本發(fā)明的藥物組合物，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法制成制劑。例如，可以制成和水或水以外的藥學(xué)上可接受的液體的無菌溶液或懸浮液，以注射劑形式進行胃腸外給藥。例如，可以考慮和藥理學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)，具體而言，和滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味劑、賦形劑、媒介物(vehicle)、防腐劑、結(jié)合劑等適當(dāng)組合，以通常認(rèn)可的制藥實施所要求的單位用量形態(tài)進行混合以制成制劑。上述制劑中的有效成分量設(shè)定為得到所提示的范圍的適當(dāng)容量。用于注射的無菌組合物，可以使用注射用蒸餾水等媒介物，按照通常的制劑流程進行配制。作為注射用水溶液，例如可以列舉生理鹽水和等滲溶液，該等滲溶液中包含葡萄糖或其他輔藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉)。可以結(jié)合使用適當(dāng)?shù)闹軇?，例如?乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(吐溫80 (TM)、 HC0-50 等)。作為油性液體，有芝麻油、大豆油，可以結(jié)合使用苯甲酸芐酯和/或芐醇作為助溶齊Li。還可以和緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液)、緩和劑(soothing agents)(例如鹽酸普魯卡因)、穩(wěn)定劑(例如芐醇和苯酚)、抗氧化劑混合。制備的注射液通常填充在適當(dāng)?shù)陌瞗瓦中。本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選通過胃腸外給藥。例如，可以制成注射劑型、經(jīng)鼻給藥劑型、經(jīng)肺給藥劑型、經(jīng)皮給藥型的組合物。例如，可以通過靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等進行全身或局部給藥。給藥方法可以根據(jù)患者的年齡、癥狀而適當(dāng)選擇。含有多肽多聚體或多肽或編碼它們的多核苷酸的藥物組合物，其給藥量例如可以設(shè)定為每次每kg體重0. 0001 mg^lOOOmg的范圍。或者,給藥量可以是例如每位患者0. OOflOOOOO mg,但本發(fā)明未必限于上述數(shù)值。給藥量和給藥方法根據(jù)患者的體重、年齡、癥狀等而變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮上述條件，設(shè)定適當(dāng)?shù)慕o藥量和給藥方法。根據(jù)需要，還可以將本發(fā)明的多特異性抗體和其他藥物成分組合制成制劑。需要說明的是，本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻，均作為參照而納入本說明書。
實施例以下，利用實施例來更具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受這些實施例的限定?！笇嵤├?1抗體基因表汰載體的制作和各抗體的表汰
作為抗體H鏈可變區(qū)，使用下述H鏈可變區(qū)。Q153 (抗人F. IX抗體的H鏈可變區(qū)、SEQID NO: I)、Q407 (抗人F. IX抗體的H鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 2)、J142 (抗人F. X抗體的H鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 3)、J300(抗人F. X抗體的H鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 4)、MRA-VH(抗人白介素-6受體抗體的H鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 5)。作為抗體L鏈，使用下述L鏈。L180_k (抗人F. IX抗體/抗人F. X抗體共通L鏈、SEQ ID NO: 6)、L210-k(抗人F. IX抗體/抗人F. X抗體共通L鏈、SEQ ID NO: 7)、MRA_k(抗人白介素-6受體抗體的L鏈、SEQ ID NO: 8)。