一種膠原蛋白的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種膠原蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白(Collagen)是由成纖維細胞(fibroblast)合成的一種生物性高分子物質(zhì)，是哺乳動物體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)，約占人體或其他哺乳動物體內(nèi)總蛋白質(zhì)的20%?30 %。膠原蛋白主要分布于軟骨、皮膚及肌腱等組織中，用以支持、保護及連接各組織器官的形態(tài)，已確認的膠原蛋白有20多種，其中I型膠原蛋白占全部膠原蛋白的90%以上。由于膠原蛋白具有良好的生物相容性、無毒、弱抗原性、可降解性及安全性等優(yōu)點，因此可以作為天然生物材料應用在生物醫(yī)學領域中，例如，根據(jù)膠原蛋白的止血作用，可將其制作成海綿狀的敷料貼類產(chǎn)品用于止血，也可以用來敷裹傷口 ；根據(jù)它的可降解性可以將其用作手術縫線，也可以將其作為支架材料用于組織工程醫(yī)學領域，引導組織再生，促進傷口修復愈合。
[0003]目前，可以從動物的軟骨、皮膚及肌腱等組織中提取膠原蛋白，例如，申請?zhí)枮?00810045400.9的專利提供了“從動物皮或/和腱提取未變性天然膠原蛋白的方法”，包括以下步驟:去除油脂和雜質(zhì)并經(jīng)丙酮浸泡預處理后的健康的豬、牛或羊的皮或/和腱原料肩，將所述原料肩經(jīng)醋酸浸泡后加入胃蛋白酶進行酶解處理，制得酶解液；稀釋所述酶解液并分離去除酶解液中未酶解完全的部分，得到膠原蛋白粗溶液；將膠原蛋白粗溶液進行鹽析，得到鹽析懸濁液；分離所述鹽析懸濁液，將得到的膠原蛋白鹽析物用蒸餾水攪拌透析；用冷凍干燥機將透析后的產(chǎn)物凍干，即得到膠原蛋白。
[0004]現(xiàn)有技術中公開的“從動物皮或/和腱提取未變性天然膠原蛋白的方法”由于在對原料肩進行酶解處理時加入胃蛋白酶使得到的膠原蛋白中有胃蛋白酶等蛋白水解酶殘由ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的實施例提供一種膠原蛋白的提取方法，用以獲取具有膠原蛋白活性、無胃蛋白酶等蛋白水解酶殘留的純度高的I型膠原蛋白。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明的實施例采用如下技術方案:
[0007]第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種膠原蛋白的提取方法，包括:
[0008]對預處理后的原料利用酸性溶液進行至少一次抽提，獲取抽提混合液；
[0009]將獲取的所述抽提混合液進行至少兩次鹽析純化，獲取膠原蛋白鹽析沉淀；
[0010]將所述膠原蛋白鹽析沉淀透析、凍干，得到所述膠原蛋白。
[0011]在第一方面的第一種可能的實現(xiàn)方式中，所述抽提次數(shù)為兩次，分別為第一次抽提和第二次抽提；其中，
[0012]所述第一次抽提包括:按照所述預處理后的原料與所述酸性溶液的體積比為1: (10-20)將所述預處理后的原料溶解于所述酸性溶液中，離心收集上清液一和原膠原蛋白沉淀二 ；
[0013]所述第二次抽提包括:將所述原膠原蛋白沉淀二溶解于與第一次抽提等量的酸性溶液中，離心收集上清液二 ；
[0014]將所述上清液一和所述上清液二混合，得到所述抽提混合液。
[0015]在第一方面或第一方面的第一種可能的實現(xiàn)方式中，還提供了第一方面的第二種可能的實現(xiàn)方式，所述酸性溶液為體積濃度為0.5-5%的乙酸溶液。
[0016]在第一方面的第三種可能的實現(xiàn)方式，所述鹽析純化次數(shù)為三次，分別為第一次鹽析，第二次鹽析和第三次鹽析；其中，
[0017]所述第一次鹽析包括:向所述抽提混合液中加入無機鹽至所述無機鹽溶液的質(zhì)量濃度為4-6%，靜置，離心收集膠原沉淀一；
[0018]按照膠原沉淀一與緩沖液的體積比為1:20-1:30將所述膠原沉淀一溶解于所述緩沖液中，獲取原膠原蛋白溶液；
