一種多氯聯(lián)苯同系物的單克隆抗體的制備及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備方法，特別涉及一種水體和土壤沉積物中環(huán)境 激素多氯聯(lián)苯PCB37的免疫檢測(cè)的多氯聯(lián)苯同系物的單克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多氯聯(lián)苯（PCBs)作為一種具有持久性危害的痕量有機(jī)污染物，得到了世界性的 廣泛關(guān)注。不同的國(guó)家對(duì)PCBs的命名的方式不同，除了化學(xué)上的標(biāo)準(zhǔn)命名法外，我國(guó)習(xí)慣 上按聯(lián)苯上被氯取代的個(gè)數(shù)（不論其取代位置）將PCBs分為三氯聯(lián)苯（PCB3)、四氯聯(lián)苯 (PCB4)、五氯聯(lián)苯（PCB5)、六氯聯(lián)苯（PCB6)。據(jù)估計(jì)，全世界已生產(chǎn)和應(yīng)用的多氯聯(lián)苯近100 萬(wàn)t，其在各類(lèi)環(huán)境中的累積量估計(jì)達(dá)25萬(wàn)-30萬(wàn)t。PCBs具有較低的水溶解性和高的辛 醇-水體系分配系數(shù)，因此很容易就進(jìn)入生態(tài)循環(huán)，通過(guò)食物鏈的被富集，對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生毒 害作用。同時(shí)由于其化學(xué)降解過(guò)程和生物降解過(guò)程相當(dāng)緩慢，使得此類(lèi)物質(zhì)對(duì)環(huán)境造成長(zhǎng) 期的污染，以致多次出現(xiàn)二次污染。
[0003] 多氯聯(lián)苯（PCBs)作為一種受到世界各國(guó)環(huán)境工作者廣泛關(guān)注的環(huán)境激素類(lèi)污染 物，其檢測(cè)方法的研究成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。當(dāng)前，以酶聯(lián)免疫法（ELISA)為代表的免疫檢測(cè) 方法作為一種快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受人們的關(guān)注。美國(guó) 國(guó)家環(huán)保局（EPA)也已經(jīng)在2003年就把此類(lèi)方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法公布出來(lái)，應(yīng)用于土壤沉積 物中多氯聯(lián)苯的檢測(cè)。當(dāng)前市場(chǎng)上已經(jīng)有多氯聯(lián)苯免疫檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)品。
[0004] 然而，建立免疫分析方法的關(guān)鍵是獲取效價(jià)高、選擇性好的抗體。雖然目前已經(jīng)有 關(guān)于針對(duì)PCB12,PCB37,PCB77的抗體的報(bào)導(dǎo)，但它們對(duì)目標(biāo)分子的效價(jià)較低，選擇性相對(duì) 較差，影響了檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性。
[0005] 在對(duì)環(huán)境中多氯聯(lián)苯PCB37的檢測(cè)研究中，對(duì)樣品中多氯聯(lián)苯單個(gè)有代表性的毒 性較強(qiáng)的單體如PCB37污染物的檢測(cè)具有非常重要的意義。雖然目前已建立的酶聯(lián)免疫吸 附分析法、儀器色譜分析能夠準(zhǔn)確檢測(cè)環(huán)境樣品中的PCBs，但其靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于一些 所含PCBs以痕量存在的樣品，往往需要通過(guò)濃縮才能對(duì)其實(shí)現(xiàn)分析檢測(cè)，甚至不能檢出， 從而降低了方法的準(zhǔn)確度，不適合環(huán)境中痕量PCBs的分析檢測(cè)。但是，2003年，美國(guó)西北 大學(xué)的ChadMirkin課題組提出了一種超靈敏的基于納米粒子的生物條形碼技術(shù)來(lái)檢測(cè) 蛋白分子，該方法主要通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合及磁分離來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的識(shí)別和分 離；利用修飾在金納米顆粒（goldnanoparticles，GNPs)表面的DNA作為檢測(cè)信號(hào)，并將 此DNA形象地稱(chēng)為條形碼DNA(barcodeDNA)或者信號(hào)DNA(signalDNA)。GNPs表面可以 修飾數(shù)百條條形碼DNA，這使得檢測(cè)信號(hào)得到有效的放大，經(jīng)過(guò)金標(biāo)銀染增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)一步放 大信號(hào)，用平板掃描儀進(jìn)行分析檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)10lsmolLi。該方法不用酶標(biāo)記或者催 化底物放大信號(hào)，而單純的用納米材料表面可以修飾大量信號(hào)探針的放大效應(yīng)，并利用純 物理的手段來(lái)檢測(cè)，這也使得生物條形碼技術(shù)成為目前已報(bào)導(dǎo)的唯一一種不用酶催化放大 就能和PCR技術(shù)相媲美的方法。此外，該方法以DNA作為檢測(cè)探針，而現(xiàn)有DNA檢測(cè)方法的 多樣化也為生物條形碼技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了廣闊的空間。目前，該方法已成為生物大 分子、環(huán)境污染物等分析檢測(cè)方面的研究熱點(diǎn)。