作為抗體H鏈恒定區(qū)，使用下述恒定區(qū)向IgG4中導(dǎo)入將EU編號第228位的Ser取代成Pro的突變、并除去C末端的Gly和Lys而構(gòu)建的G4d(SEQ ID NO: 9);向64(1中導(dǎo)入將EU編號第435位的His取代成Arg的突變、將EU編號第436位的Tyr取代成Phe的突變和將EU編號第445位的Leu取代成Pro的突變而構(gòu)建的z72 (SEQ ID NO: 10);向G4d中導(dǎo)入將EU編號第356位的Glu取代成Lys的突變而構(gòu)建的z7 (SEQ ID NO: 11);向272中導(dǎo)入將EU編號第439位的Lys取代成Glu的突變而構(gòu)建的z73 (SEQ ID NO: 12);向27中導(dǎo)入將EU編號第196位的Lys取代成Gln的突變、將EU編號第296位的Phe取代成Tyr的突變和將EU編號第409位的Arg取代成Lys的突變而構(gòu)建的zl06 (SEQ ID NO: 13)；向z73中導(dǎo)入將EU編號第196位的Lys取代成Gln的突變、將EU編號第296位的Phe取代成Tyr的突變、將EU編號第409位的Arg取代成Lys的突變和將EU編號第436位的Phe取代成Tyr的突變而構(gòu)建的zl07 (SEQ ID NO: 14);除去IgGl的C末端的Gly和Lys而構(gòu)建的Gld(SEQ ID NO: 15)。EU編號第356位的Glu取代成Lys的突變以及EU編號第439位的Lys取代成Glu的突變是用于在產(chǎn)生異源抗體時有效率地形成各H鏈的異源分子的 緣故((TO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY RE⑶LATION OFASSEMBLY)。通過將G4d或z7與Q153的下游連接，制作抗人F. IX抗體H鏈基因Q153_G4d或Q153-Z7。通過將zl06與Q407的下游連接，制作抗人F. IX抗體H鏈基因Q407_zl06。通過將G4d、z72或z73與J142的下游連接，制作抗人F. X抗體H鏈基因J142_G4d、J142-z72或J142-Z73。通過將zl07與J300的下游連接，制作抗人F. X抗體H鏈基因J300_zl07。通過將Gld、z 106或z 107與MRA-VH的下游連接，制作抗人白介素_6受體抗體H鏈基因MRA-GlcU MRA-z 106 或 MRA-z 107。將各抗體基因(Q153-G4d、Q153_z7、Q407_zl06、J142_G4d、J142_z72、J142_z73、J300-zl06、MRA-Gld、MRA-zl06、MRA-zl07、L180-k、L210-k、MRA-k)插入動物細(xì)胞表達載體中。使用制作的表達載體,通過將下述抗體轉(zhuǎn)染到FreeStyle293細(xì)胞(invitrogen)中，使其ー過性表達。將轉(zhuǎn)染的多個抗體基因排列后以抗體名的形式表記如下
MRA-Gld/MRA-k ；
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k ；
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k ；
Q153-G4d/J142-z72/L180-k ；
Q153-z7/J142-z73/L180-k ；
Q407-Z106/J300-Z107/L210-k。[實施例2]蛋白A親和層析的洗脫條件的研究
使 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 和 Q153-G4d/J142-z72/L180_k —過性表達，以得到的FreeStyle293細(xì)胞培養(yǎng)液(以下簡記為CM)作為試樣，研究蛋白A親和層析的洗脫條件。將用小0. 22 u m的濾器過濾的CM負(fù)載到用D-PBS平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)上，階段性地實施表I所示的清洗I、清洗2、洗脫I 5。調(diào)節(jié)CM的負(fù)載量，使柱上負(fù)載的抗體量達到20mg/mL樹脂(resine)。分離收集各條件的洗脫組分，通過陽離子交換層析分析鑒定各洗脫組分中所含的成分。對照中使用以下試樣將各CM負(fù)載到rProtein G Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)上，通過分批洗脫而純化的試樣。由于蛋白G與抗體的Fab部分結(jié)合，因此通過使用蛋白G，可以與蛋白A的親和性無關(guān)地純化CM中存在的所有抗體(兩種目標(biāo)H鏈發(fā)生異源締合化而構(gòu)建的雙特異性抗體(異源抗體)、以及雜質(zhì)的ー種H鏈發(fā)生同源締合化而構(gòu)建的單特異性同源抗體)。[表 I]
—雨...........................................I.....D-Pis..................................................................................................................................................I
清洗 II 400mM Arg-11C1/D-PBS|
