一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型dna疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其活性成分包括：以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤抗原復(fù)合基因的抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA，以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤血管復(fù)合基因的抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE。本發(fā)明為抗腫瘤主動(dòng)免疫治提供一種新的選擇，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]治療性疫苗概述
[0003]治療性腫瘤疫苗是防治惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要技術(shù)手段，近年來(lái)發(fā)展迅速，2010年P(guān)R0VENGE⑧(sipuleucel-T)成為首個(gè)獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用的細(xì)胞疫苗，用于治療激素抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌。繼預(yù)防性疫苗之后，目前，治療性疫苗在國(guó)際疫苗研究領(lǐng)域異軍突起，已經(jīng)成為國(guó)際生物技術(shù)藥物開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。治療性疫苗可通過重新喚起機(jī)體對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答能力，在已患病個(gè)體誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，清除病原體或異常細(xì)胞，使疾病得以治療。
[0004]DNA疫苗由于能夠通過MHC I類抗原遞呈途徑誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，特別是能夠誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)活性,被公認(rèn)為是一種具有良好應(yīng)用前景的免疫治療方法，對(duì)研究治療重大慢性疾病的新型治療性疫苗藥物極為有利。然而近期研究表明DNA疫苗在大動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)中治療效果欠佳，有必要對(duì)傳統(tǒng)DNA疫苗進(jìn)行升級(jí)換代或免疫增效。
[0005]近年來(lái)，國(guó)際上逐步發(fā)展起一種新型基因疫苗載體系統(tǒng)，稱為復(fù)制子DNA疫苗(即可復(fù)制型DNA疫苗)，將具有“自主復(fù)制”功能的RNA病毒復(fù)制元件置于DNA疫苗載體中構(gòu)建而成。用于開發(fā)復(fù)制子載體的主要是單股正鏈RNA病毒(如甲病毒)，其中以塞姆利基森林病毒SemLiki Forest virus (SFV)的研究最為廣泛。與傳統(tǒng)DNA疫苗相比，可復(fù)制型DNA疫苗在安全性和高效性兩個(gè)方面都有重要突破。復(fù)制子DNA疫苗不僅可以“自主復(fù)制”高水平表達(dá)外源基因，而且在自主復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA中間體還是高效的免疫佐劑(能夠刺激細(xì)胞因子及分子伴侶產(chǎn)生)，可同時(shí)誘導(dǎo)全身免疫、粘膜免疫、抗體應(yīng)答和CTL反應(yīng)。此外，復(fù)制子DNA疫苗的自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均在胞漿內(nèi)完成，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞最后會(huì)發(fā)生凋亡，因此不會(huì)與宿主染色體發(fā)生整合。新型復(fù)制子DNA疫苗既克服了常規(guī)DNA疫苗免疫力低下、安全性不能保障的缺陷，又保留了 DNA疫苗穩(wěn)定、低成本、激發(fā)免疫反應(yīng)全面的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]眾所周知，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前惡性腫瘤治療的關(guān)鍵性難題，抗腫瘤主動(dòng)免疫治療有望通過激活患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，建立機(jī)體對(duì)腫瘤抗原的免疫記憶，防止腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。當(dāng)前，治療性疫苗已經(jīng)成為國(guó)際生物技術(shù)藥物開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，本發(fā)明的發(fā)明人前期以塞姆利基森林病毒SemLiki Forest virus (SFV)可復(fù)制型衍生的真核表達(dá)載體PSFVl為骨架，構(gòu)建了可復(fù)制型DNA載體pSVK，與傳統(tǒng)DNA疫苗相比，可復(fù)制型DNA疫苗具有表達(dá)更高效、應(yīng)用更安全、成本更低廉的優(yōu)勢(shì)。
