專利名稱：抗Bv8抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明關(guān)注抗BvS抗體及其用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在完全確立了涉及自已有的內(nèi)皮形成新血管的血管發(fā)生參與多種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些包括實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管綜合征諸如增殖性視網(wǎng)膜病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman et al. , J. Biol. Chem. , 267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al. , Annu. Rev.Physiol.，53:217-239(1991);及 Garner A.，"Vascular diseases^, In:Pathobiology ofOcular Disease. A Dynamic Approach, Garner A. , Klintworth GK, eds. , 2nd Edition(Marcel Dekker, NY,1994), pp 1625-1710。在腫瘤生長(zhǎng)的情況中，血管發(fā)生對(duì)于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman et al.，Nature, 339:58 (1989)。新血管形成(neovascularization)讓腫瘤細(xì)胞獲得了與正常細(xì)胞相比的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自治。腫瘤通常開(kāi)始于單個(gè)異常細(xì)胞， 由于與可利用毛細(xì)管床的距離，該細(xì)胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長(zhǎng)的一段時(shí)間里保持“休眠”狀態(tài)而不進(jìn)一步生長(zhǎng)和傳播。有些腫瘤細(xì)胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細(xì)胞，所述內(nèi)皮細(xì)胞增殖并成熟成新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner et al. , N. Engl. J. Med, 324:1-6 (1991) ;Horak et al. , Lancet, 340:1120-1124(1992) ;Macchiarini et al.，Lancet, 340:145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機(jī)制，但是認(rèn)為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡(Folkman, 1995, Nat Med I (I) :27-31)。血管發(fā)育過(guò)程受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周圍細(xì)胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已鑒定為涉及刺激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。Ferrara etal.，Endocr. Rev.，18:4-25(1997)。甚至單個(gè)VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物。Ferrara et al.，Endocr.Rev.,見(jiàn)上文。VEGF mRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過(guò)表達(dá)。Berkman et al. , J. Clin.Invest.，91:153-159 (1993);Brown et a1. , Human Pathol.，26:86-91 (1995);Brownet al., Cancer Res.，53:4727-4735 (1993) ;Mattern et al., Brit. J. Cancer,73:931-934(1996);Dvorak et al.，Am. J. Pathol.，146:1029-1039(1995)。已經(jīng)顯示了 Bv8誘導(dǎo)腎上腺皮層毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活和遷移(LeCouter, J. et al. , Proc Natl Acad Sci USA 100,2685-2690(2003)) Bv8 和 EG-VEGF是兩種高度相關(guān)的分泌蛋白，也稱作prokineticin-Ι和-2,它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上屬于由五個(gè)二硫橋基序(稱作共脂肪酶/輔脂肪酶折疊)限定的一個(gè)較大的肽類別(DeCouter，J.et al. , Nature 420,860-867(2002) ;LeCouter, J. et al.,Proc Natl Acad Sci USA100, 2685-2690(2003);Li,M.et al. , Mol Pharmacol 59，692-698 (2001))。Bv8 最初被鑒定為來(lái)自娃Bombina variegate皮膚的分泌蛋白(Mollay, C. et al. , Eur JPharmacol 374，189-196 (1999))。Bv8的克隆和表達(dá)記載于2003年3月13日公布的TO 03/020892。Bv8和EG-VEGF結(jié)合兩種高度相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，EG-VEGF/PKR-1(Rl)和 EG-VEGF/PKR-2(R2)(Masuda, Y et al. , Biochem Biophys ResCommun 293,496-402(2002);Lin, D. C. et al. , J Biol Chem 277,19276-19280(2002)) EG-VEGF和Bv8被表征為對(duì)特定內(nèi)皮細(xì)胞類型選擇性的絲裂原(LeCouter，J. etal. , Nature 412(6850):877-84(2001);LeCouter, J. et al. , Proc Natl Acad Sci USA100，2685-2690(2003))。已經(jīng)將其它活性歸于這個(gè)家族，包括傷害感受(Mo I lay，C. etal.,見(jiàn)上文)、胃腸道運(yùn)動(dòng)(Li，M.et al.,見(jiàn)上文)、晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)節(jié)律的調(diào)節(jié)(Cheng, M.Y. , et al. , Nature 417，405-410 (2002))和嗅球神經(jīng)發(fā)生(Matsumoto, S.，et al. , ProcNatl Acad Sci USA 103，4140-4145 (2006))。另外，Bv8在體外刺激粒細(xì)胞和單核細(xì)胞集落的生成(LeCouter, J. et al. , (2003),見(jiàn)上文;Dorsch, M. et al. , J. Leukoc Biol78 (2) ,426-34 (2005))。Bv8已經(jīng)被表征為巨噬細(xì)胞的化學(xué)引誘物(LeCouter et al. , ProcNatl Acad Sci USA 101,16813-16919(2004))。鑒于血管發(fā)生在許多疾病和病癥中的作用，希望有降低或抑制一種或多種引起這些過(guò)程的生物學(xué)效應(yīng)的手段。通過(guò)述及完整收錄本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和出版物。 發(fā)明概述本發(fā)明部分基于多種針對(duì)BvS的抗體。BvS作為一種重要且有利的治療靶，而且本發(fā)明提供抗體，作為治療劑和診斷劑，供靶向與BvS表達(dá)和/或活性有關(guān)的病理狀況中使用。因而，本發(fā)明提供涉及BvS的方法、組合物、試劑盒和制品。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中所述抗體包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 為 L 或 R ;且 X3 為 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 C、S 或 T ；X3為 A、L、N、S 或T ;X4 為 A、E 或 S 表為1、L、S*TjP(vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 hvr-h3，其中 X1 為 g 或 s。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體包含下述三種HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 為 L 或 R ;且 X3 為 S 或 T ;和(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ;及人VL卡帕亞組IV共有框架序列SEQ ID NO :240。在某些實(shí)施方案中，該抗BvS抗體包含下述三種HVR序列⑴包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;(ii)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 C、S 或 T ;X3 為 A、L、N、S 或T ;X4 為 A、E 或 S ;X5 為1、L、S*TjP(iii)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 為 G 或 s ;及人VH亞組I共有框架序列SEQ ID NO :241。在某些實(shí)施方案 中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 為 L 或 R ;且 X3 為 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 C、S 或 T ;X3 為 A、L、N、S 或T ;X4 為 A、E 或 S ;X5 為1、L、S*TjP(vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 為 G 或 S。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比在VL位置28和29之一或二者處進(jìn)一步包含突變。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比在VH位置52a處進(jìn)一步包含突變。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比在VH位置54處進(jìn)一步包含突變。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比在VH位置95和96之一或二者處進(jìn)一步包含突變。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比(I)在VL位置28和29之一或二者處；和/或(2)在VH位置52a處；和/或⑶在VH位置54處；和/或⑷在VH位置95和96之一或二者處進(jìn)一步包含突變。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體與鼠/嵌合抗Bv8抗體相比在VH位置96處進(jìn)一步包含突變且在VH位置95處不含突變。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段為，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO :49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含選自 SEQID NO :50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO :51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQID NO :52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含選自 SEQ ID NO :53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含選自 SEQ ID NO :54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列和人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，人VL卡帕亞組IV共有框架序列減去三個(gè)輕鏈HVR序列為SEQ IDN0:240。在某些實(shí)施方案中，VH亞組I共有框架序列減去三個(gè)重鏈HVR序列為SEQ ID NO:241。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 F、
