一種利用Caco-2細(xì)胞分析腸道可吸收乳清肽序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類多肽序列分析方法的建立，尤其是一種腸道可吸收乳清肽序列分 析方法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳清蛋白是干酪以及干酪素生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，其含量占牛乳中蛋白質(zhì)含量的 18%~20%。利用蛋白酶水解乳清蛋白制備生物活性肽是目前乳清開(kāi)發(fā)的一個(gè)方向。生物 活性肽是一類具有生理活性寡肽的統(tǒng)稱，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳清蛋白來(lái)源的生物活性肽有降血壓 肽、促礦物元素吸收肽、嗎啡肽等。這些生物活性肽在被吸收進(jìn)入人體后能發(fā)揮生理調(diào)節(jié)活 性，因此，乳蛋白來(lái)源的生物活性肽有著巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0003] 然而，生物活性肽口服吸收生物利用度低是限制其發(fā)展的主要因素，小腸是物質(zhì) 吸收的主要場(chǎng)所，也是生物活性肽吸收的主要屏障，活性肽經(jīng)人體口服后，要以完整形式穿 越小腸上皮細(xì)胞進(jìn)入人體體液循環(huán)，才能達(dá)到生物學(xué)功效。目前研究認(rèn)為，多肽能否以完整 形式由小腸轉(zhuǎn)運(yùn)至血液，與多肽鏈長(zhǎng)度、肽的氨基酸組成、親疏水性、帶電性均有一定關(guān)系， 但現(xiàn)在還沒(méi)有完全定論，如現(xiàn)在普遍認(rèn)為二肽和三肽能完整的吸收，三肽以上的多肽能否 完整吸收還存在爭(zhēng)議。因此，大于三肽的生物活性肽也可能不被小腸吸收，但是現(xiàn)在還沒(méi)有 明確的方法來(lái)研究能夠被小腸完整吸收多肽的序列特征。
[0004] Caco-2細(xì)胞模型于20世紀(jì)70年代首次分離自人類結(jié)、直腸癌細(xì)胞，培養(yǎng)成熟的 Caco-2細(xì)胞即可形成與人體小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和致密的單細(xì)胞層組織，其形態(tài) 和功能上與人體的小腸上皮細(xì)胞相似。在腸腔側(cè)分化出絨毛面AP側(cè)(apical，腸腔側(cè)，又稱 黏膜劑)和基底面BL側(cè)(basolateral，腸內(nèi)壁側(cè)，又稱漿膜劑KAP側(cè)含有典型的小腸微絨毛 水解酶和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，Caco-2細(xì)胞現(xiàn)已被廣泛用于藥物口服吸收的體外篩選 模型。目前關(guān)于利用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行活性肽的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)只是合成某一種生物活性肽然后進(jìn) 行腸道轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其吸收狀況及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，并無(wú)利用Caco-2細(xì)胞模型研究腸道可吸收 乳清肽的序列的方法。
[0005] 因此，本發(fā)明建立了一種以Caco-2細(xì)胞模型，分析腸道可吸收乳清肽序列的方法， 該方法了解到能夠由完整形式順利由小腸轉(zhuǎn)運(yùn)至血液的多肽結(jié)構(gòu)特征后，能更具針對(duì)性地 篩選口服吸收生物利用度高的生物活性肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種腸道可吸收乳清肽序列的分析方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:a)利用具有特異性酶切位點(diǎn)的蛋 白酶水解乳清蛋白；b)水解結(jié)束后酶解液加熱滅酶活，離心取上清液為粗乳清肽(A) ;c)步 驟b)中的粗乳清肽(A)用截留分子量為1000 ODa的中空纖維超濾膜超濾，得到乳清肽超濾液 (B )，冷凍干燥備用;d)步驟c)中的乳清肽超濾液(B)用蒸餾水溶解后，經(jīng)過(guò)Sephadex G-10 凝膠過(guò)濾層析，收集各個(gè)分離組分得到純化乳清肽(C)，冷凍干燥備用;e)構(gòu)建Caco-2細(xì)胞 轉(zhuǎn)運(yùn)模型;f)步驟d)中分離得到的純化乳清肽(C)進(jìn)行Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，收集Caco-2細(xì) 胞基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)乳清肽(D) ;g)步驟f)中Caco-2細(xì)胞基底側(cè)(BL側(cè))轉(zhuǎn)運(yùn)乳清肽(D)用UPLC-MS 分析肽序列。
[0008]步驟a)具體包括以下步驟：
[0009] al)乳清濃縮蛋白粉WPC-80溶于蒸餾水，質(zhì)量濃度為6%，在65°C下恒溫加熱15~ 30min，使其充分溶解；
[0010] a2)乳清蛋白溶液溶解后降至各具有特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶酶解最適溫度，調(diào) 節(jié)乳清蛋白溶液PH至各具有特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶最適水解pH值，分別加入具有特異性 酶切位點(diǎn)的蛋白酶進(jìn)行水解，添加的各具有特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶量與乳清蛋白粉比為 3%(W/W)，酶解時(shí)間為2h。
[0011] 特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶包括堿性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。
[0012] 特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶酶解最適溫度，堿性蛋白酶的最適酶解溫度為55°C，胰 蛋白酶的最適酶解溫度為45°C，糜蛋白酶的最適酶解溫度為50°C，所述的具有特異性酶切 位點(diǎn)的蛋白酶酶解最適pH，堿性蛋白酶的最適酶解pH為8.5，胰蛋白酶的最適酶解pH為7.5， 糜蛋白酶的最適酶解pH為8.5。
[0013] 步驟c)中空纖維超濾膜截留分子量為1000 ODa，超濾膜壓力為0.1-0.4Mpa，流速為 5_10mL/min〇
