靶向HER2的人源化改造的可內(nèi)化單鏈抗體P1h3及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗人HER2單鏈抗體，特別涉及一種經(jīng)人源 化改造的可內(nèi)化的抗人HER2單鏈抗體，包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗體制備方 法和其對HER2陽性腫瘤細胞的診治用途。
【背景技術(shù)】
[0002] HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,ErbB2/P185)是人表皮生長 因子受體（EGFR)家族的第二個成員，由原癌基因erbB2/Her2編碼，編碼基因定位于人染色 體17q21，分子量為185kDa，是一種酪氨酸激酶受體膜糖蛋白。HER2通過與HER1，HER3或 HER4形成異二聚體，導(dǎo)致下游MAPK和PI3K等信號通路活化，過度傳導(dǎo)生長信號從而導(dǎo)致細 胞惡性增殖。在人類多種腫瘤中，包括25-30 %乳腺癌、35-45 %胰腺癌及90 %的結(jié)腸直腸 癌、16-57 %的非小細胞肺癌、9-38 %的胃癌等都發(fā)現(xiàn)有HER2原癌基因擴增或者蛋白過表 達現(xiàn)象，臨床上稱為J1ER2陽性腫瘤，主要表現(xiàn)為腫瘤惡性程度高，易進展及轉(zhuǎn)移，對放化療 不敏感，易復(fù)發(fā)，患者生存期短。
[0003] 1975年，Kohler與Milstein發(fā)明了用來制備單克隆抗體（Monoclonalantibody， mAb)的雜交瘤技術(shù)，之后單抗藥物迅速發(fā)展并應(yīng)用于臨床。近年來，祀向HER2的抗體藥 物也已經(jīng)成為HER2陽性腫瘤治療新熱點。曲妥珠單抗（赫塞汀，英文名Trastuzumab/ Herceptin)是Genetech公司開發(fā)的抗HER2人源化單克隆抗體藥物，美國FDA于1998年 批準上市，目前曲妥珠單抗聯(lián)合化療藥物（紫杉醇等）已經(jīng)成為HER2過表達晚期轉(zhuǎn)移性 乳腺癌和晚期胃癌的一線治療方案，在J1ER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療中，臨床有效率可達 38%，歐洲EMEA已經(jīng)批準Trastuzumab聯(lián)合化療藥物作為治療HER2陽性進展期胃癌的一 線治療方案。
[0004] 盡管Trastuzumab的臨床應(yīng)用取得了令人鼓舞的結(jié)果，但仍有大量病人對治療無 反應(yīng)，或治療后復(fù)發(fā)。有研究報道鼠源性單抗應(yīng)用于人類有較強的免疫原性，可引起機體 免疫系統(tǒng)對該異種蛋白的免疫排斥反應(yīng)，產(chǎn)生人抗鼠抗體（Humananti-mouseantibody， HAMA)反應(yīng)，重復(fù)使用時甚至可導(dǎo)致病人嚴重的過敏性休克。而且由于HAMA的存在，鼠 單抗在人體內(nèi)會很快得到清除，半衰期很短，因此限制了其臨床應(yīng)用。Trastuzumab為人 鼠嵌合抗體，但其可變區(qū)部分為鼠源性，會引發(fā)人體產(chǎn)生HAMA，有轉(zhuǎn)移性乳腺癌長期應(yīng)用 Trastuzumab治療的研究報告指出大約有25%的病人出現(xiàn)過心臟毒性；臨床III期試驗結(jié)果 表明，HER2陽性乳腺癌病人只有大約1/3對Trastuzumab單劑治療有確切的療效；在臨床， 即使聯(lián)合化療，大多數(shù)病人在使用Trastuzumab治療一年內(nèi)就會產(chǎn)生耐藥。
[0005] 隨著對各類抗體結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的深入了解，利用抗體工程技術(shù)對抗體結(jié)構(gòu) 進行改造，將動物來源的單克隆抗體人源化（Monoclonalhumanization)，以降低這些單抗 反復(fù)應(yīng)用于人體后產(chǎn)生的免疫原性使之用于人類疾病的治療，是目前研究的一個熱點?？?體人源化改造的主要策略有以下幾種：
[0006] 1 ?嵌合抗體