G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H或 V ;且X5 為 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 為 N 或 Y ;X2 為 L 或 R ;且 X3 為 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;
(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 S 或 T ;X3 為A、L、S 或T ;X4 為 A、E 或 S ;父5為1、L、S 或 T ;和(vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，該抗BvS抗體包含下述三種HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 F、
G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H或 V ;且X5 為 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或 Y ;X2 SL或 R;且X3 為 S 或T;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ;及人VL卡帕亞組IV共有框架序列SEQ ID NO :240。 在某些實(shí)施方案中，該抗BvS抗體包含下述三種HVR序列⑴包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;(ii)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 S 或 T ;X3為A、L、S或T ;X4為A、E或S ;父5為1、L、S或T ;和(iii)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3 ;及人VH亞組I共有框架序列SEQ ID NO :241。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 F、
G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H或 V ;且X5 為 D、E 或 Y ;
(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1為N或Y;X2為L(zhǎng)或R;且X3為S或T;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T或 V ;X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 S 或 T ;X3為A、L、S或T ;X4為A、E或S ;父5為1、L、S或T ;和(vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO :55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含選自 SEQ ID NO :56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO :57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQ ID NO 58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2包含選自 SEQ ID NO :59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含選自 SEQ ID NO :60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列和人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，人VL卡帕亞組IV共有框架序列減去三個(gè)輕鏈HVR序列為SEQ IDN0:240。在某些實(shí)施方案中，VH亞組I共有框架序列減去三個(gè)重鏈HVR序列為SEQ ID NO:241。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 61 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 62 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 63 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 64 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 65的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 66 的 HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 85 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 86 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 87 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 88 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 89的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 90 的 HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 91 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 92 的 HVR-H2 ；
(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 93 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 94 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 95的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 96 的 HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :121 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :122 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :123 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :124 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO :125的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :126 的 HVR-L3。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組IV共有框架序列和人VH亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，人VL卡帕亞組IV共有框架序列減去三個(gè)輕鏈HVR序列為SEQ IDN0:240。在某些實(shí)施方案中，VH亞組I共有框架序列減去三個(gè)重鏈HVR序列為SEQ ID NO:241。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :7，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :9，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO : 11，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO : 13，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :14。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含與選自SEQID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的輕鏈可變域。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含選自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID N0:7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID N0:9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO =Il0在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO 130在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含與選自SEQID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重鏈可變域。
在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含選自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID N0:8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO 10o在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO 120在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO 140在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含與選自SEQID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的輕鏈可變域和與選自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重鏈可變域。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含選自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列，該重鏈可變域包含選自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗Bv8抗體以小于O. 02nM的Kd值結(jié)合人Bv8。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗Bv8抗體以約O. OlnM或更小的Kd值結(jié)合人Bv8。

在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗BvS抗體結(jié)合人Bv8的緊密程度比嵌合2G9抗Bv8抗體高至少兩倍。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗Bv8抗體結(jié)合人Bv8的緊密程度比嵌合2G9抗Bv8抗體高至少五倍。在某些實(shí)施方案中，Kd值是使用表面等離振子共振測(cè)定法測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，Kd值是使用全長(zhǎng)抗Bv8抗體測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，Kd值是使用Fab形式的抗BvS抗體測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 為 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 為 K或N;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 為 F、S、W 或 Y ;X2 為 D 或 E ;X3 為1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 為 L 或 Y ;X2 為 I 或 L ;X3 為 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RdhGYYWFX1Y 的 HVR-H3，其中 X1 為 D 或 T。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 為 P 或 S ;
