專利名稱：純化多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，及包含通過(guò)該方法純化的多肽的制劑。
背景技術(shù)：
多肽的大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)純化是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)越來(lái)越重要的問(wèn)題。通常，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或細(xì)菌細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生多肽，該細(xì)胞系通過(guò)插入包含該多肽的基因的 重組質(zhì)粒改造為產(chǎn)生目的多肽。由于所使用的細(xì)胞系是活生物，必須用包含糖類、氨基酸和生長(zhǎng)因子(通常從動(dòng)物血清的制劑供給)的復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基飼養(yǎng)它們。希望從飼喂給細(xì)胞的化合物的混合物及從細(xì)胞自身的副產(chǎn)物分離目的多肽。通常嘗試用不同層析技術(shù)的組合來(lái)從細(xì)胞產(chǎn)生的其他產(chǎn)物分離目的多肽。這些技術(shù)根據(jù)它們的電荷、疏水性程度、大小或目的多肽與固定化捕獲劑之間的特異性相互作用來(lái)分開(kāi)多肽的混合物。對(duì)于這些技術(shù)中的每一種，可獲得幾種不同的層析樹(shù)脂，允許根據(jù)所涉及的具體多肽精確調(diào)整純化方案。這些分離方法中的每一種的本質(zhì)是，可以使多肽或者以不同的速率沿長(zhǎng)柱向下移動(dòng)，達(dá)到隨著它們進(jìn)一步沿柱下移而提高的物理分離，或者選擇性黏附于分離介質(zhì)，然后通過(guò)不同溶劑差異洗脫。在一些情況下，在雜質(zhì)特異性黏附于柱而目的多肽不黏附于柱時(shí)，從雜質(zhì)分離目的多肽，即，目的多肽存在于“流穿液(flow-through) ” 中。大規(guī)模、低成本純化多肽至足以用作人用藥物的純度仍是巨大挑戰(zhàn)。發(fā)明概述本文提供用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，其中，該方法包括(i)或(ii) (i) (a)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將該組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上和(b)將從該陽(yáng)離子交換材料回收的組合物加樣至混合型材料上的順次步驟；或(ii) (a)將該組合物加樣至混合型材料上和(b)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將從混合型材料回收的組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上的順次步驟。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該多肽具有約6和約10之間的pi。在一些實(shí)施方案中，該多肽具有約7和約9之間的pi。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該多肽是抗體或免疫黏附素。在一些實(shí)施方案中，該多肽是免疫黏附素。在一些實(shí)施方案中，該多肽是抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，該單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實(shí)施方案中，該單克隆抗體是IgG單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合片段選自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和雙抗體。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該至少一種污染物是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、浸出(leached)的A蛋白、DNA、聚集蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基成分、慶大霉素和病毒污染物中的任意一種或多種在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，(i)和/或(ii)中的順次步驟是連續(xù)的。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，(i)和/或(ii)中的順次步驟是不連續(xù)的。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法是(i)。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法是(ii)。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該加樣密度在約150g/L和約2000g/L之間。在一些實(shí)施方案中，該密度在約150g/L和約1000g/L之間。在一些實(shí)施方案中，該密度在約500g/L和約700g/L之間。
在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料包含羧酸官能團(tuán)或磺酸官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，該官能團(tuán)是磺丙基、磺乙基、磺異丁基或羧基。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料是膜、monolith或樹(shù)脂顆粒。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料是樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料是Mustang S、Sartobind S、S03 Monolith、SCeramic HyperD、Poros HS50、Poros HS20、橫丙基-Sepharose FastFlow (SPSFF) > SP-Sepharose XL (SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、CaptoS、Fractogel SeHiCap、Fractogel S03或Fractogel COO。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料是PorosHS50。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該混合型材料包含能夠進(jìn)行陰離子交換和疏水作用的官能團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，該混合型材料是Capto-Adhere樹(shù)脂、MEP HyperCel樹(shù)脂、HEA HyperCel樹(shù)脂、PPAHyperCeI樹(shù)脂或ChromaSorb膜。在一些實(shí)施方案中，該混合型材料是Capto-Adhere樹(shù)脂。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法包括隨同該陽(yáng)離子交換材料和/或陰離子交換材料使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液，且該平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的電導(dǎo)率在約2mS/cm至約25mS/cm之間。在一些實(shí)施方案中，該平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的電導(dǎo)率在約3mS/cm至約8mS/cm之間。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法包括隨同該陽(yáng)離子交換材料和/或陰離子交換材料使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液，且該平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的PH在約4. 5和約6. 5之間。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，隨同該陽(yáng)離子交換材料和/或陰離子交換材料的平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液是相同的。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，隨同該陽(yáng)離子交換材料和/或陰離子交換材料的平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液是不同的。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使包含該多肽的組合物在步驟(a)和(b)之前或之后經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)其他純化步驟。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括回收該純化的多肽。在該方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該純化的多肽與可藥用載體組合。附圖簡(jiǎn)述
圖 IA-D 顯示用 Poros HS50、SPSFF, S03Monolith 和 Mustang S 純化抗-CDlla 抗體的層析譜。圖2 顯示用 SPSFF、Poros HS50、Mustang S 和 S03monolith 收集不同量的包含抗-CDlla抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的C/CQ (Mab ( “單體抗體”)濃度)和C/C。(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢蛋白質(zhì)(“CHOP”)濃度)。C是所收集的級(jí)分中Mab或CHOP的濃度，C0是加樣物(load)中Mab或CHOP的濃度。圖3 顯示用 S03monolith、Mustang S、SPSFF 和 Poros HS50 收集不同量的包含抗-CDlla抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的C/CQ(Mab濃度)和C/CQ(高分子量(“HMW”)濃度)。C是所收集的級(jí)分中Mab或HMW的百分比，C0是加樣物中Mab或HMW的百分比。圖4A-D 顯示用 S03monolith、Mustang S、SPSFF 和 Poros HS50 收集不同量的包含抗-CDl Ia抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的C/Q (Mab濃度)、C/C0 (HMW1濃度)和C/Q (HMW2濃度)。
圖5A顯示用Poros HS50加樣的包含抗-⑶Ila抗體的產(chǎn)物中HMW和Mab的層析譜；圖5B顯示使用Poros HS50的洗脫混合物(pool)中HMW和Mab的層析譜(內(nèi)部圖顯示峰的擴(kuò)大部分)；圖5C顯示用Poros HS50收集不同量的包含抗-⑶Ila抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的流穿(“FT”)混合物中的累積HMW^^PFT級(jí)分中的HMW%。圖6A顯示用SPSFF柱收集不同量的包含抗-⑶Ila抗體的產(chǎn)物的FT混合物的層析譜；圖6B顯示用SPSFF收集不同量的包含抗-⑶Ila抗體的產(chǎn)物(mg/mL CV)的FT混合物中的累積_%和FT級(jí)分中的HMW% ;圖6C顯示用SPSFF收集不同量的包含抗-⑶Ila抗體的產(chǎn)物(mg/mL)的HMW%。圖 7A-D 顯示用 Poros HS50、SPSFF、S03Monolith 和 Mustang S 純化抗-VEGF 抗體的層析譜。圖8 顯示用 Poros HS50、Mustang S、S03 monolith 和 SPSFF 加樣不同量的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的抗-VEGF抗體的C/CQ (Mab濃度)。圖 9 顯不用 SPSFF、Sartobind S> Poros HS50> Mustang S 和 SO3Iiionolith 收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的C/C^CHOP濃度)。

圖10 顯示用 SPSFF、Poros HS50、Mustang S 和 S03monolith 收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的DNA的量(pg/mg)。圖 11 顯示用 SPSFF、Sartobind S、具有稀釋 Mab 的 Poros HS50、Poros HS50、MustangS和S03monolith收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/L CV或MV)的C/C。(HMW 濃度)。圖12 顯示用 SPSFF、具有稀釋 Mab 的 Poros HS50、Poros HS50、Mustang S 和S03monoIith收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/LCV或MV)的C/Q (HMW1濃度)和C/QXHMW2 濃度)。圖13A-E顯示在多種pH和鹽濃度下使用包含抗-⑶20抗體的產(chǎn)物的結(jié)合于樹(shù)脂(Poros HS50.SE HiCap、SPSFF、SPXL 和 Capto S)的％ HMW。圖14A-E顯示在多種pH和鹽濃度下使用包含抗-⑶20抗體的產(chǎn)物的結(jié)合于樹(shù)脂(Poros HS50.SE HiCap、SPSFF、SPXL 和 Capto S)的％ CHOP。圖15顯示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的 C/CQ(HMW 濃度 ％ )。圖16顯示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的累積 HMW(% )。圖17顯示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的 C/C^CHOP 濃度)。圖18顯示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的累積 CHOP (ppm)。圖19A-B顯示在多種流速下用SPSFF純化抗-VEGF抗體的在280nm獲得的UV跡線對(duì)運(yùn)行時(shí)間(圖19A)和對(duì)產(chǎn)物加樣體積(圖19B)作圖的層析譜。圖20顯示在多種流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(mg/mLCV)的 C/CQ (Mab 濃度)和 C/CQ (CHOP 濃度)。 圖21顯示在多種流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/mLCV)的 DNA 的量(pg/mg)。圖22顯示在多種流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/LCV)的 C/C^HMW 濃度)。圖23顯示在多種流速下用Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的 C/C0 (HMW 濃度(％ ))、C/C0 (CHOP 濃度(ppm))和 DNA 的量(pg/mg)。圖24顯示在多種加樣電導(dǎo)率下用Poros HS50純化抗-VEGF抗體的層析譜。圖25A-B顯不使用在多種加樣電導(dǎo)率下加樣包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物的PorosHS50的來(lái)自洗脫的洗脫物(Pl峰)和來(lái)自清洗的洗脫物(P2峰)的層析譜。圖26顯示在多種加樣電導(dǎo)率下用Poros HS50純化抗-VEGF抗體的加樣不同量的CHOP (ug/mL CV)的級(jí)分中 CHOP 的量(ppm)。