[0019]所述第二次鹽析包括:向所述原膠原蛋白溶液中加入無機鹽至所述無機鹽溶液的質(zhì)量濃度為1.5-1.8mol/L，靜置，離心收集上清液；
[0020]所述第三次鹽析包括:向所述上清液中加入無機鹽至所述無機鹽溶液的質(zhì)量濃度為2.0-3.0mol/L，靜置，離心收集所述上清液的沉淀，得到所述膠原蛋白鹽析沉淀。
[0021]在第一方面或第一方面的第三種可能實現(xiàn)方式，還提供第一方面的第四種可能實現(xiàn)方式，其中，所述靜置的時間為18_30h，靜置所處的溫度為2-6°C。
[0022]在第一方面或第一方面的第三種可能實現(xiàn)方式，還提供第一方面的第五種可能實現(xiàn)方式，所述無機鹽為氯化鈉。
[0023]在第一方面的第六種可能實現(xiàn)方式，所述將所述膠原蛋白鹽析沉淀透析、凍干，得到所述膠原蛋白，包括:
[0024]將所述膠原蛋白鹽析沉淀溶解于酸性溶液中，獲取膠原蛋白溶液；
[0025]將所述膠原蛋白溶液經(jīng)過超濾系統(tǒng)等倍透析，去除所述膠原蛋白溶液中的雜質(zhì)及小分子膠原蛋白；
[0026]將所述去除雜質(zhì)及小分子膠原蛋白的膠原蛋白溶液凍干，得到所述膠原蛋白。
[0027]在第一方面及第一方面的第六種可能方式中，還提供第一方面的第七種可能實現(xiàn)方式，所述酸性溶液的體積濃度為0.3-1.0%，所述酸性溶液為乙酸溶液。
[0028]在第一方面的第八種可能實現(xiàn)方式中，所述原料為豬、?；蜓虻钠せ?和腱，在所述對預處理后的原料利用酸性溶液進行至少一次抽提，獲取抽提混合液之前，所述方法還包括:
[0029]將豬、?；蜓虻钠せ?和腱清洗滅菌剔除外表皮皮毛和皮下組織后，絞切成顆粒；
[0030]向所述顆粒中加入中性清洗溶液，離心清洗2-5次，收集沉淀，獲得所述預處理后的原料。
[0031]在第一方面和第一方面的第八種可能實現(xiàn)方式中，所述中性清洗液的重量為所述預處理后的原料的重量的2-3倍。
[0032]本發(fā)明實施例提供一種膠原蛋白的提取方法，對預處理后的原料利用酸性溶液進行至少一次抽提，獲取抽提混合液；將獲取的所述抽提混合液進行至少兩次鹽析純化，獲取膠原蛋白鹽析沉淀；將所述膠原蛋白鹽析沉淀透析、凍干，得到所述膠原蛋白。在對預處理后的原料利用酸性溶液進行抽提能夠保證預處理后的原料中的膠原蛋白的產(chǎn)率，對抽提混合液采用至少兩次鹽析純提取出的膠原蛋白為具有膠原蛋白活性的高純度I型膠原蛋白，且由于本發(fā)明采用抽提而非酶解處理預處理后的原料，故所獲得的膠原蛋白中無胃蛋白酶等蛋白水解酶殘留，采用透析，去除了膠原蛋白中雜質(zhì)及非I型膠原蛋白蛋白質(zhì)，最終所得膠原蛋白的純度不低于95%，采用本發(fā)明實施例的膠原蛋白提取方法提取的膠原蛋白由于其具有良好的生物相容性、無毒、弱抗原性、可降解性及安全性等優(yōu)點，可作為天然生物材料用于生物醫(yī)學領域。更重要的是可以作為支架材料用于組織工程醫(yī)學領域，引導組織再生，促進傷口修復愈合。
【附圖說明】
[0033]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0034]圖1為本發(fā)明實施例提供的一種膠原蛋白的提取方法的流程示意圖一；
[0035]圖2為本發(fā)明實施例提供的一種膠原蛋白的提取方法的流程示意圖二 ；
[0036]圖3為本發(fā)明實施例提供的一種膠原蛋白的提取方法的流程示意圖三；
[0037]圖4為本發(fā)明實施例提供的一種膠原蛋白的提取方法的流程示意圖四。
【具體實施方式】
[0038]現(xiàn)將詳細地提供本發(fā)明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每一實例作為解釋而非限定本發(fā)明。實際上，對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可以對本發(fā)明進行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部分而說明或描述的特征可以