本發(fā)明涉及一種吡喃衍生物藥學(xué)上可接受的鹽或其鹽的水合物，以及其晶型結(jié)構(gòu)、制備方法或其藥物組合物和它們?cè)谥苽涠募っ?IV(DPP-IV)抑制劑藥物上的用途。
背景技術(shù)：
：二肽基肽酶-IV(DipeptidylPeptidase,DPP-IV,EC3.4.14.5)是一個(gè)絲氨酸蛋白酶，從含有L-脯氨酸和L-丙氨酸的多肽N端倒數(shù)第二位水解N端二肽。通過增強(qiáng)腸促胰島素活性發(fā)揮作用，屬于非胰島素治療藥物。DPP-IV抑制劑無體重增加和水腫等不良反應(yīng)。PCT/CN2015/080570專利申請(qǐng)公開了新的吡喃衍生物(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃基-3-胺，結(jié)構(gòu)式如式(A)。該結(jié)構(gòu)顯示對(duì)DPP-IV具有良好的抑制作用，具有用于預(yù)防和/或治療II型糖尿病的潛能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明主要目的在于提供吡喃衍生物：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃基-3-胺的鹽或其鹽的水合物及其晶型。在本發(fā)明藥物或其組合物的制備中，其鹽或其鹽的水合物及其晶型比游離堿化合物具有更好的穩(wěn)定性，耐高溫、高濕及強(qiáng)光照，使其更適于藥物劑型的制備。本發(fā)明涉及一種式(I)所示化合物的鹽或其鹽的水合物：本發(fā)明優(yōu)選方案，式(I)所示化合物的鹽或其鹽的水合物為式(II)結(jié)構(gòu)：其中，HA為藥學(xué)上可接受的酸，比如鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸；n選自1或2；m選自0～3。本發(fā)明優(yōu)選方案，HA選自鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸。本發(fā)明優(yōu)選方案，當(dāng)HA選自鹽酸、磷酸或?qū)妆交撬釙r(shí)，n選自1或2；當(dāng)HA選自苯甲酸、檸檬酸或富馬酸時(shí)，n選自1。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種式(III)所示的化合物：其中，m選自1～3。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜在以下2θ位置具有特征衍射峰：6.7°±0.2°、13.8°±0.2°、14.5°±0.2°、24.2°±0.2°和27.9°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜還在以下2θ位置具有特征衍射峰：14.0°±0.2°、16.5°±0.2°、17.8°±0.2°、19.3°±0.2°、20.3°±0.2°和21.0°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜還在以下2θ位置具有特征衍射峰：13.4°±0.2°、15.4°±0.2°、22.7°±0.2°、24.5°±0.2°和25.0°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的晶型I的X-射線粉末衍射圖譜基本如圖1所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的差示掃描量熱熱分析圖基本如圖2所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的熱重分析曲線基本如圖3所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物，m＝3。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的如上所述鹽或其鹽的水合物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供通式(I)所示的化合物的鹽或其鹽的水合物，或通式(II)或通式(III)所述化合物，或如上所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療糖尿病和/或糖尿病并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎病中的一種或多種。優(yōu)選地，所述糖尿病包括II型糖尿病。本發(fā)明還提供一種治療代謝性疾病的方法，所述方法包括給藥本發(fā)明任意所述的鹽或其鹽的水合物，或前述藥物組合物。本發(fā)明化合物的合成方法為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明化合物可以由以下方案制備而得：式(IV)化合物與HA反應(yīng)得到式(II)；或式(V)化合物與HA反應(yīng)得到式(II)；其中，HA選自鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸；n選自1或2；m選自0～3；P為氨基保護(hù)基。優(yōu)選地，HA選自鹽酸、磷酸、苯甲酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸。更優(yōu)選地，HA為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％～37％的鹽酸。通式(IV)化合物或者通式(V)化合物可用溶劑溶解后，加入HA酸進(jìn)行反應(yīng)，其中：溶劑可以是一切能夠溶解通式(IV)化合物或者通式(V)化合物的溶劑，比如乙醇；反應(yīng)在0～90℃均可以。反應(yīng)得到的產(chǎn)物純度高，作為選擇，得到的產(chǎn)物還可以進(jìn)一步重結(jié)晶。重結(jié)晶時(shí)，產(chǎn)物可以選擇離子水與乙醇的混合液溶解，加熱溶解后，用合適的析晶溶劑析出產(chǎn)物，所述的析晶溶劑，比如醋酸異丙酯、乙酸乙酯、異丙醚或甲基叔丁基醚。本發(fā)明的反應(yīng)根據(jù)TLC或者HPLC等本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法跟蹤反應(yīng)進(jìn)度。本發(fā)明二鹽酸鹽水合物合成中，鹽酸與游離堿化合物的摩爾比例為3:1至10:1。本發(fā)明中參與反應(yīng)的酸一般在0℃～室溫條件下滴加到反應(yīng)體系，可以在0℃以下滴加。除非有相反的陳述，本發(fā)明中使用的術(shù)語具有下述含義。