圖27顯示在多種加樣電導(dǎo)率下用Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(mg/mL CV)的 C/CQ (HMW 濃度)。圖28A-B顯示在多種加樣電導(dǎo)率和多種流速下收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物((g/L CV)的DNA的量(pg/ml)(不同加樣電導(dǎo)率的加樣物中不同量的DNA(pg/mg))。圖29顯示用線性鹽梯度洗脫物洗脫的Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗體的產(chǎn)物(mg/mL CV)的DNA的量(pg/mL)和抗體濃度。圖30顯示用柱床高度為4. 6cm或14. 2cm的Poros HS50的加樣不同量的包含抗-VEGF 抗體的產(chǎn)物(g/L CV)的 C/C0 (HMW 濃度(％ ))、C/C0 (CHOP 濃度(ppm))和 DNA 的量(pg/mg)。圖31A-F顯示在多種pH和電導(dǎo)率(用NaAC或甘氨酸HCl作為緩沖鹽)下使用Capto Adhere樹(shù)脂的抗-VEGF抗體(FT級(jí)分中)、抗-⑶Ila抗體和抗-⑶20抗體的％ Mab回收。圖32A-F顯示在多種pH和電導(dǎo)率(用NaAC或甘氨酸HCl作為緩沖鹽)下將CaptoAdhere樹(shù)脂用于抗-VEGF抗體、抗-⑶IIa抗體和抗-⑶20抗體的％ HMW結(jié)合。圖33A-F顯示在多種pH和電導(dǎo)率(用NaAC或甘氨酸HCl作為緩沖鹽)下將CaptoAdhere樹(shù)脂用于抗-VEGF抗體、抗-⑶IIa抗體和抗-⑶20抗體的％ CHOP結(jié)合。圖34顯示用偶聯(lián)的Capto Adhere柱和Poros HS50柱純化抗-QHla抗體的層析P曰。發(fā)明詳述I.定義術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”意指氨基酸的序列，其鏈長(zhǎng)足以產(chǎn)生更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，蛋白質(zhì)區(qū)別于“肽”，肽也 是基于氨基酸的分子，但不具有這種結(jié)構(gòu)。通常，本文使用的蛋白質(zhì)將具有至少約5-20kD、備選地至少約15-20kD、優(yōu)選至少約20kD的分子量。“肽”意指氨基酸的序列，其通常不顯示更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。肽通常具有小于約5kD的分子量。包含于本文的定義之內(nèi)的多肽的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，如，例如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；月旨蛋白；α -I-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VII 1C、因子IX、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C ;心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和;腦啡月太酶；RANTES(regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，如內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6 (NT_3、NT_4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子，如NGF-b ;血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如aFGF和bFGF;表皮生長(zhǎng)因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β I、丁6卩-3 2、16卩-3 3、16卩-3 4或了6卩-3 5;胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和-11(16卩-1和IGF-II);消(1-3)-IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、⑶19和⑶20 ;促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素，如干擾素-a、- β和-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，如⑶11a、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原，如 CA125 (卵巢癌抗原)或 HER2、HER3或HER4受體；免疫黏附素；上列蛋白質(zhì)中任一種的片段和/或變體；以及與包括例如上列蛋白質(zhì)中任一種的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，包括抗體片段。“純化的”多肽(例如抗體)意指多肽的純度已提高，使得它以比它在自然環(huán)境中存在和/或最初在實(shí)驗(yàn)室條件下合成和/或擴(kuò)增時(shí)更純的形式存在。純度是相對(duì)值，并非必然意指絕對(duì)純度。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“表位標(biāo)記的”指包含與“標(biāo)記多肽”融合的多肽的嵌合多肽。標(biāo)記多肽具有足夠的殘基來(lái)提供可以針對(duì)其制備抗體的表位，但也足夠短，使得它不干擾與之融合的多肽的活性。還優(yōu)選標(biāo)記多肽相當(dāng)獨(dú)特，使得該抗體基本上不與其他表位交叉反應(yīng)。適宜的標(biāo)記多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，且通常在約8個(gè)和50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選地，在約10個(gè)和20個(gè)氨基酸殘基之間)。
為了本文的目的，“活性的”或“活性”指多肽的一種或多種形式，其保持天然或天然存在的多肽的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性，其中，“生物學(xué)”活性指由天然或天然存在的多肽引起的生物學(xué)功能(抑制或刺激)，其不同于誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗體的能力，“免疫學(xué)”活性指誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗體的能力。術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”以最廣泛的含義使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天然多肽的生物學(xué)活性的任意分子。類似地，術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”以最廣泛的含義使用，且包括模擬天然多肽的生物學(xué)活性的任意分子。適宜的激動(dòng)劑或拮抗劑分子明確包括激動(dòng)劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體等。用于鑒定多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的方法可以包括使多肽與候選激動(dòng)劑或拮抗劑分子接觸，并測(cè)量通常與該多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的可檢測(cè)的變化?！耙蕾囇a(bǔ)體的細(xì)胞毒性”或“CDC”指分子在補(bǔ)體的存在下裂解靶標(biāo)的能力。通過(guò)補(bǔ)·體系統(tǒng)的第一成分(Clq)與復(fù)合關(guān)聯(lián)抗原的分子(例如多肽(例如抗體))的結(jié)合來(lái)起始補(bǔ)體激活途徑。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods202 :163(1996)中所述的CDC測(cè)定。“結(jié)合”目的抗原(例如腫瘤相關(guān)多肽抗原靶標(biāo))的多肽是這樣的多肽，其以足夠的親和力結(jié)合該抗原，使得該多肽可用作靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織的診斷劑和/或治療劑，且不顯著與其他多肽交叉反應(yīng)。在這類實(shí)施方案中，如通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)測(cè)定，該多肽與“非靶標(biāo)”多肽的結(jié)合程度小于該多肽與它的具體靶標(biāo)多肽的結(jié)合的約10%。對(duì)于多肽與靶分子的結(jié)合，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合至”特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位或?qū)μ囟ǘ嚯幕蛱囟ǘ嚯陌袠?biāo)上的表位“特異”意指顯著不同于非特異性相互作用的結(jié)合?？梢岳缗c對(duì)照分子的結(jié)合比較，通過(guò)測(cè)定分子的結(jié)合來(lái)測(cè)量特異性結(jié)合，該對(duì)照分子通常是不具有結(jié)合活性的具有相似結(jié)構(gòu)的分子。例如，可以通過(guò)與類似于靶標(biāo)的對(duì)照分子(例如過(guò)量的非標(biāo)記靶標(biāo))競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果過(guò)量的未標(biāo)記靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性抑制標(biāo)記靶標(biāo)與探針的結(jié)合，則指示特異性結(jié)合?！耙种颇[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)”的多肽或“生長(zhǎng)抑制性”多肽是導(dǎo)致癌細(xì)胞的可測(cè)量的生長(zhǎng)抑制的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中約O. I至約30μ g/ml或約O. 5nM至約200nM的多肽濃度下測(cè)量生長(zhǎng)抑制，其中，在腫瘤細(xì)胞暴露于該多肽1-10天后測(cè)定該生長(zhǎng)抑制。如果按約I μ g/kg至約100mg/kg體重施用多肽導(dǎo)致腫瘤大小或腫瘤細(xì)胞增殖在首次施用該多肽后約5天至約3個(gè)月內(nèi)、優(yōu)選約5天至約30天內(nèi)降低，則該多肽在體內(nèi)是生長(zhǎng)抑制性的?！罢T導(dǎo)凋亡”的多肽是誘導(dǎo)通過(guò)膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合、DNA的斷裂、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨脹、細(xì)胞破碎和/或膜小泡(稱為凋亡小體)的形成測(cè)定的程序性細(xì)胞死亡的多肽。優(yōu)選地，該細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如前列腺細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胃細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、膀胱細(xì)胞?？捎枚喾N方法來(lái)評(píng)價(jià)與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，可以通過(guò)膜聯(lián)蛋白結(jié)合來(lái)測(cè)量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可以通過(guò)DNA斷裂成梯來(lái)評(píng)價(jià)DNA斷裂；可以通過(guò)亞二倍體細(xì)胞的任意增加來(lái)評(píng)價(jià)核/染色質(zhì)凝聚以及DNA斷裂。優(yōu)選地，誘導(dǎo)凋亡的多肽是這樣的多肽，在膜聯(lián)蛋白結(jié)合測(cè)定中，相對(duì)于未處理的細(xì)胞，該多肽導(dǎo)致約2至約50倍、優(yōu)選約5至約50倍和最優(yōu)選約10至約50倍的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導(dǎo)?！罢T導(dǎo)細(xì)胞死亡”的多肽是使活細(xì)胞變得不能存活的多肽。優(yōu)選地，該細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如乳腺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胃細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、唾液腺細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、胰腺細(xì)胞或膀胱細(xì)胞?？梢栽谌狈ρa(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下測(cè)定體外細(xì)胞死亡來(lái)區(qū)分由抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，可以用熱失活的血清(即，在缺乏補(bǔ)體的情況下)在缺乏免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行細(xì)胞死亡的測(cè)定。為了確定多肽是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可以相對(duì)于未處理的細(xì)胞評(píng)估通過(guò)碘化丙碇(PI)、臺(tái)盼藍(lán)(見(jiàn)Moore等Cytotechnology 17 1-11(1995))或7AAD的攝取評(píng)價(jià)的膜完整性的喪失。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用，且明確涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、形成自至少兩種完整抗體的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示希望的生物學(xué)活性。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可以與抗體互換使用。 抗體是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有全都基于免疫球蛋白折疊的不同結(jié)構(gòu)。例如，IgG抗體具有通過(guò)二硫鍵結(jié)合形成功能性抗體的兩條“重”鏈和兩條“輕”鏈。每條重鏈和輕鏈本身包含“恒定”(C)區(qū)和“可變”(V)區(qū)。V區(qū)決定抗體的抗原結(jié)合特異性，而C區(qū)提供結(jié)構(gòu)支持，并在與免疫效應(yīng)物的非抗原特異性相互作用中發(fā)揮作用?？贵w或抗體的抗原結(jié)合片段的抗原結(jié)合特異性是抗體特異性結(jié)合特定抗原的能力?？贵w的抗原結(jié)合特異性由V區(qū)的結(jié)構(gòu)特征決定?？勺冃圆⒎窃诳勺兘Y(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸的跨度內(nèi)均勻分布。相反，V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的相對(duì)不變的序列組成，該序列由長(zhǎng)度各為9-12個(gè)氨基酸的稱為“高變區(qū)”的極端可變的較短區(qū)域分隔開(kāi)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含四個(gè)FR，四個(gè)FR主要采用β-折疊構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，該高變區(qū)形成連接β_折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在一些情況下形成β_折疊結(jié)構(gòu)的部分。各鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR近距離保持在一起，并與來(lái)自其他鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合部位的形成(見(jiàn)Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版 Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda,Md. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)子功能，如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)中的參與。每個(gè)V區(qū)通常包含3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(“⑶R”，其中每個(gè)⑶R包含“高變環(huán)”)和4個(gè)構(gòu)架區(qū)。因此，抗體結(jié)合部位(以實(shí)質(zhì)性親和力結(jié)合具體希望的抗原所需的最小結(jié)構(gòu)單位)通常將包含3個(gè)CDR及散布其間來(lái)支持并以適當(dāng)?shù)臉?gòu)象呈遞CDR的至少3個(gè)、優(yōu)選4個(gè)構(gòu)架區(qū)。經(jīng)典的四鏈抗體具有通過(guò)相互協(xié)作的V1^P'結(jié)構(gòu)域定義的抗原結(jié)合部位。某些抗體(如駱駝抗體和鯊魚(yú)抗體)缺乏輕鏈，依賴于僅由重鏈形成的結(jié)合部位。可以制備單結(jié)構(gòu)域改造免疫球蛋白，其中，在缺乏Vh和\間協(xié)作的情況下由重鏈或輕鏈單獨(dú)形成結(jié)合部位。術(shù)語(yǔ)“可變的”指這樣的事實(shí)，可變結(jié)構(gòu)域的某些部分的序列在抗體間廣泛不同，且用于各具體抗體對(duì)其具體抗原的結(jié)合和特異性。但是，可變性并非在抗體的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)均勻分布。它集中在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域二者中稱為高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段中。可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含四個(gè)FR，四個(gè)FR主要采用β -折疊構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，該高變區(qū)形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在一些情況下形成β-折疊結(jié)構(gòu)的部分。各鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR近距離保持在一起，并與來(lái)自其他鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合部位的形成(見(jiàn)Kabat等，Sequences of Proteins oflmmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutesof Health, Bethesda,MD. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)子功能，如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)中的參與。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)可以包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基(例如，\中的約殘基24-34 (LI)、50-56 (L2)和 89-97 (L3), Vh 中的約 31-35B (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3) (Kabat 等，Sequences of Proteins oflmmunological Interest,第 5 版 Public Health Service,National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991)))和 / 或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基(例如 Vl 中的殘基 26-32 (LI)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)，Vh 中的 26-32 (HI)、52A-55 (H2)和 96-101 (H3)(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987)))?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除本文定義的高變區(qū)殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。“抗體片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和形成自抗體片段的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，各具有單個(gè)抗原結(jié)合部位)和殘余的“Fe”片段(其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，且仍能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。此區(qū)域由緊密非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。各可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)正是在此構(gòu)型中相互作用來(lái)定義Vh-Vl 二聚體表面上的抗原結(jié)合部位。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半，其僅包含三個(gè)對(duì)抗原特異的高變區(qū))也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然親和力低于整個(gè)結(jié)合部位。Fab片段還包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同在于，在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端加入了幾個(gè)殘基，其包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH是對(duì)其中恒定結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基具有至少一個(gè)自由巰基的Fab’的命名。F(ab’)2抗體片段最初作為其間具有鉸合部半胱氨酸的Fab’片段對(duì)產(chǎn)生。還已知抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將來(lái)自任意脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”分配至稱為K和λ的兩個(gè)明顯不同的類型之一。取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將抗體分配至不同種類。存在五個(gè)主要種類的完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中的幾個(gè)可以進(jìn)一步劃分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型眾所周知?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中，這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步在V1^P'結(jié)構(gòu)域之間包含多肽接頭，該多肽接頭使scFv能夠形成希望的結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。scFv的綜述見(jiàn)Pliickthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer-Verlag,紐約，269-315 頁(yè)(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的小抗體片段，該片段包含在同一條多肽鏈中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(\)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh) (Vh-Vl) 0通過(guò)使用太短而不允許同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位。雙抗體更充分地描述于例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;和Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，S卩，除了可以在產(chǎn)生單克隆抗體的過(guò)程中出現(xiàn)的可能的變體(這類變體通常以較小的量存在)外，包含該群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位。與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除它們的特異性外，單克隆體的優(yōu)勢(shì)在于它們未受其他免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆的”指抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的特征，而不解釋為需要通過(guò)任意具體的方法來(lái)產(chǎn)生抗體。例如，待按照本文提供的方法使用的單克隆抗體可以通過(guò)最先由Kohler等，Nature256 =495(1975)描述的雜交瘤法制備，或者可以通過(guò)重組DNA法制備(見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào) 4,816,567)。還可以用例如 Clackson 等，Nature 352:624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol.Biol. 222 :581-597(1991)中所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離“單克隆抗體”。本文的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中，部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或隸屬于特定抗體種類或亞類的抗體中對(duì)應(yīng)的序列相同或同源，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一物種或隸屬于另一抗體種類或亞類的抗體中對(duì)應(yīng)的序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們顯示希望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào) 4，816，567 ;Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文的目的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類源化(primatized)”抗體，其包含衍生自非人靈長(zhǎng)類(例如舊大陸猴，如狒狒、獼猴或食蟹猴)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國(guó)專利號(hào)5，693，780)。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合抗體，其包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中，用來(lái)自具有希望的特異性、親和力和容量的諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的非人物種(供體抗體)的高變區(qū)的殘基取代來(lái)自受體的高變區(qū)的殘基。在一些情況下，用對(duì)應(yīng)的非人殘基取代人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基。此外，人源化抗體可以包含不見(jiàn)于受體抗體中或供體抗體中的殘基。產(chǎn)生這些修飾來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個(gè)(且通常為兩個(gè))可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中，全部或基本上全部高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，而除上文指出的一個(gè)或多個(gè)FR取代外，全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將可選地包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的詳情見(jiàn)Jones等，Nature321 :522-525 (1986) ； Riechmann等，Nature 332 :323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)。為了本文的的目的，“完整抗體”是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以及Fe區(qū)的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能?！疤烊豢贵w”通常是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重⑶鏈組成的約150，OOO道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔開(kāi)的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，隨后是許多恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(')，在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域匹配(align)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域匹配。認(rèn)為特定氨基酸殘基形成輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。“裸抗體”是未與異源分子(如毒性部分或放射性標(biāo)記)綴合的抗體(如本文所定義)。在一些實(shí)施方案中，抗體“效應(yīng)子功能”指可歸因于抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))且隨抗體同種型而變的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)。“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中，表達(dá)Fe受 體(FcR)的非特異性毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后引起該靶細(xì)胞的裂解。