一種篩選n-?；呓z氨酸內(nèi)酯類模擬物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程與適體技術(shù)，公開了針對篩選細(xì)菌N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHLs)模擬物的噬菌體展示技術(shù)。具體而言，特指一種篩選細(xì)菌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs)多肽模擬物的技術(shù)，該方法同樣也適用于各種類型長、短鏈AHLs的多肽模擬物篩選。本發(fā)明中涉及的噬菌體展示技術(shù)可適用于例如噬菌體抗體庫、環(huán)肽、線性多肽等帶有隨機(jī)文庫的任何噬菌體文庫。涉及的宿主菌為可以被噬菌體文庫侵染的雄性F ’細(xì)菌，例如ER2738、DH5a F’、XLl_Blue等，涉及的載體為感應(yīng)QS分子誘導(dǎo)細(xì)菌攜帶耐藥抗性基因的載體PSB538。屬于病原微生物預(yù)防與控制領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著細(xì)菌耐藥的形勢日益嚴(yán)峻，替代抗生素的新型抑菌技術(shù)和策略的研究和開發(fā)迫在眉睫。其中，通過免疫細(xì)菌群體感應(yīng)(QS, quorum sensing)效應(yīng)分子來提高宿主抗菌能力是一個具有廣闊應(yīng)用潛力的抑菌策略。細(xì)菌的群體感應(yīng)是指細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的群體行為，研究發(fā)現(xiàn)，自然界中大部分的細(xì)菌都存在QS現(xiàn)象，它不僅控制細(xì)菌的生物發(fā)光，還與生物被膜和孢子生成、毒素分泌、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及包括抗生素在內(nèi)的第二代謝產(chǎn)物合成緊密相關(guān)。目前已知的細(xì)菌QS系統(tǒng)，可以根據(jù)分泌的化學(xué)信號分子性質(zhì)(又稱為自誘導(dǎo)物，Al，autoinducer)分為以下4類:一類信號分子為A1-1，是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHLs)及其衍生物，廣泛分布在革蘭氏陰性細(xì)菌中并具有種屬特異性。該類分子作用機(jī)理的研究相對比較透徹= AHLs分子由一系列具有相同高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和不同碳原子數(shù)目和飽和程度的酰胺側(cè)鏈構(gòu)成，N側(cè)鏈中的碳原子數(shù)多為偶數(shù)(只有C7—個奇數(shù))，從C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基團(tuán)。以費(fèi)氏弧菌為例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并擴(kuò)散到細(xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞密度增加到一定閾值時，AHLs與LuxR家族蛋白結(jié)合，從而使LuxR族蛋白與DNA上的調(diào)控元件結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄LuxCDABEG，啟動生物發(fā)光過程;第二類是由LuxS家族蛋白形成的自誘導(dǎo)物A1-2，其主要成分為呋喃酮酰硼酸酯。文獻(xiàn)報道A1-2在多種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中存在，是不同物種細(xì)菌間相互聯(lián)系的通用信號。另外兩類是在革蘭氏陽性細(xì)菌中獨(dú)有的寡肽類分子AIP(Autoinducing peptide)以及目前機(jī)制還尚未完全清楚的腎上腺素/去甲腎上腺素信息系統(tǒng)(A1-3)信號分子。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，AHLs分子具有免疫保護(hù)作用。1998年，Tateda等人發(fā)現(xiàn)，3-OXO-C12_HSL分子可以刺激宿主增加IgG和IgE濃度并提高免疫保護(hù)力。此后，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該分子還可以刺激IL-8表達(dá)，提高中性細(xì)胞數(shù)目和噬菌細(xì)胞活性，并介導(dǎo)炎癥發(fā)生，提示AHLs可能作為潛在的疫苗候選物。2006年，Miyairi等人將3-OXO-C12-HSL偶聯(lián)BSA制備成半抗原后免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠感染銅綠假單胞菌的存活率得到顯著提高，進(jìn)一步證實(shí)了AHLs分子作為疫苗候選物的可能性。
[0004]本專利中運(yùn)用到QS分子或者QS抑制劑感應(yīng)菌株。目前研發(fā)了多種檢測不同類型AHLs分子及其抑制物的報告菌株(Quorum sensing b1sensors)，其原理是通過感應(yīng)到外源添加的QS分子，從而誘導(dǎo)系統(tǒng)啟動發(fā)光或者自殺基因，從而達(dá)到篩選的目的。例如大腸桿菌的PSB536質(zhì)粒上帶有嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)AhyRI’和生物發(fā)光基因lux⑶ABE，當(dāng)添加入短鏈AHLs分子后，AhyR蛋白感應(yīng)QS分子，激活A(yù)hyI’啟動子，從而啟動Lux⑶ABE蛋白，使細(xì)菌生物發(fā)光。又如大腸桿菌的QSISl系統(tǒng)，pTBR2iB載體攜帶費(fèi)氏弧菌的luxRI’和QS分子激活啟動的自殺基因phlA。在添加入相應(yīng)QS分子和候選QS抑制物后，細(xì)菌只在能抑制QS分子啟動自殺基因的QS抑制物培養(yǎng)基中存活，從而篩選到QS抑制物。