本發(fā)明所述基團(tuán)和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素，及本發(fā)明所述基團(tuán)和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素任選進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)它們對(duì)應(yīng)的同位素所替代，其中碳的同位素包括12C、13C和C14，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又稱為重氫)、氚(T，又稱為超重氫)，氧的同位素包括16O、17O和18O，硫的同位素包括32S、33S、34S和36S，氮的同位素包括14N和15N，氟的同位素19F，氯的同位素包括35Cl和37Cl，溴的同位素包括79Br和81Br。本文所述化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，并且由此可以以外消旋物、外消旋混合物、單一對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體混合物和單一非対映異構(gòu)體存在?！坝行┝俊爸敢鸾M織、系統(tǒng)或受試者生理或醫(yī)學(xué)翻譯的化合物的量，此量是所尋求的，包括在受治療者身上施用時(shí)足以預(yù)防受治療的疾患或病癥的一種或幾種癥狀發(fā)生或使其減輕至某種程度的化合物的量。“IC50”指半數(shù)抑制濃度，指達(dá)到最大抑制效果一半時(shí)的濃度。數(shù)值范圍a～b表示從數(shù)a到數(shù)b的任意數(shù)，比如，“m選自1～3”表示m可以選自1至3任意的數(shù)值。本發(fā)明晶型結(jié)構(gòu)可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種分析技術(shù)分析，包括但不限于，X-射線粉末衍射(XRD)、示差掃描熱法(DSC)和/或熱重法(TG)。熱重分析(ThermogravimetricAnalysis，TGA)，又叫熱重法(Thermogravimetry，TG)。附圖說明圖1是化合物1在80℃干燥16小時(shí)所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖2是化合物1在80℃干燥16小時(shí)所得的晶型I的差示掃描量熱(DSC)熱分析圖。圖3是化合物1在80℃干燥16小時(shí)所得的晶型I的熱重(TG)曲線-微熵?zé)嶂胤治?DTG)曲線。圖4是化合物1在80℃干燥8小時(shí)所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖5是化合物1在60℃干燥10小時(shí)所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖6是化合物1在30℃干燥8小時(shí)所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖7A是由單晶衍射確定的化合物1的單晶中分子球棍模型；圖7B為與圖7A相對(duì)應(yīng)的由單晶確定的絕對(duì)構(gòu)型；圖7C為單晶中氫鍵示意圖(圖中O2～O4表示水分子)。圖8是實(shí)施例9中化合物1重結(jié)晶前的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖9是實(shí)施例9中化合物1重結(jié)晶后的晶型使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施過程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和特點(diǎn)，不作為對(duì)本案可實(shí)施范圍的限定。化合物的結(jié)構(gòu)是通過核磁共振(NMR)和/或質(zhì)譜(MS)來確定的。NMR的測(cè)定是用(BrukerADVANCEIII400)核磁儀，測(cè)定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)。MS的測(cè)定用(Agilent6120B(ESI))。HPLC的測(cè)定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(Zorba×SB-C18100×4.6mm)。薄層層析硅膠板使用煙臺(tái)黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺(tái)黃海硅膠200～300目硅膠為載體。無特殊說明，甲基叔丁基醚、四丁基溴化銨、氫化鈉、三氟乙酸購(gòu)買于成都市科龍化工試劑廠；二碳酸二叔丁基酯、N,N'-二羰基二咪唑、N,O-二甲基羥氨鹽酸鹽購(gòu)買于愛斯特(成都)醫(yī)藥技術(shù)有限公司；碳酸銫、N-羥基丁二酰亞胺、二苯亞甲基甘氨酸乙酯購(gòu)買于安耐吉化學(xué)；2,5-二氟溴苯購(gòu)買于上海德默醫(yī)藥科技有限公司；異丙基氯化鎂/氯化鋰四氫呋喃溶液購(gòu)買于百靈威科技有限公司；炔丙基苯磺酸酯、四丁基氟化銨、三(乙酰氧基)硼氫化鈉、四丁基六氟磷酸胺購(gòu)買于阿達(dá)瑪斯試劑公司；環(huán)戊二烯基雙(三苯基膦)氯化釕(II)購(gòu)買于ACROSorgainics；硼烷二甲硫醚購(gòu)買于韶遠(yuǎn)化學(xué)科技(上海)有限公司；過硼酸鈉購(gòu)買于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯{[(1R,2R)-(-)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](五氟苯磺酰)氨基}(對(duì)傘花烴)釕(II)購(gòu)買于Stremchemical；碘甲烷購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。氮?dú)夥帐侵阜磻?yīng)瓶連接一個(gè)約1L容積的氮?dú)鈿馇颉錃夥帐侵阜磻?yīng)瓶連接一個(gè)約2L容積的氫氣氣球。氫化反應(yīng)通常抽真空，充入氫氣，反復(fù)操作3次。實(shí)施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實(shí)施例中無特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫。室溫溫度為10℃～30℃。