用于介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞(NK細(xì)胞)僅表達(dá) Fe Y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá) Fe YRI、FcyRII FcyRIII0 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9 :457-92 (1991)的第464頁(yè)上的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定，如美國(guó)專利號(hào)5，500, 362或5，821，337中所述的ADCC測(cè)定。用于這類測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地，或此外，可以例如在動(dòng)物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95 652-656 (1998)中公開(kāi)的動(dòng)物模型中體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性?！叭诵?yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞至少表達(dá)Fe Y RIII，并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。用術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”來(lái)描述與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。在一些實(shí)施方案中，該FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR( Y受體)，且包括FcyRI, Fe Y RII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。Fe YRII受體包括Fe Y RIIA (“活化受體”)和Fe Y RIIB (“抑制受體”)，它們具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同的相似的氨基酸序列?；罨荏wFe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見(jiàn)Dagron，Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997))。FcR 綜述于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92 (1991) ；Capel 等，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41 (1995)中。本文的術(shù)語(yǔ)“FcR”涵蓋了其他FcR，包括有待在將來(lái)鑒定的那些。該術(shù)語(yǔ)還包含負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生兒受體FcRn (Guyer等，J. Immunol. 117 :587 (1976);和Kim等，J. Immunol. 24 :249(1994))。本文所用的術(shù)語(yǔ)“順次的”指在該方法的步驟(a)和(b)之間沒(méi)有層析步驟。本文所用的術(shù)語(yǔ)“連續(xù)的”指將陽(yáng)離子交換材料和混合型材料直接連接，或以允許在陽(yáng)離子交換材料和混合型材料間連續(xù)流動(dòng)的某種其他機(jī)制連接?！拔廴疚铩敝覆煌谙Ｍ亩嚯漠a(chǎn)物的物質(zhì)。污染物包括但不限于宿主細(xì)胞物質(zhì)，如CHOP ;浸出的A蛋白；核酸；希望的多肽的變體、片段、聚集體或衍生物；另一多肽；內(nèi)毒素；病毒污染物；細(xì)胞培養(yǎng)基成分等。本文提到的“約”某個(gè)值或參數(shù)包括(和描述)涉及該值或參數(shù)本身的變動(dòng)。例如，提到“約X”的描述包括了 “X”的描述。除非文中清楚地另有說(shuō)明，本文及所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“或”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。應(yīng)理解，本文描述的本發(fā)明的方面和變通形式包括由該方面和變通形式組成和/或基本上由該方面和變通形式組成。II.純化方法
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本文提供用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法。具體而言，該方法包括使用過(guò)載的陽(yáng)離子交換材料。例如，該方法包括按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度加樣至陽(yáng)離子交換材料上。本文提供的純化方法可以進(jìn)一步包括加樣至混合型材料上。例如，在一些實(shí)施方案中，該方法包括(a)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將該組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上和(b)將從該陽(yáng)離子交換材料回收的組合物加樣至混合型材料上的順次步驟。在另一實(shí)例中，在一些實(shí)施方案中，該方法包括(a)將該組合物加樣至混合型材料上和(b)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將從該混合型材料回收的組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上的順次步驟。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該順次步驟是連續(xù)的。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該順次步驟是不連續(xù)的。在一些實(shí)施方案中，該連續(xù)純化利用相同的流速、電導(dǎo)率和/或pH。上述方法可以進(jìn)一步包括加樣至A蛋白親和層析材料上的步驟。加樣至A蛋白親和層析材料上的步驟通常(但并非必然)在一個(gè)或多個(gè)其他層析步驟之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，加樣至A蛋白親和層析材料上的步驟可以與任意順序的過(guò)載陽(yáng)離子交換層析和混合型層析的順次步驟組合。在一些實(shí)施方案中，該順次步驟是連續(xù)的。在一些實(shí)施方案中，該連續(xù)純化利用相同的流速、電導(dǎo)率和/或pH。陽(yáng)離子交換材料是固相，其帶負(fù)電荷，且具有用于與流經(jīng)或流過(guò)該固相的水溶液中的陽(yáng)離子交換的自由陽(yáng)離子。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料可以是膜、monolith或樹(shù)脂。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料可以是樹(shù)脂。該陽(yáng)離子交換材料可以包含羧酸官能團(tuán)或磺酸官能團(tuán)，如，但不限于磺酸鹽、羧酸、羧甲基磺酸、磺異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺?；?、磺氧乙基或正磷酸鹽。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料可以利用常規(guī)層析材料或?qū)α鲗游霾牧?。該常?guī)層析材料包括例如灌流材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯苯)樹(shù)脂)和擴(kuò)散材料(例如交聯(lián)瓊脂糖樹(shù)脂)。在一些實(shí)施方案中，該聚(苯乙烯-二乙烯苯)樹(shù)脂可以是Poros HS樹(shù)脂。該P(yáng)orosHS樹(shù)脂可以是Poros HS 50 μ m或PorosHS 20 μ m顆粒。在一些實(shí)施方案中，該交聯(lián)瓊脂糖樹(shù)脂可以是磺丙基-Sepharose FastFlow( “SPSFF”)樹(shù)脂。該對(duì)流層析材料可以是膜(例如聚醚砜)或monolith材料(例如交聯(lián)聚合物)。該聚醚砜膜可以是Mustang S。該交聯(lián)聚合物monolith材料可以是交聯(lián)的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-Co-二甲基丙烯酸乙二醇酯)，例如monolith S03。
本領(lǐng)域已知的陽(yáng)離子交換材料的實(shí)例包括但不限于Mustang S、Sartobind
S、S03Monolith> S Ceramic HyperD> Poros HS50、Poros HS20、SPSFF、SP-SepharoseXL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S> Fractogel Se HiCap、Fractogel S03 或Fractogel COO。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換材料是PorosHS50。在一些實(shí)施方案中，該P(yáng)oros HS樹(shù)脂可以是Poros HS 50 μ m或Poros HS 20 μ m顆粒。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該混合型材料包含能夠執(zhí)行一種或多種以下功能性的官能團(tuán)陰離子交換、形成氫鍵和疏水作用。在一些實(shí)施方案中，該混合性材料包含能夠進(jìn)行陰離子交換和疏水作用的官能團(tuán)。該混合型材料可以包含N-芐基-N-甲基乙醇胺、4-巰基-乙基-吡啶、己胺或苯丙胺作為配體，或包含交聯(lián)的聚烯丙胺。該混合型材料的實(shí)例包括 Capto_Adhere、MEP HyperCeI>HEA HyperCel 或 PPA HyperCel 樹(shù)月旨,或ChromaSorb膜。在一些實(shí)施方案中，該混合型材料是Capto-Adhere樹(shù)脂。
在一些實(shí)施方案中，本文提供用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，其中該方法包括⑴或(ii)⑴(a)按高于約150g/L樹(shù)脂的加樣密度將該組合物加樣至Poros HS50上和(b)將從PorosHS50回收的組合物加樣至Capto-Adhere上的順次步驟；或(ii) (a)將該組合物加樣至Capto-Adhere上和(b)按高于約150g/L樹(shù)脂的加樣密度將從Capto-Adhere回收的組合物加樣至Poros HS50上的順次步驟。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，按高于約150g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、550g/L、600g/L、650g/L、700g/L、800g/L、900g/L 或 1000g/L 陽(yáng)離子交換材料中任一個(gè)的加樣密度將該組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上?？梢园醇s150g/L至2000g/L、150g/L 至 1500g/L、150g/L 至 1000g/L、200g/L 至 1500g/L、300g/L 至 1500g/L、400g/L 至1000g/L或500g/L至1000g/L陽(yáng)離子交換材料中任一個(gè)的加樣密度將該組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上。在一些實(shí)施方案中，按約150g/L、300g/L、500g/L、550g/L、600g/L、650g/L、700g/L、800g/L、850g/L、900g/L、1000g/L、1500g/L 或 2000g/L 陽(yáng)離子交換材料中任一個(gè)的加樣密度將該組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，按高于約25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、150g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L 或 550g/L 混合型材料中任一個(gè)的加樣密度將該組合物加樣至混合型材料上。按約25g/L至1000g/L、25g/L至700g/L或25g/L至500g/L混合型材料中任一個(gè)的加樣密度將該組合物加樣至混合型材料上?？梢岳玫亩喾N緩沖液取決于，例如，希望的緩沖液pH、希望的緩沖液電導(dǎo)率、目的蛋白質(zhì)的特征和純化方法。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法包括使用緩沖液。該緩沖液可以是加樣緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液。在一些實(shí)施方案中，力口樣緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種是相同的。在一些實(shí)施方案中，力口樣緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液是不同的。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該緩沖液包含鹽。該緩沖液可以包含氯化鈉、醋酸鈉或其混合物。在一些實(shí)施方案中，該緩沖液是氯化鈉緩沖液。在一些實(shí)施方案中，該緩沖液是醋酸鈉緩沖液。本文所用的加樣物是加樣至層析材料上的組合物。加樣緩沖液是用來(lái)將包含目的多肽的組合物加樣至層析材料上的緩沖液。在加樣待純化的組合物之前，可以用平衡緩沖液平衡層析材料。在將組合物加樣至層析材料上之后，用洗滌緩沖液來(lái)從固相洗脫目的多肽。電導(dǎo)率指水溶液在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過(guò)離子轉(zhuǎn)移流動(dòng)。因此，隨著存在于水溶液中的離子量增加，溶液將具有更高的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的基本測(cè)量單位是Siemen (或mho)、mho (mS/cm),且可以用電導(dǎo)率計(jì)(如多種型號(hào)的Orion電導(dǎo)率計(jì))測(cè)量。由于電介質(zhì)電導(dǎo)率是溶液中的離子攜帶電流的能力，因此可以通過(guò)改變其中的離子濃度來(lái)改變?nèi)芤旱碾妼?dǎo)率。例如，可以改變?nèi)芤褐械木彌_劑濃度和/或鹽濃度(例如氯化鈉、醋酸鈉或氯化鉀)來(lái)達(dá)到希望的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，改 變多種緩沖液的鹽濃度來(lái)達(dá)到希望的電導(dǎo)率。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該電導(dǎo)率具有高于約2mS/cm、5mS/cm、7. 5mS/cm或10mS/cm中任一個(gè)的電導(dǎo)率。該電導(dǎo)率可以是約2mS/cm至25mS/cm、2mS/cm 至 IOmS/cm、3mS/cm 至 8mS/cm、2mS/cm 至 6mS/cm、4mS/cm 至 6mS/cm 或 2mS/cm 至 4mS/cm中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，該電導(dǎo)率可以是約2mS/cm、3mS/cm、4mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、8mS/cm或10mS/cm中的任一個(gè)。在一方面，該電導(dǎo)率是加樣緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液、平衡緩沖液和洗滌緩沖液中的一種或多種的電導(dǎo)率是相同的。在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液的電導(dǎo)率不同于洗滌緩沖液和/或平衡緩沖液的電導(dǎo)率。