一種多肽純化制備的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽純化制備方法，具體為一種利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進行純化制備的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種多肽類藥物，多肽在臨床醫(yī)學中有巨大的應用價值。自從發(fā)明固相法化學合成多肽以來，有關各種活性多肽的化學合成有了很大發(fā)展，但產(chǎn)物成分比較復雜，一般是以目標多肽為主的幾種結(jié)構(gòu)相似的多肽混合物。因此，對這一混合物的分離純化一直是一個重要的研究課題，對其分離純化的最優(yōu)化研究就顯得格外重要。此外，提供高純度的多肽樣品，對于其物化性質(zhì)、生物活性及其醫(yī)藥功能的研究具有重要的作用。從現(xiàn)代分離科學理論得出，色譜和電泳是目前所知的分離效果最佳的兩種方法。電泳僅能用于分離而不能用于多肽的分離純化。而高效液相色譜經(jīng)過30多年的快速發(fā)展，在色譜理論研究、儀器研究水平、分析實踐應用、質(zhì)量研究、工業(yè)化大生產(chǎn)等方面，已經(jīng)取得了長足的進步。其中反相高效液相色譜因其良好的選擇性，具有分離效果好、分辨率高、回收率高的特點，在多肽的分離純化中備受青睞，其應用范圍不斷擴大，具有廣闊前景。
[0003]利用反相高效液相色譜對多肽進行分離純化時，反向色譜柱填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相，通常使用十八烷基硅烷鍵合硅膠。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常以水、緩沖液為水相，甲醇、乙腈、異丙醇等為有機相，水相和有機相組成混合試劑進行二元梯度洗脫。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。
[0004]近年來，乙腈成為反相高效液相色譜常用的有機改性劑和溶劑，特別是在多肽分離純化領域應用非常廣泛。反相高效液相色譜對多肽進行分離純化時，所使用的流動相(乙腈和水相)中，乙腈所占的比例為30%_70%( V/V)，這樣大量的乙腈使用后不加以回收利用，非?？上В粌H會造成資源的浪費，還會污染環(huán)境。
[0005]隨著霧霾天頻現(xiàn)，人們對大氣污染越來越關注。揮發(fā)性有機物作為四大總體污染物之一，是形成霾和PM2.5的前提物，是造成環(huán)境污染、損害人體健康的主要“元兇”，因此，國家對揮發(fā)性有機物的治理勢在必行。揮發(fā)性有機污染物早在上世紀八十年代，美國等發(fā)達國家就已經(jīng)開始重視揮發(fā)性有機污染物的減排問題。2010年5月國務院發(fā)布《關于推進大氣污染聯(lián)防聯(lián)控工作改善區(qū)域空氣質(zhì)量的指導意見》，首次將揮發(fā)性有機物與二氧化硫、氮氧化物、顆粒物等一起列為大氣污染聯(lián)防聯(lián)控的重點污染物，提出加大揮發(fā)性有機物污染防治?！笆濉逼陂g，揮發(fā)性有機物污染治理和防控政策則進入密集發(fā)布期，環(huán)保“十二五”規(guī)劃提出要開展揮發(fā)性有機物和有毒廢氣監(jiān)測，完善重點行業(yè)污染物排放標準。目前，揮發(fā)性有機物治理已進入我國大氣污染治理日程。2015年上半年，環(huán)保部印發(fā)了《揮發(fā)性有機物排污收費試點辦法》，2015年12月17日，上海市發(fā)布《上海市揮發(fā)性有機物排污收費試點實施辦法》，決定試點收取揮發(fā)性有機物排污收費。試點分三個階段實施，逐步提高收費標準。針對這種情況，許多企業(yè)為了減少有機物排污，將產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物，如乙腈廢液等，進行回收后，對其進行精制，然后重新供給生產(chǎn)企業(yè)使用。
[0006]傳統(tǒng)的乙腈回收有變壓精餾法、恒沸精餾法、鹽析方法、脫水劑脫水法，這幾種方法均使用粗蒸及精餾兩個步驟，使用特殊的精餾方法進行分離處理，存在處理方法復雜、設備成本高以及分離效率低，能耗高等問題。
[0007]傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)鹽方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面裝填陰陽離子樹脂，利用離子交換的原理實現(xiàn)多肽產(chǎn)品的轉(zhuǎn)鹽過程。另外利用傳統(tǒng)陰陽離子交換原理，對多肽產(chǎn)品進行轉(zhuǎn)鹽，步驟I)在調(diào)整多肽產(chǎn)品液體的PH后，上樣掛柱2)沖洗樣品3)利用酸堿調(diào)整沖洗液的PH后將多肽產(chǎn)品沖洗下來，在此過程中，每一個環(huán)節(jié)都要取少許的流出液進行HPLC檢測，確認沖洗干凈后，方可進行下一步工作。所以此方法，工作流程多，時間消耗大，而且會產(chǎn)生大量的廢液，更重要的是最后收集的多肽產(chǎn)品合格液體積大，不利于下面的濃縮和凍干工作。另外需要購置儀器設備和陰陽離子填料，還需另外安排實驗場地和人員，耗費了大量的人力物力。