中間體1：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羰基四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中間體1)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate第一步：2-氨基戊基-4-炔酸乙酯(1B)ethyl2-aminopent-4-ynoate室溫下，將1A(50g,0.187mol)溶于甲基叔丁基醚(300mL)中，加入炔丙基苯磺酸酯(44g,0.224mol)和四丁基溴化銨(6.1g,0.019mol)，升溫至50℃，加入碳酸銫(121.8g,0.374mol)，于50℃溫度下反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液過濾，濾餅用甲基叔丁基醚(40mL×2)洗滌，合并有機(jī)相，旋蒸濃縮至一半體積，加入鹽酸溶液(3mol/L,100mL)，室溫下攪拌1小時(shí)，靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(70mL×2)萃取，收集水相，濃縮得到1B。第二步：2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-炔戊酸(1C)2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pent-4-ynoicacid將氫氧化鈉(33.7g,0.842mol)溶于水(100mL)，逐滴滴加至1B(26.4g,0.187mol)中，室溫下攪拌2小時(shí)，滴加二碳酸二叔丁基酯(45g,0.206mol)的甲基叔丁基醚(125mL)溶液，室溫下攪拌4小時(shí)。靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(80mL×2)洗滌，水相用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH約3，用甲基叔丁基醚(100mL×2)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，旋干，得到黃色油狀液體1C(33g,產(chǎn)率83％)。Msm/z(ESI):212.0[M-1]。第三步：(1-(甲氧基(甲基)氨基)-1-羰基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1D)tert-butyl(1-(methoxy(methyl)amino)-1-oxopent-4-yn-2-yl)carbamate將1C(33g,0.155mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(200mL)中，控制溫度小于10℃，加入N,N'-羰基二咪唑(32.58g,0.201mol)，0℃下反應(yīng)1小時(shí)，加入N,O-二甲基羥氨鹽酸鹽(19.6g,0.186mol)，室溫?cái)嚢柽^夜。向反應(yīng)液中逐滴加入水(150mL)，攪拌1小時(shí)，用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相依次用飽和碳酸氫鈉溶液(60mL×3)、飽和氯化鈉溶液(60mL×3)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1)，得到白色固體1D(35g,產(chǎn)率88.2％)。Msm/z(ESI):156.9[M-100]。第四步：(1-(2,5-二氟苯基)-1-羰基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1E)tert-butyl(1-(2,5-difluorophenyl)-1-oxopent-4-yn-2-yl)carbamate氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2,5-二氟溴苯(15.05g，78mmol)溶于干燥甲苯(50mL)中，冰鹽浴降溫至-10℃以下，逐滴加入異丙基氯化鎂/氯化鋰四氫呋喃溶液(66mL,1.3mol/L)，保持在-10℃左右攪拌1小時(shí)，滴加1D(10g,39mmol)的干燥四氫呋喃(100mL)溶液，保持溫度-10℃，加畢，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)，將溫度降至-10℃左右，逐滴加入飽和氯化銨溶液(40mL)，攪拌10分鐘，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH5～6，靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(50mL×2)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝50:1～8:1)，得到淡黃色固體1E(10.1g,產(chǎn)率83.5％)。Msm/z(ESI):210.1[M-100]。第五步：((1R,2S)-1-(2,5-二氟苯基)-1-羥基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1F)tert-butyl((1R,2S)-1-(2,5-difluorophenyl)-1-hydroxypent-4-yn-2-yl)carbamate將1E(16.07g,52mmol)溶于四氫呋喃(100mL)，加入三乙烯二胺(17.39g,155mmol)與氯{[(1R，2R)-(-)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](五氟苯磺酰)氨基}(對(duì)傘花烴)釕(II)(即RuCl(p-cymene)(R,R)-FSDPEN)(0.37g,0.52mmol)，逐滴加入甲酸(14.27g,310mmol)，加畢，于40℃反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液濃縮除去四氫呋喃和甲酸，向殘留物中加入水(60mL)和鹽酸(3mol/L,10mL)，用甲基叔丁基醚(90mL×3)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液(35mL×2)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝60:1～10:1)，得到淡黃色膠狀物1F(15.37g,產(chǎn)率95％)。Msm/z(ESI):334.2[M+23]。