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該緩沖液具有低于約10、9、8、7或6中任一個(gè)的pH。該緩沖液可以具有約3至10、4至8、4至6或5至6中任一個(gè)的pH。在一些實(shí)施方案中，該pH是約4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5或8中的任一個(gè)。該pH可以是加樣緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液的pH。在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種的PH是相同的。在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液的pH不同于平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的pH。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，流速低于約50CV/小時(shí)、40CV/小時(shí)或30CV/小時(shí)中的任一個(gè)。流速可以是約5CV/小時(shí)至50CV/小時(shí)、IOCV/小時(shí)至40CV/小時(shí)或18CV/小時(shí)至36CV/小時(shí)中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，流速是約9CV/小時(shí)、18CV/小時(shí)、25CV/小時(shí)、30CV/小時(shí)、36CV/小時(shí)或40CV/小時(shí)中的任一個(gè)。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，流速低于約IOOcm/小時(shí)、75cm/小時(shí)或50cm/小時(shí)中的任一個(gè)。流速可以是約25cm/小時(shí)至150cm/小時(shí)、25cm/小時(shí)至IOOcm/小時(shí)、50cm/小時(shí)至IOOcm/小時(shí)或65cm/小時(shí)至85cm/小時(shí)中的任一個(gè)。流速可以是陽(yáng)離子交換材料上的流速或混合型材料上的流速。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料上的流速與混合型材料上的流速相同。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料上的流速不同于混合型材料上的流速。柱床高度是所使用的層析材料的高度。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，柱床高度高于約3cm、10cm或15cm中的任一個(gè)。柱床高度可以是約3cm至35cm、5cm至15cm、3cm至IOcm或5cm至8cm中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，柱床高度是3cm、5cm、IOcm或15cm中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料的柱床高度與混合型材料的柱床高度相同。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料的柱床高度不同于混合型材料的柱床高度。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該至少一種污染物是CHOP、浸出的A蛋白、DNA、聚集蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基成分、慶大霉素和病毒污染物中的任意一種或多種。CHOP是來(lái)自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)，S卩，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(“ELISA”)或Meso Scale Discovery ( “MSO”)來(lái)測(cè)量CHOP的量。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，CHOP的量降低了高于10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一個(gè)。CHOP的量可以降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，CHOP 的量降低了約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將從一個(gè)或多個(gè)純化步驟回收的組合物中CHOP的量與該一個(gè)或多個(gè)純化步驟之前的組合物中CHOP的量相比較來(lái)測(cè)定該降低。聚集多肽可以是高分子量(HMW)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，聚集蛋白質(zhì)是目的多肽的多聚體。HMW可以是目的多肽的二聚體、至多Sx單體或更大。測(cè)量聚集蛋白質(zhì)(例如HMW)的方法為本領(lǐng)域已知，并描述于實(shí)施例部分中。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，聚集蛋白質(zhì)的量降低了高于約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一個(gè)。聚集蛋白質(zhì)的量可以降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一個(gè)。聚集蛋白質(zhì)的量可以降低約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% 中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將從一個(gè)或多個(gè)純化步驟回收的組合物中聚集蛋白質(zhì)(例如·HMW)的量與該一個(gè)或多個(gè)純化步驟之前的組合物中聚集蛋白質(zhì)(例如HMW)的量相比較來(lái)測(cè)定該降低。浸出的A蛋白是從其所結(jié)合的固相解吸或洗滌出的A蛋白。例如，浸出的A蛋白可以從A蛋白層析柱浸出?？梢岳缤ㄟ^(guò)ELISA來(lái)測(cè)量A蛋白的量。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，浸出的A蛋白的量降低了高于約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70 %、80 %或90 %中的任一個(gè)。浸出的A蛋白的量可以降低約10 %至99 %、30 %至95 %、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，浸出的A蛋白的量可以降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90 %或95 %中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將從一個(gè)或多個(gè)純化步驟回收的組合物中浸出的A蛋白的量與該一個(gè)或多個(gè)純化步驟之前的組合物中浸出的A蛋白的量相比較來(lái)測(cè)定該降低。測(cè)量DNA(如CHO細(xì)胞DNA)的方法為本領(lǐng)域已知，并描述于實(shí)施例部分中。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，DNA的量降低了高于約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中的任一個(gè)。DNA的量可以降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至 99% 中的任一個(gè)。DNA 的量可以降低約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 99% 中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將從一個(gè)或多個(gè)純化步驟回收的組合物中DNA的量與該一個(gè)或多個(gè)純化步驟之前的組合物中DNA的量相比較來(lái)測(cè)定該降低。細(xì)胞培養(yǎng)基成分指存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的成分。細(xì)胞培養(yǎng)基可以是收獲細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)基成分是慶大霉素?？梢酝ㄟ^(guò)ELISA來(lái)測(cè)量慶大霉素的量。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基成分的量降低了高于約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中的任一個(gè)。細(xì)胞培養(yǎng)基成分的量可以降低約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99 %或85 %至99 %中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基成分的量可以降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 98% 中的任一個(gè)。在一些實(shí)施
方案中，通過(guò)將從一個(gè)或多個(gè)純化步驟回收的組合物中細(xì)胞培養(yǎng)基成分的量與該一個(gè)或多個(gè)純化步驟之前的組合物中細(xì)胞培養(yǎng)基成分的量相比較來(lái)測(cè)定該降低。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法可以進(jìn)一步在本文所述層析步驟中任一個(gè)之前或之后包括一個(gè)或多個(gè)純化步驟。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在步驟(a)和(b)之前或之后使包含多肽的組合物經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)其他純化步驟。其他純化方法包括，例如，羥基磷灰石層析；凝膠過(guò)濾層析；親和層析；凝膠電泳；透析；乙醇沉淀；反相HPLC ;硅石上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沉淀；及金屬螯合柱結(jié)合表位標(biāo)記形式的多肽。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括回收該純化的多肽。在一些實(shí)施方案中，從本文所述純化步驟中的任一個(gè)回收該純化的多肽。該層析步驟可以是陽(yáng)離子交換層析、混合型層析或A蛋白層析。
在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將該純化方法的純化的多肽與可藥用載體組合。III.多肽提供用于純化多肽的任意方法及包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽的制劑中的多肽。在一些實(shí)施方案中，該多肽是治療性多肽。該治療性多肽可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡和/或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施方案中，該多肽是拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，該多肽是激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，該多肽是抗體。在一些實(shí)施方案中，該多肽具有高于約5，000道爾頓、10，000道爾頓、15，000道爾頓、25，000道爾頓、50，000道爾頓、75，000道爾頓、100，000道爾頓、125，000道爾頓或150, 000道爾頓中任一個(gè)的分子量。該多肽可以具有約50，000道爾頓至200，000道爾頓或100，000道爾頓至200，000道爾頓中任一個(gè)的分子量。備選地，用于本文的多肽可以具有約120，000道爾頓或約25，000道爾頓的分子量。pi是等電點(diǎn)，且是特定分子或表面不攜帶凈電荷的pH。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，多肽的Pl可以是約6至10、7至9或8至9中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，多肽具有約6、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或10中任一個(gè)的pi。通常用重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生待用本文所述方法純化的多肽。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法描述于例如美國(guó)專利號(hào)5，534，615和4，816，567中，該專利在此明確引入作為參考。在一些實(shí)施方案中，在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)(見(jiàn)例如WO 94/11026)。在使用重組技術(shù)時(shí)，多肽可以在胞內(nèi)、在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中?？梢詮呐囵B(yǎng)基或從宿主細(xì)胞裂解物回收多肽?？梢酝ㄟ^(guò)多種物理或化學(xué)手段來(lái)破碎用于表達(dá)多肽的細(xì)胞，如凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或細(xì)胞裂解劑。如果多肽在胞內(nèi)產(chǎn)生，則作為第一步，例如通過(guò)離心或超濾來(lái)去除顆粒碎片(宿主細(xì)胞或裂解片段)。Carter 等,Bio/Technology 10 :163-167(1992)描述了用于分離分泌至大腸桿菌(E. coli)周質(zhì)間隙的多肽的方法。簡(jiǎn)言之，在醋酸鈉(pH 3. 5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化細(xì)胞糊約30分鐘?？梢酝ㄟ^(guò)離心去除細(xì)胞碎片。在多肽分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中時(shí)，通常先用市售多肽濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)濃縮來(lái)自這類表達(dá)系統(tǒng)的上清。可以在任意前述步驟中包含諸如PMSF的蛋白酶抑制劑來(lái)抑制蛋白質(zhì)水解，且可以包含抗生素來(lái)防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)。⑷抗體在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，用于純化多肽的任意方法和包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽的制劑中的多肽是抗體?？贵w的分子靶標(biāo)包括⑶蛋白質(zhì)及其配體，如，但不限于(i)⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、CDlla、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79a(CD79a)和 CD79 β (CD79b) ; (ii)ErbB 受體家族的成員，如EGF受體，HER2、HER3或HER4受體；(iii)細(xì)胞黏附分子，如LFA-U MacU pl50，95、VLA-4、ICAM-I、VCAM和v/3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如抗-CDlla、抗-CD18或抗-CDllb抗體)；(iv)生長(zhǎng)因子，如VEGF ；IgE ;血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ;蛋白C、BR3、c-met、組織因子7等；及(V)細(xì)胞表面和跨膜腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，如美國(guó)專利號(hào)7，521，541中所述的那些。
其他示例性抗體非限制性地包括選自抗-雌激素受體抗體、抗-孕酮受體抗體、抗_p53抗體、抗-HER-2/neu抗體、抗-EGFR抗體、抗-組織蛋白酶D抗體、抗_Bcl_2抗體、抗-E-鈣黏蛋白抗體、抗-CA125抗體、抗-CA15-3抗體、抗-CA19-9抗體、抗-c-erbB_2抗體、抗-P-糖蛋白抗體、抗-CEA抗體、抗-成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)抗體、抗-ras癌蛋白抗體、抗-Lewis X抗體、抗-Ki-67抗體、抗-PCNA抗體、抗-0)3抗體、抗-0)4抗體、抗-0)5抗體、抗-CD7抗體、抗-CD8抗體、抗-CD9/p24抗體、抗-CDlO抗體、抗-CDlla抗體、抗-CDllc抗體、抗-⑶13抗體、抗-⑶14抗體、抗-⑶15抗體、抗-⑶19抗體、抗-⑶20抗體、抗-⑶22抗體、抗-⑶23抗體、抗-⑶30抗體、抗-⑶31抗體、抗-⑶33抗體、抗-⑶34抗體、抗-⑶35抗體、抗-CD38抗體、抗-CD41抗體、抗-LCA/CD45抗體、抗-CD45R0抗體、抗-CD45RA抗體、抗-⑶39抗體、抗-⑶100抗體、抗-⑶95/Fas抗體、抗-⑶99抗體、抗-⑶106抗體、抗-泛素抗體、抗-CD71抗體、抗-c-myc抗體、抗-細(xì)胞角蛋白抗體、抗_波形蛋白抗體、抗-HPV蛋白質(zhì)抗體、抗-K輕鏈抗體、抗_λ輕鏈抗體、抗-黑素體抗體、抗-前列腺特異性抗原抗體、抗-S-100抗體、抗-tau抗原抗體、抗-纖維蛋白抗體、抗-角蛋白抗體和抗-Tn抗原抗體。⑴多克隆抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是多克隆抗體。優(yōu)選通過(guò)多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來(lái)在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體。用雙功能劑或衍生劑(例如馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烷基)將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中具有免疫原性的多肽(例如匙孔槭血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)綴合可以是有用的。通過(guò)將例如100 μ g或5 μ g的多肽或綴合物(分別對(duì)于兔或小鼠)與3體積的弗氏完全佐劑組合，并在多個(gè)部位皮內(nèi)注射該溶液來(lái)針對(duì)抗原、免疫原性綴合物或衍生物免疫動(dòng)物。一個(gè)月后，通過(guò)在多個(gè)部位皮下注射來(lái)用弗氏完全佐劑中的初始量的1/5至1/10的肽或綴合物加強(qiáng)免疫動(dòng)物。7至14天后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血，并測(cè)定血清的抗體效價(jià)。加強(qiáng)免疫動(dòng)物，直至效價(jià)平臺(tái)期。在一些實(shí)施方案中，用同一抗原的綴合物加強(qiáng)免疫動(dòng)物，但該抗原與不同的多肽綴合和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑綴合。綴合物還可以作為多肽融合物在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備。另外，適宜地用諸如明礬的聚集劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。單克隆抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體的群體，即，除在產(chǎn)生單克隆抗體的過(guò)程中出現(xiàn)的可能的變體(這類變體通常以較小的量存在)外，包含該群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位。因此，修飾詞“單克隆的”指抗體不是離散抗體或多克隆抗體的混合物的特征。例如,單克隆抗體可以用最先由Kohler等,Nature 256 :495 (1975)描述的雜交瘤法制備，或者可以通過(guò)重組DNA法制備(美國(guó)專利號(hào)4，816，567)。在雜交瘤法中，按本文所述免疫小鼠或其他適宜的宿主動(dòng)物(如倉(cāng)鼠)來(lái)引發(fā)淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性結(jié)合用于免疫的多肽的抗體。備選地，可以體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適宜的融合劑(如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合 形成雜交瘤細(xì)胞(Goding, Monoclonal Antibodies !Principles and Practice, 59-103 頁(yè)(Academic Press,1986))。將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞接種和培養(yǎng)在適宜的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)防止缺乏HGPRT的細(xì)胞生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，該骨髓瘤細(xì)胞是高效融合、通過(guò)所選擇的產(chǎn)抗體細(xì)胞支持抗體的穩(wěn)定高水平產(chǎn)生、且對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的那些。在這些中，在一些實(shí)施方案中，該骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如可從Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, California USA 獲得的衍生自 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤的那些，及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville,MarylandUSA獲得的SP_2或X63_Ag8_653細(xì)胞。還針對(duì)人單克隆抗體的產(chǎn)生描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系(Kozbor, J. Immunol. 133 :3001 (1984)；Brodeur Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications 51-63 頁(yè)(Marcel Dekker, Inc.，紐約，1987))。針對(duì)抗該抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生測(cè)定雜交瘤細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)諸如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的體外結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性?？梢岳缤ㄟ^(guò)Munson 等，Anal. Biochem. 107 :220(1980)的 Scatchard 分析來(lái)測(cè)定單克隆抗體的結(jié)合親和力。鑒定出產(chǎn)生具有希望的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過(guò)有限稀釋法亞克隆該克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice 59-103 頁(yè)(Academic Press, 1986))。適合用于此目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可以在動(dòng)物中作為腹水腫瘤體內(nèi)培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化方法(例如多肽A-S印harose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)適宜地從培養(yǎng)基、腹水或血清分離該亞克隆分泌的單克隆抗體。編碼該單克隆抗體的DNA易于用常規(guī)方法分離和測(cè)序(例如，通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。在一些實(shí)施方案中，該雜交瘤細(xì)胞可作為這種DNA的來(lái)源。一旦分離，即可以將該DNA放入表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不以其他方式產(chǎn)生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤細(xì)胞的宿主細(xì)胞中，以獲得單克隆抗體在該重組宿主細(xì)胞中的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra等，Curr. Opinion inTmmunol. 5 :256-262 (1993)和 Pliickthun, Immunol. Revs.，130 :151-188 (1992)。在另一實(shí)施方案中，可以從用描述于McCafferty等，Nature348 =552-554(1990)中的技術(shù)產(chǎn)生的抗體卩遼菌體文庫(kù)分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature 352 624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠抗體和人抗體。隨后的出版物描述了通過(guò)鏈改組產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Marks等，Bio/Technology 10 :779-783 (1992))，以及作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse 等，Nuc. Acids. Res. 21 :2265-2266 (1993))。因此，這些技術(shù)是除傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)之外用于分離單克隆抗體的可行的選擇。還可以例如通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列(美國(guó) 專利號(hào) 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. NatlAcad. Sci. USA 81 :6851 (1984))，或通過(guò)將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)連接來(lái)修飾DNA。通常，這類非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定區(qū)，或者它們?nèi)〈贵w的一個(gè)抗原結(jié)合部位的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，該嵌合二價(jià)抗體包含對(duì)抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合部位和對(duì)不同抗原具有特異性的另一抗原結(jié)合部位。在本文所述方法中任一種的一些實(shí)施方案中，該抗體是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些實(shí)施方案中，該抗體是IgG單克隆抗體。(iv)人源化抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是人源化抗體。本領(lǐng)域中已描述了用于人源化非人抗體的方法。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域?；旧峡梢园凑?Winter 及其同事的方法(Jones 等,Nature 321 :522-525(1986) ;Riechmann 等,Nature332 :323-327(1988) ;Verhoeyen 等，Science 239 :1534-1536 (1988))，通過(guò)用高變區(qū)序列取代對(duì)應(yīng)的人抗體序列來(lái)進(jìn)行人源化。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4，816，567)，其中，用對(duì)應(yīng)的來(lái)自非人物種的序列取代了基本上不再完整的人可變結(jié)構(gòu)域。實(shí)際上，人源化抗體通常是人抗體，其中，用來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代了一些高變區(qū)殘基，且可能取代一些FR殘基。用于產(chǎn)生人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈二者)的選擇對(duì)降低抗原性非常重要。按照所謂的“最佳適合”法，針對(duì)已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列。然后接受最接近于嚙齒動(dòng)物序列的人序列作為該人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR) (Sims 等，J. Immunol. 151 :2296(1993) ;Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 901 (1987))。另一種方法使用衍生自特定輕鏈或重鏈可變區(qū)亞組的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架區(qū)。同一構(gòu)架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immnol. 151 :2623 (1993))。保留對(duì)抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性來(lái)人源化抗體也很重要。為了達(dá)到此目的，在該方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法來(lái)制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？傻?，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。說(shuō)明和顯示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可得的。這些顯示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中可能的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列選擇和組合FR殘基，使得達(dá)到希望的抗體特征，如增加的對(duì)一種或多種靶抗原的親和力。通常，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)性地涉及影響抗原結(jié)合。(V)人抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是人抗體。作為人源化之外的選擇，可以產(chǎn)生人抗體。例如，現(xiàn)在可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，其在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生人抗體的所有組成成分。例如，已描述了嵌合和種系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)入這類種系突變體小鼠將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體。