專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種胰腺癌化療藥療效評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)胰腺癌化學(xué)治療模型的血清，從而評(píng)價(jià)胰腺癌化療藥療效的方法。
背景技術(shù)：
：胰腺癌以發(fā)病隱匿、惡性程度高、手術(shù)切除率低、預(yù)后極差為特征，是惡性程度最高的腫瘤之一。在我國(guó)現(xiàn)居癌癥死亡率的第六位，其5年生存率僅為1°/。-4%。手術(shù)根治是目前治療胰腺癌唯一有確切療效的方法，術(shù)后配合化療，其5年生存率可達(dá)15%-40%。但臨床上只有10%-15%的病人可獲行根治性切除手術(shù)的機(jī)會(huì)，85%左右胰腺癌患者在確診時(shí)已因出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等原因而失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。因此化療在晚期胰腺癌治療中有著不可取代的作用。吉西他濱已作為治療晚期胰腺癌化療的"金標(biāo)準(zhǔn)"而被廣泛接受。目前，對(duì)治療胰腺癌的效果評(píng)價(jià)尚存在一定難度。雖然影像學(xué)技術(shù)可以提供一定的幫助，但胰腺位于后腹膜，加上術(shù)后胰腺床改變，CT、MRI等往往難以精確分辨胰腺癌與正常組織界限和客觀測(cè)量腫瘤大小，另外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶也難以完全監(jiān)測(cè)。目前臨床受益療效(clinicalbenefitresponse，CBR)包括腹痛、體力狀況、體重3個(gè)衡量指標(biāo)趨向取代腫瘤大小成為主要的胰腺癌化療指標(biāo)，但仍然缺乏如同腫瘤標(biāo)志物的客觀敏感性。目前比較普遍應(yīng)用的血清腫瘤標(biāo)志物包括CA19-9、CA50、CEA等，雖有一定敏感性及特異性，但多用于早期發(fā)現(xiàn)與診斷。迄今為止，尚未找到一種對(duì)治療效果及預(yù)后有一定評(píng)價(jià)意義的指標(biāo)。幾年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)己成為檢測(cè)和篩查腫瘤標(biāo)記物的重要手段之一。目前，新型質(zhì)譜技術(shù)以其高通量、高敏感性、采樣便捷等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物篩選的研究。表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是最近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新的蛋白組學(xué)研究方法，它能夠直接自未經(jīng)處理的生物樣品獲取蛋白質(zhì)圖譜。以這一技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的系列蛋白質(zhì)芯片可以非特異性或特異性地結(jié)合被測(cè)樣本中的各種蛋白質(zhì)，當(dāng)在質(zhì)譜儀中受到激光轟擊時(shí)，各種結(jié)合蛋白質(zhì)會(huì)被激發(fā)而形成氣化離子，由于不同質(zhì)荷比(m/z)的離子在電場(chǎng)中飛行的時(shí)間長(zhǎng)短不一，因此接收裝置可根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)荷比的不同及量的多寡直觀的用位置、強(qiáng)弱不同的峰表現(xiàn)出來(lái)，進(jìn)而形成圖譜用于分析。這一方，具有樣品用量小，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，高通量等優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)到fmol(10'15mol)數(shù)量級(jí)的微量蛋白，并可一次性獲得某一樣品中成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)胰腺癌化學(xué)治療模型血清，以獲得一種提示胰腺癌化學(xué)治療療效的腫瘤標(biāo)志物組合，為胰腺癌的藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供客觀有效的方法。本發(fā)明應(yīng)用表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析胰腺癌經(jīng)吉西他濱治療前后的血清蛋白成分的差異，建立胰腺癌化療的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，探索提示胰腺癌化學(xué)治療療效的腫瘤標(biāo)志物組合。具體通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)-(1)制備血清樣品取血清上清液，離心10分鐘，取上清血清，在10)LdU9血清處理液中加入血清5pL，搖床上振蕩使充分混合，用BindingBuffer(結(jié)合緩沖液)將U9處理后的血清稀釋至200W用于上樣，取上述經(jīng)U9處理并稀釋過(guò)的血清lOOpl加到CM10型蛋白質(zhì)芯片上，芯片與血清充分反應(yīng)1小時(shí)后去除血清樣品，每孔加入200pl相應(yīng)的BindingBuffer,搖床上振蕩5分鐘(600rpm，室溫)后除去液體，重復(fù)該過(guò)程2次，用水(純度HPLC級(jí))20(^1快速清洗每個(gè)孔1次，用力甩干并將Bio-Processor(96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架)倒扣在清潔的吸水紙上輕拍以去除多余的水，將芯片從Bio-processor中取出，自然干燥，每孔點(diǎn)加50%飽和的SPA(能量吸收分子)溶液lpl，待其自然干燥后重復(fù)點(diǎn)加l次，自然干燥即可上機(jī)檢測(cè)。