[0007] 抗體的恒定區(qū)是抗體分子結(jié)構(gòu)中免疫原性最強的部位，運用基因工程技術(shù)將鼠單 抗可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)相拼接，即成為鼠單抗人源化的最簡單形式人/鼠嵌合抗體 (chimericantiboay)。嵌合抗體大大降低了鼠源單抗的免疫原性，同時又保留了鼠單抗的 親和性及特異性。由于嵌合抗體仍保留了原來鼠源抗體約30%左右的鼠源序列，其免疫原 性雖有所降低，但仍可引起不同程度的HAMA反應(yīng)。
[0008] 2?互補決定區(qū)（complementarydeterminingregion，Q)R)移植的人源化抗體
[0009] 每一抗體分子Fab段的輕、重鏈可變區(qū)各具有3個抗原互補決定區(qū)（⑶R1XDR2和 Q)R3)，它們之間有起結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用的框架區(qū)（frameworkregion，F(xiàn)R)，CDR可直接接觸抗 原，決定抗體的特異性，F(xiàn)R作為支持CDR的支架其立體構(gòu)象極為保守。CDR移植抗體是把鼠 單抗的互補決定區(qū)（CDR)移植到人單抗的骨架區(qū)FR構(gòu)建而成的抗體，經(jīng)臨床試驗證明，其 免疫原性得到顯著降低。
[0010] 3.人源FR模板的重構(gòu)
[0011] ①模板替換，在已有的抗體序列庫中搜尋與鼠mAbFR有最大同源性的人源FR用 以替換。輕、重鏈通常來自不同的人抗體，這樣可使鼠源CDR和人模板間有更好的同源性。 應(yīng)將鼠FR中與CDR密切相關(guān)的氨基酸殘基保留在替換的人源FR中。為了保持CDR的空間 構(gòu)象，要特別注意原始抗體CDR下面的堆積殘基以及CDR周圍的殘基。②補償變換，補償變 換可以認為是模板替換的進一步延伸，在人FR選擇上，將與CDR有相互作用、與抗體親和力 有密切關(guān)系或?qū)R空間結(jié)構(gòu)折疊起關(guān)鍵作用的殘基進行改變，以補償完全CDR移植。③定 位保留，最簡位置模板（minimalpositionaltemplate)能確認在抗體可變區(qū)中哪些位置 是保持抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域完整性所必需的，在選擇用于人源化的人FR時，首先從現(xiàn)有 的人源抗體保守序列中搜尋與鼠FR最相似的序列；其次根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū) 的關(guān)鍵位置殘基；最后保留所有這些位置而將其余部分人源化。
[0012] 4?表面重塑
[0013] 將非人源單抗可變區(qū)（Fv)表面非人源的氨基酸殘基替換為人源性的氨基酸殘 基，使非人源抗體Fv區(qū)的表面人源化，降低其免疫原性，同時不影響Fv區(qū)的整體空間構(gòu) 象，從而保留其抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)。
[0014] 5?抗原表位定向選擇（epitope-guidedselection)
[0015] 將鼠抗體的輕鏈或重鏈文庫與人抗體的重鏈或輕鏈文庫配對，構(gòu)建成"人一鼠雜 合抗體庫"，篩選與抗原結(jié)合的克隆，分離獲得人抗體的重鏈或輕鏈基因，再將它們與人的 輕鏈或重鏈文庫混合，用抗原篩選，就能得到與抗原結(jié)合的特異性人抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種靶向HER2的人源化改造的可內(nèi)化單鏈抗體Plh3及其 制備方法和應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明公開的一種靶向HER2的人源化改造的可內(nèi)化單鏈抗體Plh3,其氨基酸序 列如SEQ.ID.NO. 1所示。
[0018] 本發(fā)明還公開了編碼人源化改造的可內(nèi)化單鏈抗體Plh3的核苷酸序列，如SEQ. ID.NO. 2 所示。
[0019] 本發(fā)明還公開了一種制備靶向HER2的人源化改造的可內(nèi)化單鏈抗體Plh3的方 法，包括以下步驟：
[0020] 1)將鼠源性單鏈抗體e23sFv的CDR移植到同源性最高的人抗體共有序列的FR;
[0021] 2)將FR中對維持抗體空間構(gòu)象的13個氨基酸殘基突變?yōu)閑23sFv中的鼠源性氨 基酸殘基，構(gòu)建庫容量為213單鏈抗體噬菌體展示庫；