清洗2丨20mMi持+樣酸納* pH5.0|
洗脫I丨20iiiM檸樣酸鈉，pH4.0I
洗脫2丨MmIVI檸樣酸#I pi 13.8I
洗脫:！丨20mM檸嫁酸鈉..pH3,6I
洗HC 4.............................................丨 2imM.檸豫酸.鈉:..........— I
ItfKsI IQrnMWmm, pH3.2I
對表達 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 和 Q153-G4d/J142-z72/L180_k 的 CM 的蛋白 A 柱的各洗脫組分(洗脫I 5)進行陽離子交換層析分析。判明隨著由洗脫I組分變?yōu)橄疵?組分、即隨著洗脫中所用溶劑的pH的降低，Q153-G4d/J142-G4d/L180-k的各組分中所含的抗體成分由同源抗體J142-G4d/L180-k變?yōu)楫愒纯贵wQ153-G4d/J142-G4d/L180-k、以及同源抗體Q153-G4d/L180-k的順序。認(rèn)為洗脫順序取決于與蛋白A的結(jié)合力的強弱。SP，與在高PH下洗脫的同源體J142-G4d/L180-k (抗FX的同源抗體)相比，直至達到低pH均保持結(jié)合狀態(tài)不變的同源抗體Q153-G4d/L180-k與蛋白A的結(jié)合力強。明確了可變區(qū)J142是不與蛋白A結(jié)合的序列。即，同源體J142-G4d/L180-k (抗FX的同源抗體)與蛋白A的結(jié)合位點為兩個、異源抗體Q153-G4d/J142-G4d/L180-k與蛋白A的結(jié)合位點為3個、同源抗體Q153-G4d/L180-k (抗FIX的同源抗體)與蛋白A的結(jié)合位點為4個。因此判明與蛋白A的結(jié)合位點數(shù)越多，與蛋白A的結(jié)合就越強，洗脫所必需的pH越低。另ー方面，判明在Q153-G4d/J142-z72/L180-k中，隨著由洗脫I組分變?yōu)橄疵?組分，各組分中所含的抗體成分變?yōu)楫愒纯贵wQ153-G4d/J142-z72/L180-k、其后為同源抗體Q153-G4d/L180-k的順序。由于在各洗脫組分中幾乎沒有檢測到同源抗體J142_z72/L180-k(抗FX的同源抗體)，因此暗示其缺乏與蛋白A結(jié)合的能力。認(rèn)為是由于導(dǎo)入到J142-Z72中的將EU編號第435位的His取代成Arg的突變，所以才變成不與蛋白A結(jié)合。同源抗體J142-z72/L180-k (抗FX的同源抗體)不具有與蛋白A結(jié)合的位點，異源抗體Q153-G4d/J142-z72/L180-k有兩個與蛋白A結(jié)合的位點，同源抗體Q153-G4d/L180_k(抗FIX的同源抗體)有4個與蛋白A結(jié)合的位點。由于同源抗體J142-z72/L180-k (抗FX的同源抗體)不與蛋白A結(jié)合，因此在各洗脫組分中沒有檢測到同源抗體J142-z72/L180-k。還暗示Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 和 Q153-G4d/J142-z72/L180_k 均可在 pH3. 6 及其以下的pH下分離異源抗體和同源抗體Q153-G4d /L180_k (抗FIX的同源抗體)的可能性?！笇嵤├?1利用蛋白A層析進行異源抗體的分離純化使用以下所示的抗體的CM作為試樣
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k ；
Q153-G4d/J142-z72/L180-k ；
Q153-z7/J142-z73/L180-k ；
Q407-Z106/J300-Z107/L210-k。將用0. 22 ii m的濾器過濾的CM負(fù)載到用D-PBS平衡的rProtein A SepharoseFast Flow柱(GE Healthcare)上，實施表2所示的清洗I、清洗2、洗脫I、洗脫2 (對Q407-Z106/J300-Z107/L210-k只實施洗脫I)。洗脫條件以實施例2的結(jié)果為參考。調(diào)節(jié)CM的負(fù)載量，使負(fù)載的抗體量達到20mg/mL樹脂。分離收集各條件的洗脫組分，通過陽離子交換層析分析，鑒定各洗脫組分中所含的成分。在對照中，與實施例2同樣，使用將各CM負(fù) 載到rProtein G Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)上、并進行分批洗脫而純化的試樣。[表2]
j—軍..麗...............................................dp!s..................................................................................................................................................