(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 為 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 為 F、S、W 或 Y ;X2 為 D 或 E ;X3 為1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 為 L 或 Y ;X2 為 I 或 L ;X3 為 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RdhGYYWFX1Y 的 HVR-H3，其中 X1 為 D 或 T。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO : 157、163、169、175、181、187 和 193 的氨基酸序列，HVR-L2 包含選自 SEQ ID NO: 158、164、170、176、182、188 和 194 的氨基酸序列，HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO :159、165、171、177、183、189 和 195 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQ ID NO :160、166、172、178、184、190 和 196 的氨基酸序列，HVR-H2 包含選自 SEQ ID NO : 161、167、173、179、185、191 和 197的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO : 162、168、174、180、186、192和198的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列和人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合 BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 為 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 為 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 為 F、S、W 或 Y ;X2 為 D 或 E ;X3 為1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 為 L 或 Y ;X2 為 I 或 L ;X3 為 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含下述六種HVR序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 為 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 為 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 為 F、S、W 或 Y ;X2 為 D 或 E ;X3 為1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 為 L 或 Y ;X2 為 I 或 L ;X3 為 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 和 HVR-H3，該 HVR-Ll 包含選自 SEQ ID NO : 157、163、169、175、181、187 和 193 的氨基酸序列，該 HVR-L2 包含選自 SEQ ID NO : 158、164、170、176、182、188 和 194 的氨基酸序列，該 HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO : 159、165、171、177、183、189 和 195的氨基酸序列，該HVR-Hl包含選自SEQ ID NO : 160、166、172、178、184、190和196的氨基酸序列，該HVR-H2包含選自SEQ ID NO :161、167、173、179、185、191和197的氨基酸序列，該HVR-H3包含選自EQ ID NO : 174、180、186、192和198的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列和人VH亞組III共有框架序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :23，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :24。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)包含 EASQSVDYDDDSYMN 的 HVR-Ll ；(ii)包含 ATSNLAS 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQSNEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYTFTNSWMN 的 HVR-Hl ；(V)包含 RIDPSDSETHYNQKFKD 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 DSSYDGFYAMDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含下述六種HVR序列(i)包含 EASQSVDYDDDSYMN 的 HVR-Ll ；(ii)包含 ATSNLAS 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQSNEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYTFTNSWMN 的 HVR-Hl ；(V)包含 RIDPSDSETHYNQKFKD 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 DSSYDGFYAMDY 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2 和 HVR-H3,該 HVR-Ll 包含選自 SEQ ID NO :199 和 205 的氨基酸序列，該HVR-L2包含選自SEQ IDNO :200和206的氨基酸序列，該HVR-L3包含選自SEQ ID NO :201和207的氨基酸序列，該HVR-Hl包含選自SEQ ID NO :202和208的氨基酸序列，該HVR-H2包含選自SEQ ID NO :203和209的氨基酸序列，該HVR-H3包含選自SEQ IDNO :204和210的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列和人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)包含 KSSEYVSNALS 的 HVR-Ll ； (ii)包含 GTNKLED 的 HVR-L2 ；
(iii)包含 QQGYDIPT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GFTFSDYFMG 的 HVR-Hl ；(V)包含 GIDTKSYNYATYYSGSVKG 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 NYGNYGAFDS 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含下述六種HVR序列(i)包含 KSSEYVSNALS 的 HVR-Ll ；(ii)包含 GTNKLED 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQGYDIPT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GFTFSDYFMG 的 HVR-Hl ；(V)包含 GIDTKSYNYATYYSGSVKG 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 NYGNYGAFDS 的 HVR-H3。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合Bv8的抗體或其片段，其中該抗體包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2 和 HVR-H3，該 HVR-Ll 包含氨基酸序列 SEQ ID NO :211，該HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO :212，該HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO :213，該HVR-Hl包含氨基酸序列SEQ ID NO :214，該HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO :215，該HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO :216。

在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體進(jìn)一步包含人VL卡帕亞組I共有框架序列和人VH亞組III共有框架序列。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體為單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗Bv8抗體為人源化的。在某些實(shí)施方案中，該抗BvS抗體為人的。在某些實(shí)施方案中，該抗BvS抗體的至少部分框架序列為人共有框架序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體為選自Fab、Fab’_SH、Fv、scFv或(Fab’ )2片段的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼本文所述任何抗體的多核苷酸或核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含該多核苷酸或核酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體為表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含該載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為真核的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為原核的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備抗Bv8抗體的方法，其中該方法包括在適合于編碼抗體的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，并分離抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含上述任何抗Bv8抗體的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含與藥學(xué)可接受載體混合的上述任何抗Bv8抗體的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其用于預(yù)防或治療腫瘤轉(zhuǎn)移，包含與藥學(xué)可接受載體混合的有效量的本文所述任何抗Bv8抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)生物學(xué)樣品中Bv8的存在的方法，該方法包括在允許抗體結(jié)合Bv8的條件下使生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗Bv8抗體接觸，并檢測(cè)抗體和Bv8之間是否形成復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療腫瘤、癌癥、或細(xì)胞增殖性病癥的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗體。在某些實(shí)施方案中，該癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，腎癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細(xì)胞癌。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、腎癌、卵巢癌或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。在本文中“定義”下提供了所涵蓋的癌癥的一個(gè)例示性和非限制性列表。在某些實(shí)施方案中，提供了用于在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗體。在某些實(shí)施方案中，該病理狀況為新生物狀況(neoplastic condition)。在某些實(shí)施方案中，該病理狀況為非新生物狀況。在本文中“定義”下提供了所涵蓋的非新生物狀況的一個(gè)例示性和非限制性列表。在某些實(shí)施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在某些實(shí)施方案中，提供了用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗體。在某些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞為腎上腺皮層內(nèi)皮細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，提供了用于抑制嗜中性粒細(xì)胞遷移的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗體。在某些實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)移在淋巴系統(tǒng)中。在某些實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)移在遠(yuǎn)端器官中。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療、預(yù)防或減輕疼痛的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗體。