[0007]腫瘤血管生成概述[0008]健康成人的脈管系統(tǒng)是非常穩(wěn)定的，除了卵巢黃體中血管周期性生長(zhǎng)和妊娠期的血管生長(zhǎng)等少數(shù)情況外，罕見新生血管生成。腫瘤血管生成的概念由Judah Folkman于1971年首次提出，它是指內(nèi)皮細(xì)胞在相關(guān)刺激血管生成信號(hào)傳導(dǎo)的作用下由相對(duì)靜止轉(zhuǎn)為快速生長(zhǎng)，從而由已存在的血管組織中產(chǎn)生新生血管組織的過程，這是一個(gè)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用的多步驟復(fù)雜過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、分化、細(xì)胞外基質(zhì)降解及基底膜形成。1996年，Hanahan等又提出了 “血管生成開關(guān)(angiogenic switch) ”的概念，將腫瘤的生長(zhǎng)分為血管前期和血管期:血管前期的腫瘤細(xì)胞主要依靠被動(dòng)擴(kuò)散從周圍組織獲取氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并運(yùn)走代謝廢物，如果沒有新生血管長(zhǎng)入，腫瘤細(xì)胞將處于休眠狀態(tài)或發(fā)生凋亡，腫瘤組織生長(zhǎng)的最大直徑不會(huì)超過l_2mm ;血管期，由于新生血管的生成滿足了腫瘤組織進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝的需要，從而使腫瘤細(xì)胞不斷分裂增殖，并且成為腫瘤組織浸潤(rùn)侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第一路徑。另有研究表明，除實(shí)體腫瘤外，血管生成在血液惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理中同樣發(fā)揮了重要作用。因此“血管生成開關(guān)”是惡性腫瘤早期的關(guān)鍵事件。在缺氧、炎癥、代謝性應(yīng)激等刺激原作用下，促血管生成因子呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，打破了與血管生成抑制因子之間的平衡狀態(tài)，促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成。主要的促血管生成因子有:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)、酸性/堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acid/basic fibroblast growth factor, aFGF/bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowth factor, TGF)、膜島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、血管生成素(angiogenesis)等；主要的血管生成抑制因子有:TNF_a、血管抑素(angiostatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、白介素-12 (interleukin-12)等。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的最為強(qiáng)大專一的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因子。
[0009]1、VEGF 及其受體 VEGFR
[0010]人VEGF 家族包括 VEGF-A (即通常所指的 VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤生長(zhǎng)因子(placenta growth factor, PLGF)以及內(nèi)分泌腺來(lái)源的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor, EG-VEGF),其中VEGF-A是VEGF家族中最重要的成員，它是由二硫鍵共價(jià)相連的同源二聚體所構(gòu)成的糖蛋白，相對(duì)分子量約34-46 X 103kD,序列高度保守，因其mRNA剪切不同產(chǎn)生6種亞型:VEGFm、VEGF145, VEGF165, VEG F183、VEGF189和VEGF2tl6，其中VEGF165亞型是最重要的單體，發(fā)揮促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