清洗 j'MmM Arg-HCI/D-PBS
清洗220mM轉(zhuǎn)濛酸鈉，pH5.0
洗脫 I20mM 檸懞fll#], pH31i
./先脫 2. 20mM 4￥礞觀鈉，pH2.7 _
各洗脫組分的陽離子交換層析分析的結(jié)果見以下的表3。以百分比表示洗脫峰的面積值。在Q153-G4d/J142-G4d/L180-k以外的抗體中，在所有洗脫組分中幾乎都沒有檢測到抗FX的同源抗體。判明不僅實施例2中所示的同源抗體J142-z72(抗FX的同源抗體)、就連同源抗體J142-Z73和J300-zl07(抗FX的同源抗體)也變得不與蛋白A結(jié)合。認(rèn)為這是由于通過導(dǎo)入到抗FX抗體的H鏈恒定區(qū)中的將EU編號第435位的His取代成Arg的突變，在抗FX的同源抗體中與蛋白A的結(jié)合性消失的緣故。作為目標(biāo)雙特異性抗體的異源抗體大部分是在洗脫I組分中檢測到的，在洗脫I組分中也檢測到微量的抗FIX的同源抗體，但大部分的抗FIX的同源抗體通過洗脫2洗脫。與Q153-G4d/J142-z72/L180-k相比，在 Q153-z7/J142-z73/L180-k 和 Q407-zl06/J300-zl07/L210_k 中，pH3. 6 洗脫組分的目標(biāo)雙特異性抗體即異源抗體的比例大幅増加。由此可知除了導(dǎo)入將EU編號第435位的His取代成Arg的突變外，還導(dǎo)入用于有效率地形成各H鏈的異源分子的將EU編號第356位的Glu取代成Lys的突變和將EU編號第439位的Lys取代成Glu的突變，從而只通過蛋白A純化步驟，即可以98%以上的純度純化作為目標(biāo)雙特異性抗體的異源抗體。由以上的結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用同源抗體與異源抗體的蛋白A結(jié)合位點數(shù)之差，通過只利用蛋白A層析步驟，即可高純度且有效率地分離純化異源抗體。[表3]
權(quán)利要求
1.多肽多聚體的制備方法，所述多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，該方法包括 (a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及 (b)回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟， 其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差巳
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟(b)中，利用蛋白A親和層析來回收表達產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的溶劑的pH、和從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的溶劑的pH產(chǎn)生差異。
4.權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方與蛋白A的結(jié)合力增強或降低。
5.權(quán)利要求I 4中任一項所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中的任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增強、使另一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低。
6.權(quán)利要求I 5中任一項所述的方法，其中，回收的多肽多聚體的純度為95%以上。
7.權(quán)利要求I 6中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中，選自抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少一個氨基酸殘基被修飾。
9.權(quán)利要求I 8中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，在抗體重鏈可變區(qū)的FR1、⑶R2和FR3的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被修飾。
11.權(quán)利要求I 10中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體包含一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，多肽多聚體進一步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中有至少ー個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求I 15中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體為多特異性抗體。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。
18.權(quán)利要求I 8中任一項所述的方法，其中包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體Fe區(qū)的氨基酸序列，不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求7 18中任一項所述的方法，其中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人 IgG0
20.多肽多聚體，該多肽多聚體是通過權(quán)利要求I 19中任一項所述的方法制備的。
21.多肽多聚體的純化方法，所述多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，該方法包括 (a)使編碼具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的DNA、和編碼具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的DNA表達的步驟；以及 (b)通過蛋白A親和層析回收步驟(a)的表達產(chǎn)物的步驟， 其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的雙方或任一方中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力產(chǎn)生差巳升。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力增強或降低。
23.權(quán)利要求20或21所述的方法，其中，在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中有一個或多個氨基酸殘基被修飾，使具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽中任一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力增強、使另一方的多肽與蛋白A的結(jié)合力降低。
24.權(quán)利要求21 23中任一項所述的方法，其中，回收的多肽多聚體的純度為95%以上。
25.權(quán)利要求21 24中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中，選自抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少ー個氨基酸殘基被修飾。
27.權(quán)利要求21 26中任一項所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中，在抗體重鏈可變區(qū)的FR1XDR2和FR3的氨基酸序列中有至少ー個氨基酸殘基被修飾。