(2)利用表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SurfanceEnhancedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry,SELDI-TOF-MS)檢測(cè)步驟(l)的血清樣本，獲得血清蛋白質(zhì)譜質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定:激光強(qiáng)度165，靈敏度7，數(shù)據(jù)收集范圍2000—30000m/z(蛋白質(zhì)質(zhì)量和電荷比值，即質(zhì)荷比)，每次收集數(shù)據(jù)前以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片校正分子量。(3)數(shù)據(jù)收集和生物信息學(xué)分析原始數(shù)據(jù)先以ProteinchipSoftware3.0軟件校正，使總離子強(qiáng)度及分子量達(dá)到均一，并過(guò)濾噪音，初始噪音過(guò)濾值5，二次噪音過(guò)濾值2，以10%為最小闡值進(jìn)行聚類(lèi)。經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，Mann-Whitney秩檢驗(yàn)比較各組血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(由ProteinchipSoftware3.0自帶的BiomarkerWizard3.2.0軟件完成)，尋找各組之間表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)峰。各組血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜比較的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab6.5數(shù)據(jù)處理軟件的SVM、判別分析軟件。選擇兩組間差別最顯著的10個(gè)蛋白質(zhì)峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。篩選出Youden指數(shù)最高的秩和比峰組合，用SVM留一法和判別分析留一法建立分期模型。每組分析樣本設(shè)為n個(gè)，則所有樣本中隨機(jī)抽取n—l個(gè)樣本設(shè)為訓(xùn)練集用于建立模型，剩余1個(gè)樣本設(shè)為測(cè)試集進(jìn)行交叉驗(yàn)證。如此抽樣、訓(xùn)練和驗(yàn)證過(guò)程重復(fù)n次，以得到最接近真實(shí)值的結(jié)果。最后同時(shí)輸出SVM、原始判別及二者交叉驗(yàn)證的結(jié)果。并以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同蛋白質(zhì)峰排列組合的判別分析結(jié)果，選出最佳排列組合；(4)結(jié)果表明質(zhì)荷比分別為3879Da、4772Da的兩個(gè)蛋白質(zhì)峰值是否升高可以準(zhǔn)確判斷經(jīng)過(guò)化學(xué)治療后腫瘤是否縮小，從而評(píng)價(jià)化療藥的療效。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)胰腺癌化學(xué)治療模型血清，以獲得一種提示胰腺癌化學(xué)治療療效的腫瘤標(biāo)志物組合，為胰腺癌的藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供客觀有效的方法，具有較高的靈敏度、特異度和正確率。并且可以完善及改良蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)，降低檢査費(fèi)用，使之更適合于臨床應(yīng)用。為胰腺癌藥物的治療評(píng)價(jià)提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。圖1為質(zhì)核比(m/z)位于3879.胰腺癌模型組與吉西他濱組裸小鼠血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對(duì)比。圖2為質(zhì)核比(m/z)位于4772.胰腺癌模型組與吉西他濱組裸小鼠血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對(duì)比。具體實(shí)施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例l制備血清樣品主要儀器和試劑:CM10型蛋白質(zhì)芯片96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架即Bio-proeessor分析純尿素、乙酸鈉、乙睛、DTT和cHAPS緩沖鹽(sigma公司)能量吸收分子SPA、實(shí)施步驟分別取胰腺癌裸鼠全血及吉西他濱組裸鼠全血lml，在4度低溫離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)IO分鐘，取上清液，再次離心10分鐘，取上清血清。