在某些實(shí)施方案中，該疼痛為急性或慢性疼痛。在某些實(shí)施方案中，該疼痛為急性或慢性炎性疼痛。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗體。在某些實(shí)施方案中 ，本文和上文所述方法和進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用有效量的第二藥物，其中該抗BvS抗體為第一藥物。在某些實(shí)施方案中，該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、免疫抑制劑、前藥、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、細(xì)胞毒性放療、皮質(zhì)類固醇、止吐劑、癌癥疫苗、止痛劑、或生長(zhǎng)抑制劑。在某些實(shí)施方案中，該第二藥物為抗血管發(fā)生劑。在某些實(shí)施方案中，該第二藥物或抗血管發(fā)生劑為抗VEGF抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。在某些實(shí)施方案中，該第二藥物在施用抗BvS抗體之前或之后施用。在某些實(shí)施方案中，該第二藥物與抗BvS抗體同時(shí)施用。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用有效量的第三藥物，其中該第三藥物為化療劑。在本文中“定義”下提供了所涵蓋的化療劑的一個(gè)例示性和非限制性列表。在某些實(shí)施方案中，該化療劑選自下組帕利他賽(paclitaxel),卡鉬(carboplatin),順鉬(cisplatin),吉西他濱(gemcitabine)和培美曲賽(pemetrexed)。在某些實(shí)施方案中，提供了用于在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中增強(qiáng)抗血管發(fā)生劑的功效的方法，該方法包括對(duì)受試者施用與抗血管發(fā)生劑組合的有效量的本文所述任何抗BvS抗體，由此增強(qiáng)所述抗血管發(fā)生劑的抑制活性。在某些實(shí)施方案中，該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為腫瘤、癌癥或細(xì)胞增殖性病癥。在某些實(shí)施方案中，該與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況為非新生物狀況。在某些實(shí)施方案中，該非新生物狀況選自下組糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在某些實(shí)施方案中，該非新生物狀況為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在某些實(shí)施方案中，該受試者為人患者。在某些實(shí)施方案中，該受試者為人癌癥患者。在某些實(shí)施方案中，該受試者為可已經(jīng)診斷有轉(zhuǎn)移或可處于發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)的人癌癥患者。在某些實(shí)施方案中，該受試者為自VEGF拮抗劑復(fù)發(fā)的或?qū)EGF拮抗劑不應(yīng)的。在某些實(shí)施方案中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗。在某些實(shí)施方案中，該抗血管發(fā)生劑在施用抗Bv8抗體之前或之后施用。在某些實(shí)施方案中，該抗血管發(fā)生劑與抗Bv8抗體同時(shí)施用。在某些實(shí)施方案中，該抗血管發(fā)生劑為抗VEGF劑。在某些實(shí)施方案中，該抗VEGF劑為抗VEGF抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗VEGF抗體為貝伐單抗。本文所述任何實(shí)施方案或其任何組合適用于本文所述發(fā)明任何和所有抗BvS抗體和方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-F -M Bv8抗體的輕鏈和重鏈HVR環(huán)序列。所述圖顯示了輕鏈HVR序列L1、L2、和L3及重鏈HVR序列H1、H2和H3。每種抗體的序列編號(hào)方式如下嵌合2G9 (HVR-Hl為 SEQ ID NO 49 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO 50 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 51 ；HVR-Ll 為 SEQ IDNO 52 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 53 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO 54)；h2G9. K4G1. Polish (HVR-LI 為SEQ IDNO :55 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :56 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :57 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO 58 ;HVR-H2 為 SEQ ID NO :59 ;HVR_H3 為 SEQ ID NO 60) ；h2G9. K4G1. vl9 (HVR-LI 為 SEQID NO 61 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :62 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :63 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :64 ；HVR-H2 為 SEQ IDNO :65 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 66)；h2G9. K4G1. v25 (HVR-LI 為 SEQ IDNO 67 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :68 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :69 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :70 ；HVR-H2為 SEQ ID NO 71 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :72) ；h2G9. K4G1. v27 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :73 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :74 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :75 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :76 ；HVR-H2 為SEQ IDNO 77 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 78)；h2G9. K4G1. v37 (HVR-LI 為 SEQ IDNO :79 ；HVR-L2為 SEQ ID NO 80 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :81 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :82 ；HVR-H2 為 SEQ IDNO :83 ;HVR-H3 為 SEQ ID NO 84) ；h2G9. K4G1. v52 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :85 ;HVR_L2 為SEQ ID NO 86 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :87 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :88 ；HVR-H2 為 SEQ IDNO 89 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :90) ；h2G9. K4G1. v55 (HVR-LI 為 SEQ IDNO :91 ；HVR-L2 為 SEQID NO 92 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :93 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :94 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :95 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 96) ；h2G9. K4G1. v63 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :97 ;HVR_L2 為 SEQ IDNO 98 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :99 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :100 ；HVR-H2 為 SEQ IDNO :101 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :102) ；h2G9. K4G1. v64 (HVR-LI 為 SEQ IDNO :103 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 104 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :105 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :106 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :107 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 108)；h2G9. K4G1. v65 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :109 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 110 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :111 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :112 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :113 ;HVR-H3 為 SEQ ID NO 114)；h2G9. K4G1. v67 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :115 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 116 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :117 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :118 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :119 ;HVR-H3 為 SEQ ID NO 120)；h2G9. K4G1. v73 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :121 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 122 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :123 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :124 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :125 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 126)；h2G9. K4G1. v75 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :127 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 128 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :129 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :130 ；HVR-H2 為 SEQ IDNO :131 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :132) ；h2G9. K4G1. v77 (HVR-LI 為 SEQ IDNO :133 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 134 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :135 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :136 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :137 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 138)；h2G9. K4G1. v80 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :139 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 140 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :141 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :142 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :143 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 144)；h2G9. K4G1. v92 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :145 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 146 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :147 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :148 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :149 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :150) ；h2G9. K4G1. vl9H/v55L (HVR-LI 為 SEQ ID NO :151 ；HVR-L2 為SEQ ID NO 152 ;HVR_L 3 為 SEQ ID NO :153 ;HVR-HI 為 SEQ IDNO :154 ;HVR_H2 為 SEQ ID NO 155 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :156);嵌合 2B9 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :157 ；HVR-L2 為 SEQ IDNO 158 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :159 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :160 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :161 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :162);h2B9. vl(HVR_Ll 為 SEQ ID NO :163 ;HVR_L2 為 SEQ ID NO :164;HVR-L3 為 SEQ ID NO :165 ；HVR-Hl 為 SEQ IDNO :166 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :167 ；HVR-H3 為SEQ ID NO 168)；h2B9. vlO (HVR-LI 為 SEQ ID NO :169 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :170 ；HVR-L3為 SEQID NO 171 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :172 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :173 ；HVR-H3 為 SEQ IDNO 174) ；h2B9. v23 (HVR-LI 為 SEQ ID NO :175 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :176 ；HVR-L3 為 SEQID NO 177 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :178 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :179 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 180) ；h2B9. v37 (HVR-LI 為 SEQ ID NO : 181 ;HVR_L2 為 SEQ ID NO : 182 ;HVR_L3 為 SEQIDNO 183 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO :184 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :185 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :186);h2B9. v56(HVR-Ll 為 SEQ ID NO :187 ;HVR_L2 為 SEQ ID NO :188 ;HVR_L3 為 SEQ ID NO :189 ;HVR-Hl 為 SEQ ID NO :190 ;HVR_H2 為 SEQ ID NO :191 ;HVR_H3 為 SEQ ID NO 192)；h2B9. v76(HVR-L1 為 SEQ ID NO :193 ;HVR_L2 為 SEQ ID NO : 194 ;HVR_L3 為 SEQID NO :195 ;HVR-HI 為SEQ ID NO 196 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :197 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :198);嵌合 3F1 (HVR-LI為 SEQ ID NO 199 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :200 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :201 ；HVR-Hl 為 SEQID NO 202 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :203 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO 204)；h3Fl. vl (HVR-L1 為 SEQID NO 205 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :206 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :207 ；HVR-Hl 為 SEQ ID NO 208 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :209 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :210);和嵌合 2D3CHVR-L1 為 SEQ IDNO 211 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO :212 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO :213 ；HVR-Hl 為 SEQ IDNO :214 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO :215 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO :216)。氨基酸位置依照下文所述Kabat編號(hào)系統(tǒng)來(lái)編號(hào)。圖1G。人VL卡帕(K )亞組IV共有框架序列減去Kabat輕鏈HVR序列顯示于SEQID NO :240。人VH亞組I共有框架序列減去Kabat重鏈HVR序列顯示于SEQ ID NO :241。圖2A-B?？笲vS抗體2G9變體的㈧輕鏈可變域和⑶重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖3A-B。抗BvS抗體2B9變體的㈧輕鏈可變域和⑶重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖4A-B?？笲vS抗體3F1變體的(A)輕鏈可變域和(B)重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖5A-B?？笲vS抗體2D3變體的㈧輕鏈可變域和⑶重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖6A-B。人源化抗Bv8抗體2B9變體的(A)輕鏈可變域和(B)重鏈可變域的氨基酸序列。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖7。輕鏈可變域氨基酸序列，顯示⑴小鼠2G9 (m2G9)框架序列和人共有卡帕I框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有卡帕IV框架序列之間的差異。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖8。重鏈可變域氨基酸序列，顯示(I)小鼠2G9(m2G9)框架序列和人共有亞組I(Gl)框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有亞組III(G3)框架序列之間的差異。位置依照Kabat來(lái)編號(hào)且高變區(qū)以框示。圖 9?？笲v8 抗體h2G9. K4G1. Polish,h2G9. K4G1. v27、h2G9. K4G1. v52、h2G9. K4G1.v55、h2G9. K4G1. v63、h2G9. K4G1. v64、h2G9. K4G1. v67、h2G9. K4G1. v77 和 h2G9. K4G1. v80 的L1、L2和L3氨基酸序列。圖 10。抗 Bv8 抗體 h2G9. K4G1. Polish、h2G9. K4G1. vl9、h2G9. K4G1. v25、h2G9.K4G1. v37、h2G9. K4G1. v65、h2G9. K4G1. v73、h2G9. K4G1. v75、h2G9. K4G1. v77、h2G9. K4G1.v92的Hl、H2和H3氨基酸序列。圖11顯示嵌合2D3抗體可具有與嵌合2B9以及嵌合3F1和嵌合2G9抗體不同的表位。ELISA競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法顯示嵌合3F1和嵌合2G9抗體與嵌合2B9競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人Bv8的結(jié)合。嵌合2D3僅僅部分地與嵌 合2B9抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人Bv8的結(jié)合。圖12顯示小鼠2G9、嵌合2G9、小鼠2B9、嵌合2B9和嵌合3F1對(duì)人Bv8誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖的阻斷。該測(cè)定法的結(jié)果顯示嵌合2G9能夠完全抑制人BvS誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖。圖 13 顯示嵌合 2G9、h2G9. K4Gl、h2G9. K4G3、h2G9. KlGl 和 h2G9. K1G3 抗 Bv8 抗體對(duì)人BvS誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖的阻斷。該測(cè)定法的結(jié)果顯示嵌合2G9抗BvS抗體在20 μ g/mL抗體濃度具有最高阻斷活性。圖14A-B描繪來(lái)自噬菌體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的結(jié)果，證明h2G9.K4Gl變體(L1:D28E、D28S、G29A、G29S, H2 :C52aA、C52aS、N54A、N54S, H3 :D95E、D95S、G96A 和 G96S)針對(duì)人 Bv8
的結(jié)合。圖15顯示嵌合2G9和h2G9. K4G1. Polish抗Bv8抗體對(duì)人Bv8誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖的阻斷。圖16描繪來(lái)自噬菌體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的結(jié)果，證明親和力改善的h2G9.K4Gl. Polish變體(來(lái)自 L1/L2 軟隨機(jī)化文庫(kù)的 h2G9. K4G1. v27、v52、v55、v63、v64、v67、v77、v80)針對(duì)人Bv8的結(jié)合。圖17來(lái)自噬菌體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的結(jié)果，證明親和力改善的h2G9. K4G1. Polish變體(來(lái)自 H1/H2 軟隨機(jī)化文庫(kù)的 h2G9. K4G1. vl9、v25、v37、v65、v73、v75、ν77· v92)針對(duì)人 Bv8