第六步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1G)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-3,4-dihydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1F(15.37g,49.4mmol)加熱條件下溶于N,N-二甲基甲酰胺(75mL)，加入四丁基六氟磷酸胺(2.49g,6.42mmol)、N-羥基丁二酰亞胺(2.84g,24.75mmol)、三苯基膦(0.86g,3.26mmol)和碳酸氫鈉(2.16g,25.69mmol)，氮?dú)庵脫Q三次，抽真空15分鐘，加入環(huán)戊二烯基雙(三苯基膦)氯化釕(II)(即CpRuCl(PPh3)2)(1.79g,2.47mmol)，氮?dú)庵脫Q三次，并抽真空15分鐘，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至85℃反應(yīng)過夜。向反應(yīng)液中加入水(300mL)和甲基叔丁基醚(200mL)，用硅膠過濾，濾液靜置后分液，水相用甲基叔丁基醚(90mL×2)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液(60mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝80:1～30:1)，得到淡黃色粉末固體1G(8.9g,產(chǎn)率57.9％)。Msm/z(ESI):256.2[M-56]。第七步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羥基四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1H)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-hydroxytetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1G(8.9g,28.6mmol)溶解于干燥甲基叔丁基醚(90mL)中，加入干燥甲苯(9mL)，溫度降至-10℃，逐滴加入硼烷二甲硫醚四氫呋喃溶液(2mol/L,35.9mL)，于0℃下反應(yīng)3.5小時(shí)。緩慢加入水(4mL)，逐滴加入氫氧化鈉溶液(1mol/L,89mL)，攪拌15分鐘，分批加入過硼酸鈉(13.2g,85.8mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(50mL×2)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(20mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，向殘留物中加入甲苯(50mL)，加熱至90℃溶解，將正己烷(200mL)滴加至反應(yīng)液中，析出白色固體，過濾，正己烷(30mL×2)洗滌濾餅，濃縮除去溶劑，得到白色固體粉末1H(7.9g，產(chǎn)率84％)。Msm/z(ESI):274.1[M-56]。第八步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羰基-四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中間體1)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-oxo-tetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1H(11.53g,35.03mmol)溶解于二氯甲烷(130mL)，降溫至0℃，將戴斯馬丁氧化劑(29.72g,70.06mmol)分批加至反應(yīng)液中，自然升至室溫反應(yīng)4小時(shí)。降溫至0℃，將飽和碳酸氫鈉溶液(60mL)滴加至反應(yīng)液中，攪拌20分鐘，過濾，濾液靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(60mL×3)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1-4:1)，得到白色晶狀粉末中間體1(10.85g,產(chǎn)率94.7％)。Msm/z(ESI):272.0[M-56]；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.29-7.13(m,4H),4.77–4.75(d,1H),4.22-4.12(d,2H),4.08-4.02(m,1H),2.75-2.70(m,2H),1.23(s,9H)。實(shí)施例1(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate第一步：2-乙氧基-2-亞氨基乙酸乙酯鹽酸鹽(1b)ethyl2-ethoxy-2-iminoacetatehydrochloride將氰基甲酸乙酯1a(9.9g,0.1moL)溶于干燥的乙醚(50mL)中，并加入干燥的無水乙醇(5.52g,0.12moL)，冰浴攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直至飽和(體系增重5g)并繼續(xù)攪拌2小時(shí)，過濾析出的白色固體，濾餅用無水乙醚(20mL×3)洗滌，真空干燥，得到白色固體1b(14g,產(chǎn)率77％)。第二步：5-叔丁基2-乙基3a,4,6,6a-四氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1c)5-tert-butyl2-ethyl3a,4,6,6a-tetrahydropyrrolo[3,4-d]imidazole-2,5(1H)-dicarboxy-late將叔丁基3,4-二胺基吡咯烷-1-羧酸酯鹽酸鹽(980mg,4.126mmoL)溶于六氟異丙醇(10mL)中，攪拌下加入1b(886mg,4.538mmoL)，50℃攪拌16小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮旋干，加入飽和食鹽水(50mL)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酯乙酯(50mL×2)萃取。收集水相，并用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值7～8，用乙酯乙酯(50mL×4)萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝20:1)，得到白色固體1c(700mg,產(chǎn)率60％)。MSm/z(ESI):284.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.64(S,2H),4.37-4.33(q,2H),3.72-3.69(d,2H),3.55-3.50(dd,2H),1.44(s,9H),1.40-1.37(t,3H)。