29.權(quán)利要求21 28中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體包含ー個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第3多肽的DNA表達。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求29或30所述的方法，其中，多肽多聚體進ー步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽，步驟(a)包括使編碼該具有抗原結(jié)合活性的第4多肽的DNA表達。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中有至少ー個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求21 33中任一項所述的方法，其中，多肽多聚體為多特異性抗體。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。
36.權(quán)利要求25 35中任一項所述的方法，其中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人IgG。
37.多肽多聚體，該多肽多聚體包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽， 其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽與蛋白A的結(jié)合力不同。
38.權(quán)利要求37所述的多肽多聚體，其中，從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性的第I多肽的溶劑的pH、和從蛋白A上洗脫具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的溶劑的PH不同。
39.權(quán)利要求37或38所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列， 在該抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中選自EU編號第250 255位、第308 317位和第430 436位的至少ー個氨基酸殘基被修飾。
40.權(quán)利要求37 39中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列， 在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸或精氨酸， 在另一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基是與一方的多肽不同的氨基酸殘基。
41.權(quán)利要求37 40中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列， 在具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、或者具有抗原結(jié)合活性或不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽的任一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為組氨酸， 在另一方的多肽中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列中的EU編號第435位的氨基酸殘基為精氨酸。
42.權(quán)利要求37 41中任一項所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列， 在該重鏈可變區(qū)的FR1、⑶R2和FR3的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被修飾。
43.權(quán)利要求37 42中任一項所述的多肽多聚體，其中，多肽多聚體進一步包含一個或兩個具有抗原結(jié)合活性的第3多肽。
44.權(quán)利要求43所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
45.權(quán)利要求43或44所述的多肽多聚體，其中，多肽多聚體進一步包含具有抗原結(jié)合活性的第4多肽。
46.權(quán)利要求45所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽和第4多肽中的至少一個多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
47.權(quán)利要求45所述的多肽多聚體，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體重鏈的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第3多肽包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，具有抗原結(jié)合活性的第4多肽包含抗體輕鏈的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求37 47中任一項所述的多肽多聚體，該多肽多聚體為多特異性抗體。
49.權(quán)利要求48所述的多肽多聚體，其中，多特異性抗體為雙特異性抗體。
50.權(quán)利要求37 41中任一項所述的多肽多聚體，其中包含具有抗原結(jié)合活性的第I多肽、和不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽，其中，具有抗原結(jié)合活性的第I多肽包含受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體Fe區(qū)的氨基酸序列，不具有抗原結(jié)合活性的第2多肽包含抗體Fe區(qū)的氨基酸序列。
51.權(quán)利要求39 50中任一項所述的多肽多聚體，其中，抗體Fe區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)來源于人IgG。
52.核酸，該核酸編碼構(gòu)成權(quán)利要求20、37 51中任一項所述的多肽多聚體的多肽。
53.載體，該載體插入有權(quán)利要求52所述的核酸。
54.細(xì)胞，該細(xì)胞包含權(quán)利要求52所述的核酸或權(quán)利要求53所述的載體。
55.藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求20、37 51中任一項所述的多肽多聚體作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供通過改變與蛋白A的結(jié)合力，只通過蛋白A純化步驟高純度且有效率地純化或制備與兩種以上的抗原具有結(jié)合活性的多特異性抗體的方法。本發(fā)明的多特異性抗體的純化或制備方法的特征在于修飾抗體重鏈恒定區(qū)和/或抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基。通過向抗體中導(dǎo)入本發(fā)明的氨基酸的修飾，可以高純度且有效率地獲得與蛋白A的結(jié)合力發(fā)生改變、且與人IgG1具有同等以上的血漿中滯留性的多特異性抗體。
文檔編號C07K1/22GK102770537SQ20108006477
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者三瓶全次郎, 井川智之, 伊藤繪里子, 若林哲也 申請人:中外制藥株式會社