10^1U9血清處理液中加入血清5|iL，搖床上振蕩使充分混合。用BindingBuffer將U9處理后的血清稀釋至200^1用于上樣。取上述經(jīng)U9處理并稀釋過(guò)的血清100nl加到芯片上，芯片與血清充分反應(yīng)1小時(shí)后去除樣品。每孔加入200|il相應(yīng)的BindingBuffer,搖床上振蕩5分鐘(600rpm,室溫)后除去液體。重復(fù)該過(guò)程2次。用水(純度HPLC級(jí))200pl快速清洗每個(gè)孔1次，用力甩干并將Bio-Processor倒扣在清潔的吸水紙上輕拍以去除多余的水。將芯片從Bio-processor中取出，自然干燥。每孔點(diǎn)加50%飽和的SPA溶液lpl，待其自然干燥后重復(fù)點(diǎn)加1次。自然干燥即可上機(jī)檢測(cè)。實(shí)施例2上機(jī)檢測(cè)主要儀器、軟件PBS—II表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(SELDI—TOF—MS)、分析軟件ProteinChipSoftware3.0(美國(guó)Ciphergen公司):支持向量機(jī)(supportveetormachines，SVM)、判另(J分析(discriminantanalysis)禾卩時(shí)間序歹U分析(time畫(huà)sequenceanalysis)軟件運(yùn)用Matlab6.5數(shù)據(jù)處理軟件(MathworkS公司)開(kāi)發(fā)；實(shí)施步驟質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定:激光強(qiáng)度165，靈敏度7，數(shù)據(jù)收集范圍2000一30000m/z(蛋白質(zhì)質(zhì)量和電荷比值，即質(zhì)荷比)，每次收集數(shù)據(jù)前以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片校正分子量。利用表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)血清樣本，獲得血清蛋白質(zhì)譜。實(shí)施例3數(shù)據(jù)收集和生物信息學(xué)分析原始數(shù)據(jù)先以ProteinchipSoftware3.0軟件校正，使總離子強(qiáng)度及分子量達(dá)到均一，并過(guò)濾噪音，初始噪音過(guò)濾值5，二次噪音過(guò)濾值2，以10%為最小闡值進(jìn)行聚類(lèi)。經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，Mann-Whitney秩檢驗(yàn)比較各組血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(由ProteinchipSoftware3.0自帶的BiomarkerWizard3.2.0軟件完成)，尋找各組之間表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)峰。各組血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜比較的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab6.5數(shù)據(jù)處理軟件的SVM、判別分析軟件。選擇兩組間差別最顯著的10個(gè)蛋白質(zhì)峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。篩選出Youden指數(shù)最高的秩和比峰組合，用SVM留一法和判別分析留一法建立分期模型。每組分析樣本設(shè)為n個(gè)，則所有樣本中隨機(jī)抽取n—1個(gè)樣本設(shè)為訓(xùn)練集用于建立模型，剩余1個(gè)樣本設(shè)為測(cè)試集進(jìn)行交叉驗(yàn)證。如此抽樣、訓(xùn)練和驗(yàn)證過(guò)程重復(fù)n次，以得到最接近真實(shí)值的結(jié)果。最后同時(shí)輸出SVM、原始判別及二者交叉驗(yàn)證的結(jié)果。并以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同蛋白質(zhì)峰排列組合的判別分析結(jié)果,選出最佳排列組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果胰腺癌模型組與吉西他濱組治療35天后原發(fā)腫瘤質(zhì)量對(duì)比見(jiàn)表1。表l胰腺癌模型組與吉西他濱組治療35天后原發(fā)腫瘤質(zhì)量對(duì)比<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>單用吉西他濱腹腔注射，胰腺癌腫瘤抑制率為50.14%(按以下公式計(jì)算腫瘤抑制率％=(l-吉西他濱組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量)xl00%)且腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯低于胰腺癌模型組，驗(yàn)證了吉西他濱對(duì)胰腺癌治療的有效性。3個(gè)實(shí)施例的結(jié)果都參見(jiàn)圖1-2。圖中橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)，縱坐標(biāo)為相對(duì)峰值(相對(duì)含量)。圖l顯示質(zhì)核比3879Da蛋白在吉西他濱組裸小鼠血清中呈高表達(dá)，其中(A)顯示的是質(zhì)核比位于3879Da的波峰在胰腺癌模型組血清中的表現(xiàn)，(B)顯示的是質(zhì)核比位于3879Da的波峰在吉西他濱組血清中的表現(xiàn)。