第三步：5-叔丁基2-乙基4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1d)(2R,4R)-tert-butyl4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-2-(methoxymethyl)pyrrolidine-1-carboxylate將草酰氯(652.5mg,5.14mmoL)溶于干燥的二氯甲烷(15mL)中，用干冰丙酮浴降溫到-78℃，攪拌下滴加干燥的二甲基亞砜(803.96mg,10.29mmoL)，攪拌30分鐘。向反應(yīng)液中滴加1c(970mg,3.43mmoL)的二氯甲烷(5mL)溶液，繼續(xù)攪拌20分鐘。-78℃下滴加二異丙基乙胺(2.216g,17.15mmoL)，自然升到室溫反應(yīng)2小時(shí)。向反應(yīng)液中加入飽和氯化銨溶液(50mL)、飽和氯化鈉溶液(50mL)和二氯甲烷(50mL)，分液，水相用二氯甲烷用(50mL×3)萃取，合并有機(jī)相，飽和氯化鈉溶液(50mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)得到白色固體1d(520mg,產(chǎn)率54％)。MSm/z(ESI):282.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.54(s,2H),4.47(s,2H),4.46-4.41(q,2H),1.51(s,9H),1.44-1.41(t,3H)。第四步：5-叔丁基2-乙基1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1e)5-tert-butyl2-ethyl1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-2,5(1H)-dicarboxylate將1d(5.4g,19.2mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(110mL)中，加入碳酸鉀(3.3g,23.9mmoL)，冰浴下加入碘甲烷(3.4g,23.9mmoL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，向反應(yīng)液中加入飽和氯化銨溶液(300mL)，及飽和氯化鈉溶液(200mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合并有機(jī)相，用飽和氯化鈉溶液(200mL×3)洗滌。用無水硫酸鈉干燥，過濾，將濾液減壓濃縮，得到淺黃色固體1e(5.3g,產(chǎn)率94％)。第五步：叔丁基2-氨甲?；?1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1f)tert-butyl2-carbamoyl-1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxy-late將1e(2.3g,7.8mmol)，溶于氨-甲醇溶液(40mL,7mol/L,280mmol)中，升溫至85℃封管攪拌反應(yīng)20小時(shí)。將反應(yīng)液冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)洗滌，濾液濃縮后與濾餅合并，得到白色固體1f(1.914g,產(chǎn)率93％)。第六步：叔丁基2-氰基-1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1g)tert-butyl2-cyano-1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1f(1.576g,5.925mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(45mL)中，加入五氯化磷(1.482g,7.109mmol)，升溫至50℃反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(50mL)，飽和氯化鈉溶液(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有機(jī)相，分別用飽和食鹽水(50mL×3)、飽和碳酸氫鈉溶液(50mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，將濾液濃縮得到白色固體1g(1.25g,產(chǎn)率85％)。第七步：叔丁基1-甲基-2-(1H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1h)tert-butyl1-methyl-2-(1H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1g(1030mg,4.153mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入疊氮化鈉(810mg,12.459mmoL)及醋酸銨(960mg,12.459mmoL)，升溫至120℃反應(yīng)過夜。加入1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值1～2，加水(200mL)，過濾，濾液用二氯甲烷(50mL×3)萃取。合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，烘干得到黃色固體1h(1000mg,產(chǎn)率83％)。MSm/z(ESI):292.1[M+1]。第八步：叔丁基1-甲基-2-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1i-1)tert-butyl1-methyl-2-(2-methyl-2H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate叔丁基1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1i-2)tert-butyl1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1h(1000mg,3.436mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(25mL)中，冰浴下加入氫化鈉(165mg,4.124mmoL)，冰浴下攪拌0.5小時(shí)后加入碘甲烷(586mg,4.124mmoL)，自然升溫反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液緩慢加入碎冰(50g)中，加入氯化鈉使溶液飽和，乙酸乙酯(50mL×4)萃取。