見(jiàn)例如Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) Jakobovits 等，Nature 362:255-258(1993)； Bruggermann 等，Year in Tmmunο. 7 33 (1993);及美國(guó)專利號(hào) 5，591，669、5，589，369 和5，545，807。備選地，可以用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348 :552-553(1990))來(lái)在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因庫(kù)(gene repertoires)產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)此技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要外被多肽基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇還導(dǎo)致編碼顯示那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；它們的綜述見(jiàn)例如Johnson, Kevin S.和Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology3 :564-571 (1993)。可以將 V基因區(qū)段的幾個(gè)來(lái)源用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352:624-628(1991)從衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的隨機(jī)組合文庫(kù)分離了一系列多樣化的抗-5惡唑酮抗體?？梢詷?gòu)建來(lái)自未免疫的人供體的V基因庫(kù)，且可以基本上按照Marks等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)或Griffith等，EMBO J. 12 =725-734(1993)所述的技術(shù)分離抗一系列多樣化抗原(包括自身抗原)的抗體。還見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，565，332和5，573，905。還可以通過(guò)體外活化B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生人抗體(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，567，610和5，229，275)。(vi)抗體片段在一些實(shí)施方案中，該抗體是抗體片段。已發(fā)展了多種技術(shù)來(lái)產(chǎn)生抗體片段。通常，通過(guò)完整抗體的蛋白水解消化來(lái)衍生這些片段(見(jiàn)例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24 :107-117 (1992)和 Brennan 等，Science 229 81 (1985))。但是，現(xiàn)在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，可以從上文討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體片段。備選地，可以從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并化學(xué)偶聯(lián)來(lái)形成 F(ab’ )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離F(ab’)2片段。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的從業(yè)者而言顯而易見(jiàn)。在其他實(shí)施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)TO 93/16185 ;美國(guó)專利號(hào)5，571，894 ;及美國(guó)專利號(hào)5，587，458?？贵w片段還可以是描述于例如美國(guó)專利號(hào)5，641，870中的“線性抗體”。這類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。在一些實(shí)施方案中，提供本文所述的抗體片 段。在一些實(shí)施方案中，該抗體片段是抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，該抗原結(jié)合片段選自Fab片段、Fab’片段、F(ab’ )2片段、scFv、Fv和雙抗體。(vii)雙特異性抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可以結(jié)合兩個(gè)不同表位。備選地，雙特異性抗體結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子(如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的 Fe 受體(Fe Y R)，如 Fe Y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16))的臂組合，以將細(xì)胞防御機(jī)制集中于該細(xì)胞。雙特異性抗體可以作為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)制備。用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法為本領(lǐng)域已知。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)產(chǎn)生基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中，兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能的混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行)非常麻煩，且產(chǎn)物產(chǎn)率低。WO93/08829 和 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655-3659(1991)中公開(kāi)了類似的方法。根據(jù)不同的方法，將具有希望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合部位)的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。在一些實(shí)施方案中，該融合是與包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。在一些實(shí)施方案中，包含輕鏈結(jié)合所必需的部位的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)存在于該融合的至少一個(gè)中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合和(如果希望)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開(kāi)的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染入適宜的宿主生物。在將不等比例的三條多肽鏈用于構(gòu)建提供最佳產(chǎn)率時(shí)，這為在實(shí)施方案中調(diào)整三個(gè)多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。但是，在表達(dá)等比例的至少兩種多肽鏈導(dǎo)致高產(chǎn)率時(shí)，或在該比例無(wú)特殊意義時(shí)，可能將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。在此方法的一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體由一條臂中具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)此不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于從不想要的免疫球蛋白鏈組合分離希望的雙特異性化合物，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈僅存在于該雙特異性分子的一半中提供了容易的分離方式。此方法公開(kāi)于W094/04690中。產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情見(jiàn)例如Suresh等，MethodsinEnzymology 121:210(1986)。根據(jù)美國(guó)專利號(hào)5，731，168中所述的另一種方法，可以改造抗體分子對(duì)間的界面來(lái)最大化從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比。在一些實(shí)施方案中，該界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少部分G3結(jié)構(gòu)域。在此方法中，用更大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)取代來(lái)自第一抗體分子的界面的一個(gè)或多個(gè)小的氨基酸側(cè)鏈。通過(guò)用更小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側(cè)鏈來(lái)在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與一個(gè)或多個(gè)大的側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償“空洞”。這提供了增加異二聚體的產(chǎn)率超過(guò)其他不想要的終產(chǎn)物(如同二聚體)的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異綴合物”抗體。例如，異綴合物中的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一種與生物素偶聯(lián)。例如，已提出這類抗體將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向至不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4，676，980)，并用于治療HIV感染(W0 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。可以用任意方便的交聯(lián)方法產(chǎn)生異綴合物抗體。適宜的交聯(lián)劑為本領(lǐng)域公知，并連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)4，676，980中。還已在文獻(xiàn)中描述了用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 229 =81(1985)描述了蛋白酶解切割完整抗體來(lái)產(chǎn)生F(ab’)2片段的方法。在二巰基絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下還原這些片段，以穩(wěn)定鄰位二巰基并防止分子間二硫化物形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后通過(guò)用巰基乙胺還原來(lái)將Fab’-TNB衍生物之一再轉(zhuǎn)化為Fab’-巰基，并與等摩爾量的其他Fab’-TNB衍生物混合來(lái)形成雙特異性抗體?？梢詫a(chǎn)生的雙特異·性抗體用作(用于)選擇性固定酶的物質(zhì)。還已描述了用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. 148 (5)1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合將來(lái)自Fos和Jun蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab’部分連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體同二聚體形成單體，然后再氧化形成抗體異二聚體。還可以利用此方法來(lái)產(chǎn)生抗體同二聚體。Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)所述的“雙抗體”技術(shù)提供了用于產(chǎn)生雙特異性抗體片段的備選機(jī)制。片段包含通過(guò)接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，該接頭太短而不允許同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一片段的互補(bǔ)的'和Vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合部位。還已報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv) 二聚體來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體片段的另一策略。見(jiàn)Gruber等，J. Immunol. 152 :5368(1994)?？紤]超過(guò)二價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J. Immunol. 147 :60(1991)。(viii)多價(jià)抗體在一些實(shí)施方案中，該抗體是多價(jià)抗體。多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快地被表達(dá)該抗體所結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或分解代謝)。本文提供的抗體可以是(除IgM種類外的)具有三個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部位的多價(jià)抗體(例如四價(jià)抗體)，其可以容易地通過(guò)重組表達(dá)編碼該抗體的多肽鏈的核酸來(lái)制備。該多價(jià)抗體可以包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部位。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)e區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由Fe區(qū)或鉸鏈區(qū)組成)。在這種情況下，該抗體將包含F(xiàn)e區(qū)及Fe區(qū)氨基端的三個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部位。本文優(yōu)選的多價(jià)抗體包含三個(gè)至約八個(gè)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合部位(或由三個(gè)至約八個(gè)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合部位組成)。該多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中該一條或多條多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。例如，該一條或多條多肽鏈可以包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中，VDl是第一可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)e是Fe區(qū)的一條多肽連，Xl和X2代表氨基酸或多肽，η是O或I。例如，該一條或多條多肽鏈可以包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHI-VH-CHI-Fe區(qū)鏈。