[0008]國內(nèi)外不乏關于反相高效液相色譜應用的文獻，也有許多關于乙腈回收、精制的文獻資料，但是少有利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進行分離純化的方法相關文獻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進行純化制備的方法，主要解決現(xiàn)有多肽純化制備方法存在成本高、揮發(fā)性有機物排放、轉(zhuǎn)鹽困難等技術(shù)問題。其技術(shù)思路是利用反相高效液相色譜法對多肽進行純化制備的同時，將產(chǎn)生的高濃度乙腈廢液，經(jīng)過回收，重新被系統(tǒng)利用，同步應用于多肽分離純化的方法。此方法具有工藝簡單、操作方便、成本低等優(yōu)點。更有意義的是此方法大大降低了多肽純化制備的成本，并且減少了乙腈廢液的排放，既省錢又環(huán)保。應用此方法對多肽進行純化制備，生產(chǎn)規(guī)模越大，節(jié)省下來的成本越可觀。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種多肽純化制備的方法，包括以下步驟:
1)多肽粗品溶解在醋酸、乙腈、水溶液中，超聲處理，濾膜過濾，取濾液待用；
2)利用反相高效液相色譜系統(tǒng)，對過濾后的多肽粗品進行分離純化，制備動態(tài)軸向壓縮柱，流動相A為質(zhì)量百分濃度100%乙腈溶液，流動相B為質(zhì)量百分濃度0.1%-0.3%醋酸水溶液，進行梯度洗脫分離純化，采用紫外檢測器對樣品進行檢測，分段收集目的峰值的肽溶液;乙腈廢液進入乙腈廢液回收處理流程；
3)將分離純化后得到的高純度目的肽溶液進行減壓旋蒸濃縮，濃縮液收集待用；乙腈廢液進入乙腈廢液回收處理流程；
4)將濃縮液經(jīng)過反相動態(tài)軸向壓縮柱，采用離子交換法轉(zhuǎn)成醋酸鹽；乙腈廢液進入乙腈廢液回收處理流程；
5)將轉(zhuǎn)好醋酸鹽合格產(chǎn)品進行減壓旋蒸濃縮、冷凍干燥，得到白色絮狀粉末產(chǎn)品，經(jīng)檢測合格即為最終產(chǎn)品；乙腈廢液進入乙腈廢液回收處理流程。
[0011 ]步驟2)、3)、4)、5)所述的乙腈廢液回收處理流程為:乙腈廢液進入廢液儲罐，將廢液儲罐內(nèi)的乙腈廢液通過抽真空，轉(zhuǎn)移至精餾塔的塔釜內(nèi)，利用精餾塔，對乙腈廢液進行精餾，收集高濃度的回收乙腈于儲罐內(nèi)，將檢測合格的回收乙腈通過磁力栗經(jīng)管道轉(zhuǎn)移至合格回收乙腈儲罐內(nèi)，供反相高效液相色譜系統(tǒng)循環(huán)使用。
[0012]步驟I)所述的多肽粗品其溶解條件體積比:醋酸:乙腈:水=1: 10:40。
[0013]步驟2)所述的制備動態(tài)軸向壓縮柱內(nèi)裝固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相硅膠。
[0014]步驟4)所述的反相動態(tài)軸向壓縮柱轉(zhuǎn)醋酸鹽使用流動相為20?50mmol醋酸胺緩沖鹽體系。
[0015]所述的精餾塔，塔體里裝填直徑為4mm的玻璃彈簧填料。塔體外接加熱循環(huán)器，內(nèi)接再沸器，實現(xiàn)對乙腈廢液內(nèi)部循環(huán)加熱及加熱溫度的自動調(diào)節(jié)和監(jiān)控。
[0016]所述的檢測合格的回收乙腈，純度大于99%，質(zhì)量百分濃度大于85%。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提出了一種利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進行純化制備的方法。本發(fā)明乙腈回收具有下述特點:特點1:反相高效液相色譜系統(tǒng)對多肽進行純化制備時產(chǎn)生的乙腈廢液，經(jīng)精餾塔精餾，將檢測合格的回收乙腈通過磁力栗經(jīng)四氟管道轉(zhuǎn)移至有機相儲罐內(nèi)，直接供反相高效液相色譜系統(tǒng)使用，這種方法實現(xiàn)了兩個體系的聯(lián)動，使乙腈在系統(tǒng)中得到循環(huán)利用。特點2:由于乙腈廢液和回收乙腈的液體量非常大，而且有一定的揮發(fā)性，如果通過人為搬運的方式轉(zhuǎn)移液體的話，既耗費人力也有安全隱患。此方法將精餾塔與反相高效液相色譜系統(tǒng)合為一體，整個系統(tǒng)通過四氟軟管相連，以真空栗和磁力栗為動力源，避免了人為接觸。特點3:精餾塔塔體里裝填直徑為4mm的玻璃彈簧填料，塔體外接加熱循環(huán)器，內(nèi)接再沸器，實現(xiàn)對乙腈廢液內(nèi)部循環(huán)加熱及加熱溫度的自動調(diào)節(jié)和監(jiān)控。此精餾裝置為全玻璃結(jié)構(gòu)，成本低、效率高、操作簡單、配備方便，即可在實驗室里面配備，也可在大規(guī)模生產(chǎn)車間內(nèi)配備。使用反相高效液相色譜純化制備多肽，并在轉(zhuǎn)鹽環(huán)節(jié)借助與本身色譜系統(tǒng)，無需另外購買儀器和色譜柱，使用的流動相也是反相高效液相色譜中非常常用的試劑。在整個分離純化、濃縮、轉(zhuǎn)鹽、再濃縮過程中，收集高濃