的結(jié)合。圖18顯示下述抗Bv8抗體(Fab)針對(duì)人Bv8的解離常數(shù)h2G9. K4G1. Polish，h2G9. K4G1. vl9, h2G9. K4G1. v52, h2G9. K4G1. v55 和 h2G9. K4G1. v73。圖19 顯示人源化抗 Bv8 抗體(Fab 和 IgG)h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 針對(duì)人Bv8和獼猴Bv8的解離常數(shù)。圖20顯示于25° C在人Bv8固定化BIAcore芯片上注射50nM抗Bv8 Fab抗體的
傳感圖，證明解離速率改善。圖21顯示下述抗BvS抗體(IgG)針對(duì)人BvS和獼猴BvS的解離常數(shù)嵌合2G9，h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55。結(jié)果顯示人源化抗 Bv8 抗體 h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9.K4G1. v55的親和力表現(xiàn)為比嵌合2G9抗Bv8抗體緊密至少兩倍。圖22顯示人源化抗Bv8抗體阻斷人Bv8對(duì)小鼠2G9抗體的結(jié)合。五種親和力成熟的人源化抗 Bv8 抗體(h2G9. K4G1. vl9、h2G9. K4G1. v52、h2G9. K4G1. v55、h2G9. K4G1. v73和h2G9. K4G1. vl9H/v55L)具有與親本改進(jìn)型K4G1分子相比強(qiáng)大約5_8倍的阻斷能力。圖 23 顯示嵌合 2G9, h2G9K4Gl. Polish, h2G9K4Gl. vl9, h2G9K4Gl. v52, h2G9K4Gl.v55和h2G9K4Gl. v73抗Bv8抗體在指定濃度(μ g/mL)對(duì)人Bv8誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖的阻斷。人源化抗 Bv8 抗體 h2G9K4GL vl9、h2G9K4GL v52、h2G9K4GL v55 和 h2G9K4GL v73 顯示阻斷人Bv8誘導(dǎo)的ACE增殖方面的顯著改善。圖 24 顯示 h2G9K4Gl. Polished、h2G9K4Gl. vl9、h2G9K4Gl. v55 和嵌合 2D3 抗 Bv8抗體在指定濃度(μ g/mL)對(duì)小鼠Bv8誘導(dǎo)的ACE細(xì)胞增殖的阻斷。圖25。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療HM7人結(jié)腸癌中的功效研究。 圖26。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療A673人橫紋肌肉瘤癌癥中的功效研究。圖27。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療HT55人結(jié)腸癌中的功效研究。圖28。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療Calu-6人肺癌中的功效研究。圖29。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療Colo-205人結(jié)腸癌中的功效研究。圖30。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗體在治療HPAC人胰腺癌中的功效研究。圖31。嵌合 2G9, h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療 Calu-6 人肺癌中的功效研究。圖 32。嵌合 2D3, h2G9. K4G1. Polish,h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療HM7人結(jié)腸癌中的功效研究。圖33。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療 A673 人橫紋肌肉瘤癌癥中的功效研究。圖34。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療 HT55 人結(jié)腸癌中的功效研究。圖35。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療 Colo-205人結(jié)腸癌中的功效研究。
圖 36。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗體在治療 HPAC 人胰腺癌中的功效研究。圖37?？笲v8小鼠抗體(3F1和2B9)在有和無(wú)抗VEGF抗體下治療LXFL529人肺非小細(xì)胞癌細(xì)胞中的功效研究。圖38顯示Lewis肺癌(LLC)同種異體移植物響應(yīng)作為單一藥劑或與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的生長(zhǎng)抑制。圖39顯示HM7人結(jié)腸直腸癌異種移植物響應(yīng)作為單一藥劑或與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的生長(zhǎng)抑制。圖40顯示H460人非小細(xì)胞肺癌異種移植物響應(yīng)與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的生長(zhǎng)抑制。圖41顯示攜帶H460人非小細(xì)胞肺癌異種移植物的小鼠響應(yīng)與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的延長(zhǎng)的存活。圖42顯示HT29人結(jié)腸直腸癌異種移植物響應(yīng)單獨(dú)的與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的生長(zhǎng)抑制。圖43顯示攜帶HT29人結(jié)腸直腸癌異種移植物的小鼠響應(yīng)單獨(dú)的與抗VEGF抗體組合的抗Bv8抗體的延長(zhǎng)的存活。發(fā)明詳述本發(fā)明提供抗Bv8抗體的方法、組合物、試劑盒和制品。本文中提供這些方法、組合物、試劑盒和制品的詳情。

通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻(xiàn)中記載的廣泛應(yīng)用的方法SambiOOket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y ;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003))；叢書(shū) METHODS IN ENZYM0L0GY(AcademicPress, Inc.) : PCR2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL ;及 ANIMALCELL CULTURE (R.1. Freshney, ed. (1987))。定義術(shù)語(yǔ)“Bv8”、“Bv8同系物”、“起動(dòng)蛋白原 _2”(也稱作 “PK2”、“KAL4”、和 “MIT1”)在本文中可互換使用，指全長(zhǎng)多肽和/或全長(zhǎng)多肽的活性片段。天然序列BvS涵蓋BvS的天然存在前原(prepro)、原(pro)和成熟形式和截短形式，天然存在變體形式(例如可變剪接形式和天然存在等位變體。在某些實(shí)施方案中，天然BvS氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:235 至 239。人和鼠 Bv8 序列也披露于例如 Wechselberger et al. (FEBSLett. 462:177-181(1999))及 Li et al. (Mol. Pharm. 59:692-698(2001))。“Bv8受體”指BvS結(jié)合的和介導(dǎo)BvS生物學(xué)特性的分子。因此，術(shù)語(yǔ)“Bv8受體”在其含義內(nèi)包括 PKR1/GPR73/EG-VEGF 受體-1/PR0KR1 和 PKR2/GPR73L1/EG-VEGF 受體-2/PR0KR2(LeCouter et al. , 2003, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 100:2685-2690;Lin etal. , 2002, J. Biol. Chem. , 277:19276-19280;Masuda et al. , 2002, Biochem. Biophys. Res.Commun. , 293:396-402)。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”和“有生物學(xué)活性的”就多肽而言指分子特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答(例如增殖、遷移等)的能力。細(xì)胞應(yīng)答還包括那些經(jīng)由受體介導(dǎo)的，包括但不限于遷移和/或增殖。關(guān)于Bv8，為了本文中的目的，“有活性的”或“活性”指保留天然的或天然發(fā)生的BvS的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的BvS形式，其中“生物學(xué)”活性指天然的或天然發(fā)生的BvS所擁有的，在誘導(dǎo)針對(duì)抗原性表位的抗體生成的能力以外，由天然的或天然發(fā)生的BvS引起的生物學(xué)功能(或是抑制性或是刺激性的)，而“免疫學(xué)”活性指天然的或天然發(fā)生的BvS所擁有的，誘導(dǎo)針對(duì)抗原性表位的抗體生成的能力。在某些實(shí)施方案中，BvS的生物學(xué)活性是調(diào)控髓樣細(xì)胞動(dòng)員、促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生和/或促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。術(shù)語(yǔ)“抗BvS抗體”或“結(jié)合BvS的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合Bv8，使得該抗體可用作靶向Bv8的診斷劑和/或治療劑的抗體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合Bv8的抗體具有彡I μ M、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM、彡O.1nM、或彡O. OlnM的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗Bv8抗體結(jié)合在來(lái)自不同物種的Bv8之間保守的Bv8表位。在某些實(shí)施方案中，抗Bv8抗體與選自下組的抗體結(jié)合人Bv8上相同表位嵌合2G9，h2G9. K4G1. vl9，h2G9. K4G1.v52,h2G9. K4G1. v55,h2G9. K4G1. v73和嵌合2D3。在某些實(shí)施方案中，抗Bv8抗體與選自下組的抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人 Bv8 的結(jié)合嵌合 2G9，h2G9. K4G1. vl9,h2G9. K4G1. v52，h2G9. K4G1. v55,h2G9. K4G1. v73 和嵌合 2D3?！敖Y(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(shù)(Kd)來(lái)表述。親和力可通過(guò)本領(lǐng)域知道的常用方法來(lái)測(cè)量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過(guò)如下測(cè)定法所述使用Fab型式的抗BvS抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定法(RIA)來(lái)測(cè)量的通過(guò)在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的125I標(biāo)記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來(lái)測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen，et al.，(1999) J. MolBiol 293:865-881)。為了確定測(cè)定 條件,用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5yg/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過(guò)夜，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23° C)封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc #269620)中，將IOOpM或26pM[125I]_抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Presta et al. , (1997)CancerRes. 57:4593-4599中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評(píng)估一致)。然后將目的Fab保溫過(guò)夜；不過(guò)，保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如I小時(shí))。