[0022] 3)從得到的單鏈抗體噬菌體展示庫篩選出具有高親和活性及高內(nèi)化活性的人源 化單鏈抗體Plh3。
[0023] 本發(fā)明還公開了上述的革El向HER2的人源化改造的單鏈抗體Plh3在制備抗腫瘤藥 物和/或保健品中的應(yīng)用，以及靶向J1ER2的人源化改造的單鏈抗體Plh3在制備HER2陽性 腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
[0024] 所述的藥物和/或保健品為抗HER2陽性腫瘤細胞的藥物和/或保健品。
[0025] 所述HER2陽性腫瘤細胞為乳腺癌細胞、胃癌細胞、非小細胞肺癌細胞或卵巢癌細 胞等。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0027] 1、本發(fā)明首次對免疫促凋亡分子Immuno-Fdt-tBid單鏈抗體部分e23sFv進行了 人源化改造，e23是HER2分子胞外段免疫小鼠后制備的雜交瘤中親和力及抑制腫瘤效率最 好的克隆，對e23的單鏈抗體形式e23sFv的人源化改造尚屬首次。
[0028] 2、將與e23sFv的VL、VH同源性最高的人源抗體共有序列FR與e23sFv的FR進行 替換，同時挑選對抗體構(gòu)象起重要作用的13個FR位點，突變?yōu)樵瓉韊23sFv的氨基酸殘基， 以最大限度保證單鏈抗體構(gòu)象的正確折疊。
[0029] 3、構(gòu)建庫容量為213的突變體單鏈抗體庫，利用噬菌體展示技術(shù)篩選出對HER2親 和力高的人源化單鏈抗體株P(guān)lh3,保證經(jīng)過人源化改造的單鏈抗體能夠具有較高的親和 力。
[0030] 4、利用多種實驗手段從分子到細胞水平驗證經(jīng)人源化改造的Plh3對HER2分子的 親和活性及內(nèi)化進入HER2陽性腫瘤細胞的活性，比較其與鼠源單鏈抗體e23sFv免疫原性 的大小，確保最后篩選的分子具有較高的親和、內(nèi)化活性及較低的免疫原性，為進一步構(gòu)建 靶向HER2分子的免疫促凋亡分子，并實現(xiàn)在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為完全人源化單鏈抗體hue23sFv氨基酸序列構(gòu)建流程框圖；
[0032] 圖2為人源化單鏈抗體突變體的突變引物序列結(jié)果；
[0033] 圖3為多位點突變PCR凝膠電泳結(jié)果圖；
[0034] 圖4為人源化單鏈抗體噬菌體抗體庫的構(gòu)建及4輪淘選結(jié)果圖；
[0035] 圖5為PhageELISA篩選親和力最高的單鏈抗體株結(jié)果；
[0036] 圖6為4株人源化單鏈抗體的原核表達及純化結(jié)果；
[0037] 圖7為SPR測定人源化單鏈抗體對重組人HER2分子親和常數(shù)；
[0038] 其中（a)為e23sFv對重組人HER2分子的親和常數(shù)KD4. 512*10SM; (b)為Plh3 對重組人HER2 分子的親和常數(shù)KD4. 787*101QM; (c)為e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 對 重組人HER2分子的結(jié)合解離能力分布。
[0039] 圖8為ELISA測定人源化單鏈抗體對重組人HER2分子的親和活性；
[0040] 圖9為流式細胞術(shù)檢測人源化單鏈抗體對HER2陽性腫瘤細胞結(jié)合的特異性；
[0041] 圖10為激光共聚焦顯微鏡檢測人源化單鏈抗體內(nèi)化進入HER2陽性腫瘤細胞活 性；
[0042] 其中，（a)為e23sFv、Plh3內(nèi)化進入HER2陽性乳腺癌細胞BT-474 ; (b)為e23sFv、 Plh3內(nèi)化進入HER2陽性卵巢癌細胞SK0V-3 ; (c)為e23sFv、Plh3不能內(nèi)化進入HER2陰性 乳腺癌細胞MCF-7。
[0043] 圖11為ELISP0T檢測人源化單鏈抗體的刺激人PBMC產(chǎn)生IFN-y的水平；
[0044] 圖12為人外周血多細胞因子檢測評價人源化單鏈抗體免疫原性結(jié)果；
[0045] 其中，（a)為e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 刺激健康人PBMC分泌TNF-a的水 平；（b)為e23sFv、Plh2、Plh3、P2h2、P2h5 刺激健康人PBMC分泌IFN-y的水平；（c)為 e23sFv、Plh2、Plh3、