合并有機(jī)相，用飽和氯化鈉溶液(50mL×3)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝2:1～1:1)，得到白色固體1i-1(682mg,產(chǎn)率55％)和白色固體1i-2(230mg,產(chǎn)率18％)。MSm/z(ESI):306.1[M+1]。1i-1：1HNMR(400MHz,DMSO):δ4.58-4.54(d,2H),4.39-4.37(d,2H),4.33(s,3H),3.99(s,3H),1.47(s，9H)。1i-2：1HNMR(400MHz,DMSO):δ4.54-4.50(d,2H),4.44(s,3H),4.34-4.31(d,2H),3.92-3.91(m,3H),1.47(s，9H)。第九步：1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)-1,4,5,6-四氫吡咯并[3,4-d]咪唑二苯磺酸鹽(1j)1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-d]imidazoledibenzenesulfonate將1i-1(682mg,2.236mmoL)、苯磺酸.1.5H2O(827.3mg,4.472mmoL)溶于二氯甲烷(25mL)中，升溫至40℃反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液濃縮旋干，真空干燥得到1j(1165mg)，直接用下一步反應(yīng)。MSm/z(ESI):206.1[M+1]。第十步：叔丁基((2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸酯(1k)tert-butyl((2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1j(1165mg,2.236mmoL)及中間體1(804.4mg,2.459mmoL)溶于N,N-二甲基乙酰胺(10mL)中，室溫下攪拌0.5小時(shí)，冰浴下加入三(乙酰氧基)硼氫化鈉(1279mg,6.037mmoL)，0℃攪拌0.5小時(shí)后自然升至室溫?cái)嚢?小時(shí)。補(bǔ)加中間體1(400mg,1.223mmoL)及三(乙酰氧基)硼氫化鈉(400mg,1.887mmoL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)液加入飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)中，攪拌0.5小時(shí)，過濾，濾餅用水(20mL×3)洗滌后用二氯甲烷(100mL)溶解，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝60:1)，得到的粗產(chǎn)品用乙醚(50mL)溶解，加入正己烷(100mL)，過濾，得到黃色固體1k(480mg,產(chǎn)率42％)。MSm/z(ESI):517.1[M+1]。第十一步：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺(1l)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine將1k(440mg,0.853mmoL)加入二氯甲烷(5mL)中，冰浴下加入三氟乙酸(2mL)，自然升至室溫反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)液旋干，加入飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)調(diào)節(jié)pH值7～8，水相用二氯甲烷(30mL×4)萃取。合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝30:1,加入少量氨水)，得到黃色固體1l(134mg,產(chǎn)率38％)。MSm/z(ESI):417.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.23-7.06(m,3H),4.38(s,3H),4.32-4.26(m,2H),4.07-4.05(t,2H),4.03(s,3H),3.95-3.94(t,2H),3.46-3.41(t,1H),3.17-3.09(m,1H),2.96-2.90(m,1H),2.51-2.47(m,1H),1.58-1.49(q,1H)。第十二步：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate1l(16g,38.43mmol)和無水乙醇(80mL)依次加入反應(yīng)瓶中，將濃鹽酸(8mL)滴加到反應(yīng)液中，加畢于室溫?cái)嚢?0分鐘，反應(yīng)液中固體溶解完全，攪拌10分鐘后析出淺白色固體。將醋酸異丙酯(56mL)滴加到反應(yīng)液中，室溫繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)液過濾，濾餅用醋酸異丙酯(30mL×2)洗滌，抽干，真空干燥，得到灰白色固體化合物1(14g,收率85％)。圖2是所得化合物1在80℃干燥16小時(shí)所得的晶型I的差示掃描量熱(DSC)熱分析圖。圖3是化合物1在80℃干燥16小時(shí)所得的晶型I的熱重(TG)曲線-微熵?zé)嶂胤治?DTG)曲線?；衔?通過單晶衍射測(cè)定化合物1所含HCl個(gè)數(shù)為2。單晶培養(yǎng)：取約5mg樣品放于玻璃小瓶中，用300μL乙醇超聲溶清，室溫下小孔揮發(fā)，得到小塊狀晶體，將此晶體作為晶種加至樣品的乙醇飽和溶液中，小孔揮發(fā)，得到塊狀晶體。單晶衍射儀器信息和檢測(cè)方法參數(shù)如表1所示：表1熱臺(tái)偏正光顯微鏡信息和檢測(cè)方法參數(shù)如表2所示：表2所得晶胞參數(shù)如下表3所示：表3單晶結(jié)構(gòu)信息表圖7A是由單晶衍射確定的化合物1的單晶中分子球棍模型；圖7B為與圖7A相對(duì)應(yīng)的由單晶確定的絕對(duì)構(gòu)型；圖7C為單晶中氫鍵示意圖(圖中O2～O4表示水分子)，從圖7A～7C可知，一個(gè)API分子結(jié)合3個(gè)水分子，其中含O2的水分子與API分子通過氫鍵連接，比較穩(wěn)定，為結(jié)晶水；含O3和O4的兩個(gè)水分子處于游離的狀態(tài)，容易失去，但是對(duì)晶胞性狀不影響。