然后除去溶液，并用含O. 1% Tween -20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔閃爍液(MicroScint _20; Packard),然后在TopCount伽馬計(jì)數(shù)器(Packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定法使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)在 25° C 使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用鹽酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約O. 2 μ Μ),然后以5 μ I/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25° C以約25 μ I/分鐘的流速注入在含O. 05% Tween -20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(O. 78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通過(guò)同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(km)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率I^ffZXn計(jì)算。參見(jiàn)例如Chen，Y.，et al. , (1999) J. Mol.Biol. 293:865-881。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過(guò)10 -^那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來(lái)測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量,在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低?！胺蛛x的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所包含 的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。術(shù)語(yǔ)“載體”在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱為“重組載體”或“表達(dá)載體”)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過(guò)DNA或RNA聚合酶或者通過(guò)合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過(guò)與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有燒化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換,用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體和半固體支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ _氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α -端基異構(gòu)糖,差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無(wú)環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)
S(“二硫代酸酯” (dithioate) )、(O)NR2 (“酰胺酯” (amidate) )、P (O) R、P (O) OR’、CO 或 CH2(“甲縮醛” (formacetal))替代，其中R或R’各自獨(dú)立為H或者取代或未取代的烷基(1_20個(gè)C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA?！肮押塑账帷痹谟糜诒疚臅r(shí)一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長(zhǎng)度一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長(zhǎng)或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。
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“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(I)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%，最優(yōu)選重量超過(guò)99%，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備?！翱勺兊摹敝缚勺冇蛑械哪承┎糠衷诳贵w序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)或高變區(qū)(CDR或HVR，在本文中可互換使用)的三個(gè)區(qū)段?？勺冇蛑休^保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取β_折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β_折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)HVR連接。每條鏈中的HVR通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn)Kabat et al.，序列of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的(細(xì)胞)毒性中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F (ab’)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過(guò)柔性肽接頭共價(jià)相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個(gè)HVR相互作用而在Vh-' 二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)HVR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)HVR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。？(&13’)2抗體片段最初是作為在Fab’片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab’片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、Ig G和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab' )2和？￥片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)e區(qū)的抗體片段，保留通常與Fe區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fe序列相連。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR :三個(gè)在VH中(H1、H2、H3)，三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個(gè)HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。參見(jiàn)例如Xu etal. , Immunity 13:37-45 (2000);Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology248:1-25 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003)。事實(shí)上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時(shí)是有功能的且穩(wěn)定的。參見(jiàn)例如Hamers-Casterman et al. , Nature363:446-448(1993);Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat et al·，序列 of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接觸(contact)” HVR是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個(gè)的殘基。
權(quán)利要求
1.一種抗BvS抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 D、F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1為N或Y;X2為L(zhǎng)或R ;且X3為S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T 或V;且 X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 C、S 或 T ;X3 為A、L、N、S或T ;X4 為 A、E或 S ;父5為1、L、S*T，^P (vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 為 G 或 S。
2.權(quán)利要求1的抗BvS抗體，其包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 D、F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1為N或Y;X2為L(zhǎng)或R ;且X3為S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T 或V;且 X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 C、S 或 T ;X3 為A、L、N、S或T ;X4 為 A、E或 S ;父5為1、L、S*T，^P (vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 為 G 或 S。
3.權(quán)利要求2的抗Bv8抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO :49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含選自 SEQID NO :50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO :51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQ ID NO :52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含選自 SEQID NO :53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含選自 SEQ ID NO :54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的抗BvS抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1為N或Y;X2為L(zhǎng)或R ;且X3為S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T 或V;且 X4 為 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 S 或 T ;X3 為 A、L、S 或T ;X4 為 A、E 或 S ;父5為1、L、S*T，^P (vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。
5.權(quán)利要求4的抗BvS抗體，其包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 為 L 或 V ;X2 為 D 或 I ;X3 為 F、G、S、W 或 Y ;X4 為 A、G、H 或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1為N或Y;X2為L(zhǎng)或R ;且X3為S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 為 S 或 T ;X2 為 F 或 L ;X3 為 F、M、P、T 或V;X4 為 D、E、H、I，或N;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 為 H、S 或 T ;X2 為 S 或 T ;X3 為 A、L、S 或T ;X4 為 A、E 或 S ;父5為1、L、S*T，^P (vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。