[0014] 步驟d)凝膠過(guò)濾層析為Sephadex G-IO，上樣體積為2.5mL，上樣質(zhì)量濃度為30mg/ mL，蒸餾水為洗脫液，洗脫速度為2mL/min。
[0015]步驟e)具體包括以下步驟：
[0016] el )Cac〇-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的、含青霉素80U/mL、鏈霉素0 · 08mg/mL的DMEM 培養(yǎng)液，37°C，5 % C〇2培養(yǎng)箱，隔天換一次培養(yǎng)液，直至下一次傳代；
[0017] e2)用DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以密度2X105cells/mL接種于12孔Transwell板 的濾I旲上；
[0018] e3) 24h后換培養(yǎng)液，前7天隔天換液，之后每天換液，培養(yǎng)21天；
[0019] e 4 ) 2 1天后測(cè)定C a c 〇 - 2細(xì)胞模型的各評(píng)價(jià)指標(biāo)，跨上皮細(xì)胞電阻 (transepithelium electrical resistance，TEER)，堿性磷酸酶活力，焚光素鈉滲漏實(shí)驗(yàn)。
[0020] 步驟f)用HANKS緩沖液清洗Caco-2細(xì)胞，在絨毛面AP側(cè)加入由HANKS緩沖液配制的 純化乳清肽(C) 0.5mL，乳清肽(C)質(zhì)量濃度為IOmg/mL，在BL側(cè)加入HANKS緩沖液1.5mL，置于 37°C，5%C02培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)運(yùn)Ih，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)束后，BL側(cè)取出轉(zhuǎn)運(yùn)乳清肽(D)，經(jīng)0.22μπι的水系濾膜 過(guò)濾后冷凍干燥。
[0021] 純化乳清肽（C)包括堿性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶酶解乳清蛋白后經(jīng)超濾、 Sephadex G-10分離后組分。
[0022] 步驟g)所述超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)采用的是液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行 時(shí)間質(zhì)譜儀，分析條件如下：
[0023] gl)液相色譜分析柱為ACQUITY UPLC BEH130C18柱（2.1\15〇11111，1.7以111)，流動(dòng)相八 為100 %乙腈，流動(dòng)相B為0.1 %甲酸，柱溫45°C，檢測(cè)波長(zhǎng)204nm，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量8μ L；
[0024] g2)質(zhì)譜條件為干燥氣和霧化氣Ν2,離子方式ESI+，毛細(xì)管電壓3.5kVolts，錐孔電 壓30V〇1 ts，脫溶劑氣體溫度300°C，離子源溫度100°C，脫溶劑氣體流量5001 i t/hr，錐孔氣 體流量(17!^)501丨以1^，碰撞能量6/35￥〇^8，質(zhì)量范圍100~1500111/2，檢測(cè)電壓1600~ 1700Volts〇
[0025] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0026] (1)多肽肽鏈長(zhǎng)度、多肽N端和C端的氨基酸組成等會(huì)影響多肽小腸的完整吸收。因 此，本發(fā)明利用具有特異性酶切位點(diǎn)的蛋白酶，包括堿性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分別 酶解乳清蛋白，水解液而后通過(guò)超濾、Sephadex G-IO凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行分離，可制備獲得 酶切位點(diǎn)、分子量、親疏水性和靜電荷各不相同的乳清肽。
[0027] (2)本發(fā)明以Caco-2細(xì)胞為腸道吸收模型將各蛋白酶酶解制備所得的乳清肽進(jìn)行 腸道轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，Caco-2細(xì)胞是一種預(yù)測(cè)藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)體 外篩選工具，在本發(fā)明中，Caco-2細(xì)胞用于腸道可吸收乳清肽的生物分離，通過(guò)Caco-2細(xì)胞 分離純化得到腸道完整吸收的多肽。
[0028] (3)本分明使用的超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC-MS分析鑒定轉(zhuǎn)運(yùn)出乳清肽氨基酸 序列，分辨率高。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，能由腸道完全轉(zhuǎn)運(yùn)的乳清肽多為五肽以下的小分子多 肽，其中二肽數(shù)量最多，其次為三肽和四肽，五肽數(shù)量很少；中性肽，疏水性較強(qiáng)的多肽能夠 較好地由小腸順利轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0029] (4)多肽口服利用度低，腸道不能完整吸收是多肽產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題，也是多 肽應(yīng)用于功能性食品市場(chǎng)和藥品市場(chǎng)的當(dāng)務(wù)之急。該方法建立了一套利用Caco-2細(xì)胞吸收 模型分析腸道可吸收乳清肽序列的方法，該發(fā)明也可以分析其它腸道可吸收多肽的序列， 而后通過(guò)構(gòu)建模擬酶切多肽庫(kù)，控制水解度等方式得到口服吸收利用度高的多肽，或進(jìn)行 生物活性肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可拓展乳、功能性食品及新藥開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域，對(duì)人類健康事業(yè)的發(fā)展 具有較大的促進(jìn)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為利用Caco-2細(xì)胞分析腸道可吸收乳清肽序列的方法步驟；
[0031] 圖2為堿性蛋白酶酶解乳清蛋白水解物經(jīng)G-IO分離后的峰1(樣品1)的總離子流圖 (TIC)圖；
[0032] 圖3為堿性蛋白酶酶解乳清蛋白水解物經(jīng)G-IO分離后的峰2(樣品2)的總離子流圖 TIC 圖；
[0033] 圖4為胰蛋白酶酶解乳清蛋白水解物經(jīng)G