實(shí)施例2(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate室溫下，1k(133g,0.257mol)和乙醇(864.5mL)依次加入反應(yīng)瓶中，將濃鹽酸(146.3mL)滴加到反應(yīng)液中，加畢于60℃～70℃反應(yīng)3小時(shí)。將醋酸異丙酯(296.2mL)滴加到反應(yīng)液中，自然冷卻到室溫，析出淺白色固體。過濾，濾餅用醋酸異丙酯(300mL×2)洗滌，抽干，真空干燥，得到灰白色固體化合物1(102g,收率80％)。實(shí)施例1或?qū)嵤├?中化合物1因真空干燥的溫度、時(shí)間不同，得到的水合物所含的水分子含量也不同，即包含的水分子個(gè)數(shù)不同，m值不同，見表4。表4化合物1經(jīng)不同溫度和干燥時(shí)間干燥后的含水量圖1所示為80℃干燥溫度、干燥16小時(shí)的X-粉末衍射圖，圖4所示為80℃干燥溫度、干燥8小時(shí)的X-粉末衍射圖，圖5所示為60℃干燥溫度、干燥10小時(shí)的X-粉末衍射圖，圖6所示為30℃干燥溫度、干燥8小時(shí)的X-粉末衍射圖。由此可知，雖然實(shí)施例1和實(shí)施例2中的水分子含量因真空干燥的溫度和時(shí)間不同而不同，但是其X-粉末衍射的圖基本一致，故本發(fā)明認(rèn)為含有1～3摩爾水的(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽都得到I型結(jié)晶。實(shí)施例3(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-對(duì)甲苯磺酸鹽(化合物2)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine4-methylbenzenesulfonate室溫下，將1l(2.0g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(60mL)中，加入反應(yīng)瓶，將對(duì)甲苯磺酸一水合物(0.912g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物2(2.5g,產(chǎn)率88.6％，HPLC純度99.5％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.01(s,3H),7.49(d,2H),7.38-7.33(m,3H),7.12(d,2H),4.55(d,1H),4.34(s,3H),4.21(m,1H),4.06-3.99(m,4H),3.87(m,2H),3.60(m,1H),3.41(m,2H),3.11(m,1H),2.50(m,1H),2.29(s,3H),1.72(m,1H)。實(shí)施例4(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-二對(duì)甲苯磺酸鹽(化合物3)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminebis(4-methylbenzenesulfonate)室溫下，將1l(2.0g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(60mL)中，加入反應(yīng)瓶，將對(duì)甲苯磺酸一水合物(1.824g,9.6mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物3(3.1g,產(chǎn)率85％，HPLC純度99.63％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.19(s,3H),7.49-7.47(m,4H),7.38-7.35(m,3H),7.11(d,4H),4.75-4.52(m,5H),4.41-4.34(m,4H),4.03(m,4H),3.67-3.62(m,2H),2.70(m,1H),2.27(s,6H),2.00(m,1H)。實(shí)施例5(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-磷酸鹽(化合物4)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminephosphate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應(yīng)瓶，將磷酸(0.693g,6mmol，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物4(1.6g,產(chǎn)率52％，HPLC純度99.53％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.78(brs,5H),7.37-7.28(m,3H),4.50-4.37(m,1H),4.34(s,3H),4.19-4.16(m,1H),4.04-3.98(m,5H),3.86(m,2H),3.41-3.36(m,2H),3.10-3.05(m,1H),2.54(m,1H),1.70-1.67(m,1H)。實(shí)施例6(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-苯甲酸鹽(化合物5)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminebenzoate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應(yīng)瓶，將苯甲酸(0.733g,6mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物5(2.1g,產(chǎn)率62％，HPLC純度99.76％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.95(d,2H),7.60(d,1H),7.49(t,2H),7.27-7.20(m,3H),4.34(s,3H),4.19-4.14(m,2H),4.03-3.98(m,5H),3.84(m,2H),3.30(t,1H),3.01-2.98(m,2H),2.35(d,1H),1.49-1.40(m,1H)。實(shí)施例7(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-檸檬酸鹽(化合物6)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應(yīng)瓶，將檸檬酸(1.152g,6mmol)溶于乙醇(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物6(3.2g,產(chǎn)率87.7％，HPLC純度99.47％)。