專利名稱：常用廣譜腫瘤化療藥物療效檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個(gè)體常用廣 譜腫瘤化療藥物療效的試劑盒，通過檢測常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基 因和CYP2C9基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個(gè)體常用廣譜腫瘤化療藥物療效。
背景技術(shù)：
腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對其生長 的調(diào)控，導(dǎo)致克隆性異常增生而形成的新生物。腫瘤被人類發(fā)現(xiàn)已有3000多年歷史，一般 分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，通常所講的“癌癥”指的是所有的惡性腫瘤。目前調(diào)查研究顯示，腫瘤已成為常見病，多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健 康最嚴(yán)重的一類疾病。我國最為常見和危害性最嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、肝癌、大腸癌、食管癌、 胃癌、乳腺癌和白血病等。在腫瘤的治療中，化療占有十分重要的地位，是手術(shù)后輔助治療的必要手段。然而 各種抗腫瘤藥物因具有細(xì)胞殺傷能力而潛藏著嚴(yán)重的藥物毒副作用，且因人而異的發(fā)揮著 難以預(yù)測的治療作用。因此，隨著人們對藥動學(xué)、藥效學(xué)和藥物基因組學(xué)的深入了解和把 握，使得通過更加靈敏、有效的基因檢測手段來預(yù)測藥物療效和規(guī)避不良反應(yīng)成為可能?？鼓[瘤類藥物，如紫杉醇、多烯紫杉醇、長春新堿等主要就是通過CYP3A4，5代謝 清除，而環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺則要通過CYP3A4，5代謝轉(zhuǎn)化為具有抗腫瘤活性物后發(fā)揮 治療作用。因此，CYP3A4，5基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改變將直接影響抗腫瘤類藥物的用藥 效果，CYP3A4，5基因的分型檢測對于臨床廣譜抗癌藥用藥指導(dǎo)有重要意義。CYP3A4*18是目前已確定的CYP3A4 SNP中等位基因突變率最高的位點(diǎn)，為外顯子 10上T878C突變，引起第293位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所取代。L293氨基酸殘基被包裹 在CYP3A4蛋白質(zhì)的里面。由于L293P非組成性突變，影響了 CYP3A4蛋白的構(gòu)成，底物結(jié)合 能力和酶催化活性。Gotoh(1992)證明了哺乳動物CYP450存在6種底物識別位點(diǎn)。根據(jù)這 一結(jié)論，L293P就位于第4種底物識別位點(diǎn)，而這種位點(diǎn)在不同動物中是高度保守的，并與 底物特異性相關(guān)。目前對CYP3A4*18等位基因?qū)υ撁富钚缘挠绊懘嬖谥煌囊庖?。有?究認(rèn)為該等位基因可能會提高CYP3A4酶活性，比如CYP3A4*18增加了對睪酮、氯螨硫磷的 催化活性；也有研究認(rèn)為該等位基因降低了 CYP3A4酶活性。這種相互矛盾的結(jié)果可能與作 用底物，及試驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)，因此有必要研究該位點(diǎn)對特定藥物的影響。肝、腸、食道、胃、膽囊、膽管、胰腺、肺、氣管、鼻黏膜、腎、腎上腺、甲狀旁腺、前列 腺、乳腺、卵巢、腦、垂體前葉等組織均有CYP3A5表達(dá)，提示它在這些組織中具有重要的生 理功能。CYP3A5曾經(jīng)一度被認(rèn)為是缺乏功能意義的假基因，但是近年來逐漸成為新的研 究熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)的等位基因有多種，包括CYP3A5*1A、CYP3A5*1B、CYP3A5*1C、CYP3A5*2、 CYP3A5*3A、CYP3A5*3B、CYP3A5*3C、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7。CYP3A5 的表 達(dá)在人群中呈多態(tài)分布，它的功能僅在10 20%的白人，33%的東方人和55%的美國黑人 中存在，這主要是因?yàn)镃YP3A5*3突變導(dǎo)致了不適當(dāng)?shù)膍RNA剪接，使終止密碼子提前，導(dǎo)致CYP3A5缺乏。CYP3A5*3等位基因的發(fā)生頻率的變化范圍由50% (美國黑人)到90% (白 人)。CYP3A5*3/*3純合子的肝微粒體表達(dá)CYP3A5的水平很低，表現(xiàn)為咪達(dá)唑倫的代謝活 性降低。CYP3A5*3/*3純合子個(gè)體CYP3A5活性低于CYP3A5*3/*1雜合子，而CYP3A5*1/*1 純合子活性最高，表現(xiàn)出明顯的基因劑量效應(yīng)。CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7也可形成可 變剪切，從而導(dǎo)致編碼的提前結(jié)束或外顯子的丟失。迄今已在CYP2C9基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)多個(gè)等位基因多態(tài)性或突變，其 中編碼區(qū)的11種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，依次被編為*2 *12號，*1定義為無突變的野生 型。