[0006] 此外，近年來(lái)，隨著生物條形碼技術(shù)與其他分析檢測(cè)方法的結(jié)合，形成了多種基于 生物條形碼技術(shù)的分析方法。其中，熒光定量PCR生物條形碼方法是在體系的檢測(cè)階段，以 條形碼DNA為模板DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)條形碼DNA進(jìn)行擴(kuò)增和分析來(lái)定量分析檢 測(cè)目標(biāo)分子；和原有的方法相比，該方法具有更好的特異性，能夠有效的避免與相似蛋白的 交叉反應(yīng)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為檢測(cè)手段也避免了常規(guī)PCR中假陽(yáng)性的出現(xiàn)。當(dāng)前，基 于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的間接競(jìng)爭(zhēng)生物條形碼方法主要用于生物學(xué)與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，用來(lái)對(duì) 一些致病細(xì)菌或蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，此技術(shù)也只是用于對(duì)環(huán)境中一些病毒 或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。目前還沒(méi)見(jiàn)到此技術(shù)用于PCBs類(lèi)尤其是PCB37環(huán)境污染物的檢測(cè)報(bào)道。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310246024. 0,名稱(chēng)為"一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體 的制備方法"，公開(kāi)了一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，但是該方法制備的是混合型單 克隆抗體，其專(zhuān)一性不是很強(qiáng)，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，最終導(dǎo)致免疫方法檢測(cè)多氯聯(lián)苯時(shí)濃度 偏高的現(xiàn)象發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體 的制備方法，該方法制備的單克隆抗體特異性更強(qiáng)，效價(jià)更高，提高了抗體對(duì)多氯聯(lián)苯單體 的親和性，為滿(mǎn)足多氯聯(lián)苯類(lèi)污染物的免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的需要提供技術(shù)支持。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明提供了一種抗多氯聯(lián)苯單體3, 4, 4'-三氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的制備方 法，所述方法包括以下步驟：
[0011] 通過(guò)PCB37半抗原合成免疫原；
[0012] 將合成的免疫原通過(guò)采用動(dòng)物免疫方法及雜交瘤抗體技術(shù)制備得到抗多氯聯(lián)苯 PCB37單克隆抗體。
[0013] 優(yōu)選地，所述的通過(guò)PCB37半抗原合成免疫原具體包括以下步驟：
[0014] A1、將PCB37半抗原加入非質(zhì)子有機(jī)溶劑a使其溶解，得溶液a;
[0015] A2、將N，N-二環(huán)己基酰亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，加入非質(zhì)子有機(jī)溶劑b使其溶 解，得溶液b;
[0016] A3、將所述溶液b加入所述的溶液a中，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完后取上清液；
[0017] A4、將牛血清蛋白BSA溶液加入到所述的上清液中反應(yīng)，得PCB37半抗原-BSA結(jié) 合物，即免疫原。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟A1中，所述PCB37半抗原為三氯聯(lián)苯半抗原，所得溶液a中 PCB37半抗原的濃度為1~3mmol/mL;所述步驟A2中，N,N-二環(huán)己基酰亞胺和N-羥基丁二 酰亞胺的重量比為1:1. 6~1. 8,所得溶液b中N,N-二環(huán)己基酰亞胺的濃度為80~83mg/ mL〇
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟A3中，所述溶液b與溶液a的體積比為3~5 : 4，反應(yīng)時(shí)間為 8~10h;所述步驟A4中，BSA溶液為牛血清蛋白BSA溶于碳酸鹽緩沖溶液所得，BSA溶液 的濃度為16mg/mL，冰浴條件下反應(yīng)時(shí)間為6~8h。