1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.36-7.20(m,3H),4.67-4.65(m,1H),4.39-4.35(m,4H),4.15-4.09(m,2H),4.05-4.00(m,5H),3.59-3.54(m,2H),3.30-3.27(m,1H),2.86-2.72(m,4H),2.72-2.65(m,1H),1.87-1.81(m,1H)。實(shí)施例8(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-富馬酸鹽(化合物7)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminefumarate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應(yīng)瓶，將富馬酸(0.696g,6mmol)溶于甲醇(20mL)中，滴加到上述反應(yīng)液，滴加完畢室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物7(2.3g,產(chǎn)率72％，HPLC純度99.62％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.31-7.23(m,3H),6.54(s,2H),4.34(m,4H),4.18-4.15(m,1H),3.99-3.98(m,5H),3.85(m,2H),3.33(t,1H),3.17-3.12(m,1H),3.05-3.00(m,1H),2.45(m,1H),1.60-1.52(m,1H)。實(shí)施例9化合物1重結(jié)晶將化合物1(53g,0.108mol)、去離子水(53mL)和無水乙醇(106mL)依次加入反應(yīng)瓶中，加畢升溫至80℃，待固體溶解完全，加入活性炭(5.3g)，加畢，80℃下攪拌30分鐘，趁熱過濾，濾餅用熱無水乙醇(26.5mL)洗滌。合并濾液，將醋酸異丙酯(344.5mL)滴加到濾液中，自然冷卻至室溫，析出白色固體，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，過濾，濾餅用醋酸異丙酯(60mL×2)洗滌，抽干，真空干燥(80℃，16小時(shí))，得到精制后的化合物1(45g,收率84.9％)。重結(jié)晶后化合物1晶型沒有發(fā)生改變，重結(jié)晶前與重結(jié)晶后通過XRD圖譜對(duì)比晶型一致。重結(jié)晶前XRD圖譜為圖8。重結(jié)晶前XRD圖譜為圖9。實(shí)施例10溶解度研究樣品：化合物1(由表4中序號(hào)1條件得到)、化合物1l。實(shí)驗(yàn)：取2mL生理鹽水和2mL0.5％CMC-Na溶液分別加入于BD離心管中，逐次加入樣品，每次加入樣品后在37℃水浴中加熱并強(qiáng)力振搖或超聲。待加入一定量樣品后溶液變渾濁，在37℃水浴中加熱30分鐘并強(qiáng)力振搖或超聲也不能使渾濁現(xiàn)象消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5溶解度結(jié)論：化合物1相對(duì)于化合物1l在生理鹽水和0.5％CMC-Na溶液中的溶解度均顯著提高。實(shí)施例11穩(wěn)定性研究樣品：化合物1l、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6和化合物7。實(shí)驗(yàn)：取化合物1l、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7分別在高溫(40℃和60℃)、高濕(RH75％和RH92.50％)、光照(5500±500lx)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，0天、10天、12天、14天、20天或30天的HPLC檢測(cè)純度(百分?jǐn)?shù)表示)，檢測(cè)條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6～9。HPLC檢測(cè)純度條件為：色譜柱：XselectCSHC18(4.6×150mm,3.5um)；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；流動(dòng)相：按表3進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0mL/min；其中A相為10mmol/L磷酸氫二鉀(pH＝10.95)，B相為甲醇。表6HPLC流動(dòng)相T(min)0.014.0014.0020.0026.0030.0030.0137.00A(％)7070404010107070B(％)3030606090903030表7化合物1與化合物1l的穩(wěn)定性對(duì)比表8化合物1的穩(wěn)定性表9化合物2-7的穩(wěn)定性結(jié)論：化合物1無論在高溫、高濕還是光照條件下，10天后純度基本沒有變化，相比其游離堿化合物1l，穩(wěn)定性明顯提高。同時(shí)，化合物1在高溫、高濕還是光照條件下，12天或30天后純度基本沒有變化，穩(wěn)定性良好?；衔?、化合物3無論在高溫、高濕還是光照條件下，14天或20天后純度基本沒有變化，穩(wěn)定性良好。實(shí)施例12DPP-IV體外酶活測(cè)定利用重組人DPP-IV和H-Ala-Pro-AFC的酶學(xué)反應(yīng)測(cè)定本發(fā)明化合物的DPP-IV體外酶活。按照DPP-IVFluorescentActivityAssayKit(BPSBioscience)配制緩沖液、待測(cè)樣品工作液、DPP-IV酶稀釋液和AFC底物稀釋液。準(zhǔn)備96孔板，每孔先加入80μL緩沖液，之后加入5μLDPP-AFC-底物。再加入不同濃度待測(cè)樣工作液，每孔5μL，空白組加入5μL緩沖液。最后在測(cè)試組對(duì)照中加入10μLDPP-IV酶，空白對(duì)照組中加入10μL緩沖液。用Origin7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到各測(cè)試化合物的IC50值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。表10DPP-IV體外酶活測(cè)定結(jié)果序號(hào)化合物編號(hào)IC50(nM)1化合物11.372化合物22.023化合物32.114化合物42.225化合物51.806化合物61.577化合物71.90結(jié)論：本發(fā)明化合物具有明顯的DPP-IV酶的抑制活性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3