圖2顯示質(zhì)核比4772Da蛋白在吉西他濱組裸小鼠血清中呈低表達(dá)，其中(A)顯示的是質(zhì)核比位于4772Da的波峰在胰腺癌模型組血清中的表現(xiàn)，(B)顯示的是質(zhì)核比位于4772Da的波峰在吉西他濱組血清中的表現(xiàn)。2個(gè)蛋白質(zhì)峰(3879、4772m/z)組合構(gòu)建為化療有效的預(yù)測(cè)模型(表2-3)。預(yù)測(cè)模型鑒別模型組與吉西他濱組裸小鼠血清的敏感性100%(19/19);特異性95.24%(20/21);準(zhǔn)確率97.5%(39/40)。表2模型組與吉西他濱組2個(gè)蛋白質(zhì)峰比較(x土力蛋白質(zhì)峰(m/z)胰腺癌模型組吉西他濱組P值38791610.02±700.893122.95±1564.530.000092779647723935.49±814.722731.13±835.450.0001443826表3預(yù)測(cè)模型對(duì)吉西他濱組與胰腺癌模型組的交叉驗(yàn)證結(jié)果(例數(shù))預(yù)測(cè)分組吉西他濱組胰腺癌模型組總計(jì)吉西他濱組(預(yù)19(95%)1(5%)20測(cè))模型組(預(yù)測(cè))0(4.76%)20(95.24%)20總計(jì)192140注敏感性100%(19/19);特異性95.24%(20/21);準(zhǔn)確率97.5%(39/40)總結(jié)以上各部實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得出了以下結(jié)論質(zhì)荷比分別為3879Da、4772Da的兩個(gè)蛋白質(zhì)峰值是否升高可以準(zhǔn)確判斷患有胰腺癌的實(shí)驗(yàn)裸鼠經(jīng)過(guò)化學(xué)治療后原發(fā)腫瘤是否縮小，具有較高的靈敏度、特異度和正確率。這就為胰腺癌的藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供客觀有效的方法及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。權(quán)利要求1.一種胰腺癌化療藥療效評(píng)價(jià)方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)血清樣品制備取上清血清加入U(xiǎn)9血清處理液中，充分混合，再用結(jié)合緩沖液稀釋?zhuān)∠♂屵^(guò)的血清加到CM10型蛋白質(zhì)芯片上，充分反應(yīng)后去除血清樣品，每孔加入結(jié)合緩沖液，振蕩后除去液體，用水清洗，甩干去除多余的水，取出芯片，自然干燥，每孔點(diǎn)加能量吸收分子溶液，自然干燥后即可上機(jī)檢測(cè)；(2)利用表面加強(qiáng)激光解吸電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)步驟(1)的血清樣本，進(jìn)行血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集，激光強(qiáng)度165，靈敏度7，數(shù)據(jù)收集范圍2000—3000m/z，每次收集數(shù)據(jù)前以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片校正分子量；(3)數(shù)據(jù)收集和生物信息學(xué)分析由二個(gè)質(zhì)荷比位于3879Da、4772Da的血清蛋白質(zhì)組成的質(zhì)譜模型，評(píng)價(jià)化療藥的療效。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法，其特征是步驟(3)所述的生物信息學(xué)分析是將原始數(shù)據(jù)以ProteinchipSoftware3.0軟件校正，以10%為最小闡值進(jìn)行聚類(lèi)，Mann-Whitney秩檢驗(yàn)比較化療前后的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立判別模型，用留一法交叉驗(yàn)證。全文摘要本發(fā)明提供一種胰腺癌化療藥療效評(píng)價(jià)方法，通過(guò)應(yīng)用表面加強(qiáng)激光解吸電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析血清蛋白成分的差異，建立胰腺癌的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)及生物信息學(xué)方法篩選出診斷效率高的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物，由二個(gè)質(zhì)荷比位于3879Da、4772Da的血清蛋白質(zhì)組成的質(zhì)譜模型，為胰腺癌的藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供客觀有效的方法，具有較高的靈敏度、特異度和正確率。并且可以完善及改良蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，是為降低我國(guó)胰腺癌的病死率、提高胰腺癌的治愈率、為評(píng)價(jià)胰腺癌藥物療效提供了一種新的方法。文檔編號(hào)G01N33/48GK101363837SQ200810120688公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者劉達(dá)人,曹利平,亮汪,王貴鋒,闕日升申請(qǐng)人:浙江大學(xué)