[0020] 優(yōu)選地，所述非質(zhì)子有機(jī)溶液a和非質(zhì)子有機(jī)溶液b獨(dú)立地選自N，N-二甲基甲酰 胺或二甲亞砜。
[0021] 優(yōu)選地，所述PCB37半抗原為三氯聯(lián)苯半抗原
熔點(diǎn)為162~164°C。
[0022] 優(yōu)選地，所述的將合成的免疫原通過(guò)動(dòng)物免疫方法及雜交瘤抗體技術(shù)制備得到抗 多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體包括以下步驟：
[0023]S1、用已純化的免疫原和完全佐劑混合后充分乳化，然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行首次免疫注 射，再以不完全佐劑進(jìn)行追加強(qiáng)化反應(yīng)，使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體；
[0024]S2、將步驟S1中體內(nèi)產(chǎn)生抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的動(dòng)物，取其含有抗多氯 聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得含有抗多氯聯(lián)苯PCB37 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0025] 優(yōu)選地，所述方法還包括采用腹水生產(chǎn)法將步驟S2獲得的雜交瘤細(xì)胞接種至動(dòng) 物腹腔，收集腹水，離心、純化，獲得純化后的抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的步驟。
[0026] 優(yōu)選地，所述純化采用硫酸銨鹽析法、辛酸鹽析法、辛酸-硫酸銨沉淀法、DEAE纖 維素離子交換層析法、QAE纖維素離子交換層析法或親和層析法中的一種或多種結(jié)合。
[0027] 優(yōu)選地，所述純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法和DEAE纖維素離子交換層析法結(jié)合。 該方法純化效率高，操作簡(jiǎn)單，比較適合單克隆抗體的純化。
[0028] 優(yōu)選地，所述方法還包括在步驟S2的細(xì)胞融合前三天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次沖刺免 疫。
[0029] 優(yōu)選地，還包括將步驟S2獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)獲得含有抗多 氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的步驟。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S1中，所述的首次免疫注射采用等量的免疫原和完全佐劑充分乳 化，免疫原的用量為40~100yg/只。
[0031] 優(yōu)選地，所述的弗氏完全佐劑，包括液體石蠟和羊毛脂的混合物（體積比1~5 : 1)、免疫原和含結(jié)核分歧桿菌的細(xì)胞壁成分（即卡介苗）；弗氏不完全佐劑，包括液體石蠟 和羊毛脂的混合物（體積比1~5 :1)、免疫原組成的油包水的乳濁液，佐劑活性來(lái)自于油 滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應(yīng)。
[0032] 優(yōu)選地，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物或禽類(lèi)，哺乳動(dòng)物包括家兔、羊、馬、豚鼠、豬或猴，優(yōu) 選兔或豚鼠；禽類(lèi)包括雞、鴨、鵝或鶴鶉，優(yōu)選雞；上述動(dòng)物為適齡、健壯、無(wú)感染的動(dòng)物，優(yōu) 選雄性動(dòng)物，動(dòng)物的年齡應(yīng)是青壯年，優(yōu)選月齡3個(gè)月的成年豚鼠。
[0033] 優(yōu)選地，步驟S1中，所述追加強(qiáng)化反應(yīng)，第一次加強(qiáng)選擇首次免疫后2~3周，以 后的加強(qiáng)選擇上一次免疫后2~4周，所述的追加強(qiáng)化反應(yīng)所用的免疫原的用量為首次免 疫原用量的〇. 5~1. 5倍。免疫應(yīng)答需要時(shí)間，首次免疫后必須要間隔2~3周給動(dòng)物一 個(gè)適應(yīng)的過(guò)程再加強(qiáng)免疫，防止動(dòng)物不適應(yīng)外界刺激而死亡的現(xiàn)象發(fā)生，以后的加強(qiáng)免疫 選擇2~4周的間隔期，也是為了動(dòng)物體的生物免疫應(yīng)答不對(duì)動(dòng)物造成過(guò)多過(guò)大的傷害，如 死亡等。后期的追加強(qiáng)化反應(yīng)的免疫劑量的選定應(yīng)考慮抗原性強(qiáng)弱、分子量大小和免疫時(shí) 間。抗原需量多，時(shí)間間隔長(zhǎng)，劑量可適當(dāng)加大。大動(dòng)物抗原劑量（以蛋白抗原為準(zhǔn)）約 0. 5~lmg/只，小動(dòng)物約0. 1~0. 6mg/只，豚鼠屬于小動(dòng)物。擇因?yàn)閯┝考哟髽O易造成免 疫耐受（免疫抑制）而遭失敗。免疫相關(guān)文獻(xiàn)已有證明，幾微克的蛋白質(zhì)