研究較多主要是CYP2C9*2 *6五種多態(tài)性，而針對另外的CYP2C9*7 *12開展的工 作很少。除此之外，在基因的非編碼區(qū)也發(fā)現(xiàn)多個(gè)SNP，如內(nèi)含子2上的兩個(gè)SNP和5’端調(diào) 控區(qū)域的7個(gè)SNP等。它們能通過改變CYP2C9基因轉(zhuǎn)錄水平而影響酶活性。上述突變的 發(fā)生頻率具種族差異。CYP2C9底物的體內(nèi)代謝與其基因型相關(guān)。在日本人和英國人中發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3的 雜合子病人所需華法令的平均劑量為*1野生型的60%，而*3的合子病人的劑量僅為*1野 生型的10%，即正常人的劑量為4 8mg/d，而CYP2C9*3純合子僅需0. 4mg/d。CYP2C9*2同 樣存在類似現(xiàn)象，雜合子和突變純合子分別降低15 20%和40%。而且，攜帶CYP2C9*2和 *3的病人應(yīng)用華法令時(shí)發(fā)生出血并發(fā)癥等不良反應(yīng)和INR比值增高(> 4. 0)的概率顯著 高于正常人。在土耳其人和日本人中發(fā)現(xiàn)*2和*3雜合子個(gè)體服用苯妥因后12小時(shí)血藥 濃度比正常人高30%，而有*3純合子個(gè)體的苯妥因體內(nèi)口服清除率降低79%。CYP2C9*3 純合子個(gè)體對甲苯磺丁脲和格列吡嗪的體內(nèi)口服清除率較正常人低80%，或者其半衰期延 長3 4倍。最近的研究表明，氟伐他汀在不同基因型的個(gè)體中有明顯的藥代學(xué)差異，而在 藥效學(xué)上無顯著差別。在白種人中研究發(fā)現(xiàn)，洛沙坦的藥代學(xué)和藥效學(xué)均無基因型的顯著 差異，而在日本人中的研究卻表明有顯著的基因劑量效應(yīng)。由此可見，CYP2C9基因型對不 同藥物的影響有不同，而且存在種族差異性。

發(fā)明內(nèi)容
基于常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基因和CYP2C9基因多態(tài)性可用 來評估個(gè)體常用廣譜腫瘤化療藥物療效的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體常用廣譜腫瘤 化療藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基因和CYP2C9基因多態(tài)性位點(diǎn) 的特異性引物對及特異性熒光探針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，25mM MgC12 溶液 1. 2μ 1，
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5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，
10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水 10. 65 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行2次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè) 反應(yīng)的體系為總體積10 μ 1，包含濃度為20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶 FAM熒光探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4:基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個(gè)體常用廣譜腫瘤化療藥物療效的試劑盒，其特征在于包括檢測常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基因和CYP2C9基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1，；25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，；25mM MgCl2 溶液 1. 2 μ 1，；5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，；20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，；10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水10. 65 μ I0本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個(gè)體常用廣譜腫瘤化療藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基因和CYP2C9基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測常用廣譜腫瘤化療藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP3A4基因和CYP2C9基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個(gè)體常用廣譜腫瘤化療藥物療效。
文檔編號C12Q1/68GK101928753SQ20091005394
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司