本文的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。例如，本文的多價(jià)抗體可以包含約兩條至約八條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。此處考慮的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，且可選地進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。(ix)其他抗體修飾可以希望就效應(yīng)子功能修飾本文提供的抗體，例如，以增強(qiáng)該抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antigen-dependent cel 1-mediatedcyotoxicity, ADCC)和 / 或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用(CDC)。這可以通過(guò)在該抗體的Fe區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代來(lái)達(dá)到。備選地或此外，可以在Fe區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基，從而允許在此區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣產(chǎn)生的同二聚體抗體可以具有改善的內(nèi)化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。見(jiàn)Caron等，J. Exp Med. 176 1191-1195(1992)和 Shopes, B.J.，Immunol. 148 :2918-2922(1992)。還可以用 Wolff等，Cancer Research 53 :2560-2565 (1993)中所述的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體。備選地，可以改造抗體，使其具有雙Fe區(qū)，從而可以具有增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解和ADCC能力。見(jiàn)Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3 ·219-230(1989)。為了增加抗體的血清半衰期，可以按US 2006/0067930中所述在抗體中產(chǎn)生氨基酸改變，該專利在此以其整體引入作為參考。(B)多肽變體和修飾本文所述的多肽(包括抗體)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列修飾可以用于本文所述的純化多肽(例如抗體)的方法。⑴變體多肽本文定義的“多肽變體”意指與該多肽的全長(zhǎng)天然序列、缺乏信號(hào)肽的多肽序列、有信號(hào)肽或無(wú)信號(hào)肽的多肽胞外域具有至少約80%氨基酸序列同一性的多肽，優(yōu)選活性多肽。這類多肽變體包括例如這樣的多肽，其中，在全長(zhǎng)天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，TAT多肽變體將與全長(zhǎng)天然序列多肽序列、缺乏信號(hào)肽的多肽序列、有信號(hào)肽或無(wú)信號(hào)肽的多肽胞外域具有至少約80%氨基酸序列同一性，備選地，具有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中任一個(gè)的氨基酸序列同一性?？蛇x地，與天然多肽序列相比，變體多肽將具有不超過(guò)一個(gè)保守性氨基酸取代，備選地，與天然多肽序列相比，具有不超過(guò)約2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一個(gè)的保守性氨基酸取代。例如與全長(zhǎng)天然多肽相比，變體多肽可以在N端或C端截短，或者可以缺乏內(nèi)部殘基。某些變體多肽可以缺乏并非希望的生物學(xué)活性所必需的氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^(guò)許多常規(guī)技術(shù)中的任一種來(lái)制備這些具有截短、缺失和插入的變體多肽?？梢曰瘜W(xué)合成希望的變體多肽。另一適宜的技術(shù)涉及通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離和擴(kuò)增編碼希望的變體多肽的核酸片段。在PCR中的5’和3’引物上利用定義希望的核酸片段末端的寡核苷酸。優(yōu)選地，變體多肽與本文公開(kāi)的天然多肽共有至少一種生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性。氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度從一個(gè)殘基至包含一百或更多個(gè)殘基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N端甲硫氨酰殘基的抗體或與毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的N端或C端與增加該抗體的血清半衰期的酶或多肽融合。例如，可以希望改善多肽的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性。通過(guò)在抗體核酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖兓蛲ㄟ^(guò)肽合成來(lái)制備多肽的氨基酸序列變體。這類修飾包括例如從多肽的氨基酸序列內(nèi)缺失殘基，和/或在多肽的氨基酸序列內(nèi)插入殘基，和/或取代多肽的氨基酸序列內(nèi)的殘基。產(chǎn)生缺失、插入和取代的任意組合來(lái)達(dá)到最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有希望的特征。氨基酸改變還可以改變多肽(例如抗體)的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。通過(guò)將多肽的序列與已知的同源多肽分子的序列相比較，并最小化在高同源性區(qū)域中產(chǎn)生的氨基酸序列改變的數(shù)目，可以發(fā)現(xiàn)確定可以插入、取代或缺失哪一個(gè)氨基酸殘基而不負(fù)面影響希望的活性的指導(dǎo)。如Cunningham和 Wells, Science 244:1081-1085(1989)所述，用于鑒定多妝(例如抗體)的某些殘基或區(qū)域作為優(yōu)選的誘變位置的優(yōu)選方法稱為“丙氨酸掃描誘變”。在 此，鑒定殘基或靶殘基組(例如帶電荷殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性氨基酸或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在取代位點(diǎn)或針對(duì)取代位點(diǎn)引入進(jìn)一步的變體或其他變體來(lái)精煉對(duì)取代顯示功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，雖然預(yù)先確定引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)，但無(wú)需預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析給定位點(diǎn)上的突變的性能，在靶密碼子或靶區(qū)域處進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并針對(duì)希望的活性篩選所表達(dá)的抗體變體。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗體分子中具有至少一個(gè)被不同殘基取代的氨基酸殘基。對(duì)取代誘變而言，最感興趣的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮FR改變。下文表I在“優(yōu)選取代”的標(biāo)題下顯示保守性取代。如果這類取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，則可以引入表I中命名為“示例性取代”或如下文參考氨基酸種類進(jìn)一步描述的更實(shí)質(zhì)性的改變，并篩選產(chǎn)物。表I
初始?xì)埢鵌示例性取代I優(yōu)選取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn (N)Gln ；His ；Asp ；Lys ；ArgGln
Asp (D)Glu ；AsnGlu
Cys (C)Ser ；AlaSer
Gln(Q)Asn ；GluAsn
Glu(E)Asp ；GlnAsp
權(quán)利要求
1.用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法，其中，所述方法包括⑴或(ii) (i)(a)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將所述組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上和(b)將從所述陽(yáng)離子交換材料回收的組合物加樣至混合型材料上的順次步驟；或 (ii)(a)將所述組合物加樣至混合型材料上和(b)按高于約150g/L陽(yáng)離子交換材料的加樣密度將從混合型材料回收的組合物加樣至陽(yáng)離子交換材料上的順次步驟。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述多肽具有約6和約10之間的pi。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述多肽具有約7和約9之間的pi。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是抗體或免疫黏附素。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述多肽是免疫黏附素。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述多肽是抗體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述單克隆抗體是IgG單克隆抗體。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體是抗原結(jié)合片段。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和雙抗體。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種污染物是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、浸出的A蛋白、DNA、聚集蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基成分、慶大霉素和病毒污染物中的任意一種或多種。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中(i)和/或(ii)中的順次步驟是連續(xù)的。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是(i)。
15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是(ii)。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述加樣密度在約150g/L和約2000g/L陽(yáng)離子交換材料之間。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述密度在約500g/L和約1000g/L陽(yáng)離子交換材料之間。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述陽(yáng)離子交換材料包含羧酸官能團(tuán)或磺酸官能團(tuán)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述官能團(tuán)是磺丙基、磺乙基、磺異丁基或羧基。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述陽(yáng)離子交換材料是膜、monolith或樹(shù)脂顆粒。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述陽(yáng)離子交換材料是樹(shù)脂。
22.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述陽(yáng)離子交換材料是MustangS、Sartobind S、S03 Monolith、S Ceramic HyperD、Poros HS50、Poros HS20、橫丙基-Sepharose Fast Flow (SPSFF) > SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S> Fractogel Se HiCap、Fractogel S03 或 Fractogel COO。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述混合型材料包含能夠進(jìn)行陰離子交換和疏水作用的官能團(tuán)。
24.權(quán)利要求23的方法,其中所述混合型材料是Capto-Adhere樹(shù)脂、MEPHyperCel樹(shù)月旨、HEA HyperCel 樹(shù)脂、PPA HyperCel 樹(shù)脂或 ChromaSorb 膜。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括隨同所述陽(yáng)離子交換材料和/或混合型材料使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液，且所述平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的電導(dǎo)率在約2mS/cm至約25mS/cm之間。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的電導(dǎo)率在約3mS/cm和8mS/cm之間。
27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括隨同所述陽(yáng)離子交換材料和/或混合型材料使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液，且所述平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液的PH在約4. 5和約6. 5之間。
28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的方法，其中隨同所述陽(yáng)離子交換材料和/或混合型材料的平衡緩沖液、洗滌緩沖液和/或加樣緩沖液是相同的。
29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(a)和(b)之前或之后使包含所述多肽的組合物經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)其他純化步驟。
30.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括回收所述純化的多肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其進(jìn)一步包括將所述純化的多肽與可藥用載體組合。
全文摘要
本發(fā)明提供用于從包含多肽和至少一種污染物的組合物純化多肽的方法及包含通過(guò)該方法純化的多肽的制劑。該純化方法包括陽(yáng)離子交換材料和/或混合型材料。
文檔編號(hào)G01N31/00GK102905718SQ201180025404
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者H·F·劉, B·D·凱利, D·E·麥爾斯, B·麥庫(kù)伊, K·M·佩蒂 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司