6.權(quán)利要求5的抗Bv8抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO :55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含選自 SEQ IDNO :56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含選自 SEQ ID NO :57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含選自 SEQ ID NO :58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含選自 SEQ ID NO :59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3包含選自 SEQ ID NO :60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和156的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗體包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 61的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 62的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 63的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO 64的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 65的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 66的HVR-L3。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗體包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 85的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 86的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 87的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO 88的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 89的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 90的HVR-L3。
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗體包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 91的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 92的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 93的HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列SEQID NO 94的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 95的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 96的HVR-L3。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗體包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO :121的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO :122的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO :123的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO :124的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO :125的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO :126的HVR-L3。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，進(jìn)一步包含人VLK亞組IV共有框架序列SEQ ID NO :240和人VO. OH亞組I共有框架序列SEQ ID NO :241。
12.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗BvS抗體，包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :7，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :8。
13.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗BvS抗體，包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :9，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :10。
14.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗BvS抗體，包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :11，該重鏈可變域包含SEQ ID NO 120
15.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗BvS抗體，包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO : 13，該重鏈可變域包含SEQ ID NO 140
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗Bv8抗體以小于約O.02nM的Kd值結(jié)合人Bv8。
17.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的抗Bv8抗體，其中該抗Bv8抗體結(jié)合人Bv8的緊密程度比嵌合2G9抗Bv8抗體高至少兩倍。
18.—種結(jié)合BvS的抗體或其片段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含下述六種HVR序列 (i)包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 為 P 或 S ;(ii)包含DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 為 K 或 N ;(iii)包含QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 為 F、S、W 或 Y ;X2 為 D 或 E ;X3 為1、L 或 M ;(iv)包含GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 為 L 或 Y ;X2 為 I 或 L ;X3 為 P 或 S ; (V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2，和 (vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。
19.權(quán)利要求18的抗Bv8抗體，其中HVR-Ll包含選自SEQID NO : 169、175、181、187和193的氨基酸序列，HVR-L2包含選自SEQ ID NO : 170、176、182、188和194的氨基酸序列，HVR-L3包含選自SEQ ID NO :171、177、183、189和195的氨基酸序列，HVR-Hl包含選自SEQID NO : 172、178、184、190 和 196 的氨基酸序列，HVR-H2 包含選自 SEQ ID NO : 173、179、185、191和197的氨基酸序列，且HVR-H3包含選自SEQ ID NO : 174、180、186、192和198的氨基酸序列。
20.編碼權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗體的核酸。
21.包含權(quán)利要求20的核酸的載體。
22.權(quán)利要求21的載體，其中該載體為表達(dá)載體。
23.包含權(quán)利要求21或22的載體的宿主細(xì)胞。
24.包含權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗體的組合物。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中該組合物包含載體。
26.權(quán)利要求24或25的組合物，其為藥物組合物。
27.—種用于制備抗Bv8抗體的方法,所述方法包括(a)在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求21或22的載體，并(b)回收該抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該宿主細(xì)胞是原核的。
29.權(quán)利要求27的方法，其中該宿主細(xì)胞是真核的。
30.一種用于治療腫瘤、癌癥、或細(xì)胞增殖性病癥的方法，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗Bv8抗體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中該癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，腎癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝細(xì)胞癌。
32.權(quán)利要求31的方法，其中該癌癥為乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、腎癌、卵巢癌或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
33.一種在具有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中降低或抑制血管發(fā)生的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗BvS抗體，由此降低或抑制受試者中的血管發(fā)生。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述病理狀況為新生物狀況。
35.一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗體。
36.權(quán)利要求30-35任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用有效量的第二藥物，其中抗Bv8抗體為第一藥物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中該第二藥物為另一種抗體、化療劑、細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、免疫抑制劑、前藥、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、細(xì)胞毒性放療劑、皮質(zhì)類固醇、止吐劑、癌癥疫苗、止痛劑、或生長(zhǎng)抑制劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中該第二藥物為抗血管發(fā)生劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該抗血管發(fā)生劑為抗VEGF抗體。
40.權(quán)利要求39的方法,其中該抗VEGF抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。
41.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的方法，其中該第二藥物在施用抗Bv8抗體之前或之后施用。
42.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的方法，其中該第二藥物與抗Bv8抗體同時(shí)施用。
43.權(quán)利要求30-40任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用有效量的化療劑。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注針對(duì)Bv8的抗體及其用途。
文檔編號(hào)C07K16/24GK103068849SQ201080064579
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者X.吳, L.俞, W-C.梁, Y-J.G.孟, J.蒂恩, 吳雁, N.費(fèi)拉拉 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司