[0005]本專利中運(yùn)用到的另一個技術(shù)是■菌體展示隨機(jī)肽庫(Phagedisplay)技術(shù)，它是將一段長度大約為15_36bp的隨機(jī)核苷酸序列插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因內(nèi)，外源短肽隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面。理論上，7個隨機(jī)氨基酸序列可產(chǎn)生約207種多肽序列，可以作為“人工抗體”，篩選出能特異性結(jié)合靶物質(zhì)的多肽。該技術(shù)一般采用生物淘選(B1panning)的方法來篩選抗原表位，其常規(guī)技術(shù)流程大致為:將革E蛋白或物質(zhì)包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌體展示肽庫與之特異性結(jié)合，經(jīng)過多輪的清洗和篩選后，獲得與靶物質(zhì)結(jié)合較緊密的噬菌體克隆，最終確認(rèn)特異的短肽序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]雖然AHLs分子可以作為疫苗候選物，但是該化合物或者其衍生物是一類脂類的小分子物質(zhì)，前期的提取、鑒定和純化過程復(fù)雜，而且人工設(shè)計(jì)合成不僅需要專業(yè)的化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)分析背景，還要考慮到樣品制備過程的繁瑣程度，專業(yè)的設(shè)備、中間產(chǎn)物毒性與污染評估以及樣品純度等一系列問題，導(dǎo)致該分子及其衍生物價格昂貴，目前無法大量純化生產(chǎn)并應(yīng)用于宿主疫苗，只在科研實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)運(yùn)用。這些問題制約著AHLs分子及其模擬物的進(jìn)一步發(fā)展，急需一種能快速、高通量地篩選出高效AHLs分子或者具有其相似功能的模擬物分子的新方法。因此，本研究所要解決的技術(shù)問題是:如何篩選出價格便宜，宿主免疫保護(hù)效果顯著的AHLs分子類似物。本發(fā)明的主要目的是:建立一種簡單、快速地篩選AHLs分子類似物的技術(shù)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本研究專利基于多肽適體與小分子物質(zhì)結(jié)合靶蛋白相同位點(diǎn)，可觸發(fā)相同生物學(xué)效應(yīng)的假說，利用隨機(jī)肽庫可模擬AHLs分子效應(yīng)空間結(jié)構(gòu)的原理。其主要原理如圖2所示:首先構(gòu)建一個可以感應(yīng)外源添加的特定AHLs分子，誘導(dǎo)抗生素抗性，從而在抗生素篩選平板中存活的質(zhì)粒系統(tǒng)。然后攜帶有該質(zhì)粒的細(xì)菌與噬菌體隨機(jī)肽庫孵育侵染，在不添加特定AHLs分子的平板中孵育。在利用抗生素抗性的質(zhì)粒系統(tǒng)中，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗生素抗性的非特異噬菌體感染的細(xì)菌，不能在添加抗生素的平板中存活，而能表達(dá)與QS分子相同效應(yīng)的特異噬菌體，因能形成與QS分子類似功能結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)抗生素抗性表達(dá)，從而使細(xì)菌在抗生素平板中存活。然后將目的候選克隆挑出來，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過DNA測序的方法獲得特異多肽序列對應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的AHLs分子模擬物多肽。
[0008]本發(fā)明所要解決的問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明公開了一種利用M13噬菌體展示隨機(jī)肽庫篩選AHLs分子模擬多肽的方法。以QS分子-C4-AHL感應(yīng)誘導(dǎo)抗性載體PSB538為例，如圖1所示，該質(zhì)粒由QS感應(yīng)菌株pSB536(SM0N SWIFT et，1997)為實(shí)驗(yàn)室保存。帶有嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感應(yīng)C4-AHL分子或者其模擬多肽時，激活A(yù)hyl’啟動子，誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)。在添加氨芐抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，只有添加C4-AHL分子或者產(chǎn)生其模擬多肽才能使細(xì)胞存活。主要原理如圖3所示，利用M13噬菌體不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染攜帶pSB538的大腸桿菌，在添加氯霉素抗性的平皿中篩選出可見光下顯藍(lán)色，且12小時孵育后能正常生長的噬菌斑。然后將該噬菌體擴(kuò)增，加入帶有PSB536的QS感應(yīng)菌株中，通過C4-AHL模擬多肽可誘導(dǎo)生物發(fā)光的方法驗(yàn)證，最后測序獲得特異模擬多肽序列。本專利的方法不只限于利用抗生素抗性和生物發(fā)光來篩選特異噬菌體感染克隆，誘導(dǎo)GFP等發(fā)光報告系統(tǒng)的細(xì)菌，都可適用。
[0009]所述方法具體為:
(1)將含有QS信號分子C4-AHL感應(yīng)抗生素抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌ER2738菌株;從劃線平板中分別挑取單菌落ER2738接種至5 ml添加有20 yg/mL四環(huán)素和100 pg/mL氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 0C,250 rpm振蕩過夜，以2 %接種量轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，然后在200rpm條件下振蕩至對數(shù)生長中期，含pSB538質(zhì)粒菌收集I mL菌體后重懸于200