[0011]VEGFR 家族目前發(fā)現(xiàn)有 5 種，其中 VEGFR1 (Flt-1)、VEGFR2 (KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)屬于酪氨酸激酶受體(receptortyrosine kinases,RTKs)超家族,另外兩種為Npn (neuropil I in)-1及Npn_2。VEGFR是VEGF生物信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)通路的門戶，VEGF與之結(jié)合后使其二聚體化，進(jìn)一步激活受體酪氨酸激酶導(dǎo)致其自身磷酸化，受體自身磷酸化啟動(dòng)了下游通路(包括一系列第二信使的激活)。VEGFR2由1356個(gè)氨基酸構(gòu)成，與RTK家族其它成員一樣，具有4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域:細(xì)胞外7個(gè)免疫球蛋白樣配體結(jié)合域，I個(gè)跨膜區(qū)域，膜內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域及下游羧基末端區(qū)域。研究表明，第3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂潴w結(jié)合起關(guān)鍵作用，第2和4個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠調(diào)節(jié)配體結(jié)合速率，第5和6個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂潴w結(jié)合到受體后的固定是必須的，第I個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域可能參與調(diào)控配體的結(jié)合。VEGFR1主要是在胚胎發(fā)生過程中誘導(dǎo)VEGF-A與VEGFR2結(jié)合，發(fā)揮其促血管生成作用；VEGFR3信號(hào)通路主要參與調(diào)控淋巴管形成；VEGF/VEGFR2信號(hào)通路是生理性及病理性血管生成最重要的限速步驟，對(duì)腫瘤的血管生成至關(guān)重要。因此，VEGF及VEGFR2不僅是目前臨床中各種抗腫瘤血管靶向治療最主要的靶位，而且也是腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。
[0012]2、以VEGF/VEGFR2為靶位的抗腫瘤血管生成主動(dòng)免疫治療
[0013]自2003年貝伐單抗(Bevacizumab)被FDA批準(zhǔn)治療結(jié)直腸癌以來(lái),至今已有多種抗血管生成單克隆抗體被證實(shí)具有抗腫瘤的臨床療效，但這些藥物不僅費(fèi)用高昂，而且抗血管能力有限、血漿半衰期短，臨床治療經(jīng)常需要大劑量長(zhǎng)期靜脈給藥，由此帶來(lái)較多毒副反應(yīng)，使患者需要住院治療及特殊護(hù)理，這些都給患者及醫(yī)療體系帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著分子免疫學(xué)及腫瘤免疫學(xué)的迅猛發(fā)展，腫瘤治療性疫苗因其特異性高、針對(duì)性強(qiáng)且毒副作用小等特點(diǎn)，已經(jīng)成為惡性腫瘤主動(dòng)免疫治療發(fā)展的重要方向，特別是以VEGF/VEGFR2為靶位的抗腫瘤血管生成主動(dòng)免疫治療取得了令人鼓舞的研究進(jìn)展。[0014]經(jīng)過多年的失敗與努力，第一個(gè)腫瘤治療性疫苗PR0VENGE已經(jīng)于2012年在美國(guó)由 FDA 批準(zhǔn)上市用于治療前列腺癌(Cheever MA, Higano CS.PROVENGE (Sipuleucel-T) inprostate cancer:thefirst FDA-approved therapeutic cancer vaccine.Clin CancerRes, 2011，17:3520-3526.)，很多其它種類的腫瘤治療性疫苗也處在不同的研究階段，這些治療性疫苗都是以腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigens, TAA)為祀位的，而抗腫瘤血管生成主動(dòng)免疫治療攻擊的是腫瘤組織中基因相對(duì)穩(wěn)定且容易到達(dá)的血管系統(tǒng)，以內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)的各種抗原為靶位，可以克服長(zhǎng)期以來(lái)各種單純攻擊腫瘤細(xì)胞治療的局限性，如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、MHC抗原丟失、細(xì)胞水平上的免疫抑制及免疫逃避、以及血腦屏障等生理屏障的阻礙等，因此，抗腫瘤血管生成主動(dòng)免疫治療作為一種嶄新的抗腫瘤治療策略，呈現(xiàn)出誘人的前景。但是，抗腫瘤血管生成主動(dòng)免疫治療仍然存在以下一些不足:①腫瘤組織可能利用其它非VEGF信號(hào)通路誘導(dǎo)新生血管形成或利用血管生成擬態(tài)(即腫瘤細(xì)胞模擬并取代內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣的結(jié)構(gòu))繼續(xù)得到血供。②抗腫瘤血管生成治療理論上只能抑制腫瘤組織生長(zhǎng)，單純的抗血管生成并不能徹底根除腫瘤細(xì)胞。大量研究也表明，抗血管生成治療與傳統(tǒng)治療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)會(huì)發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。③抗血管生成治療可能會(huì)引起高血壓、心血管栓塞等不良反應(yīng)，對(duì)正常傷口的愈合以及女性月經(jīng)周期的變化也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。總之，抗血管生成主動(dòng)免疫治療這一領(lǐng)域?qū)?lái)的發(fā)展有待于克服上述各種不足，有望為腫瘤患者提供一種嶄新的治療選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明針對(duì)惡性腫瘤治療中的核心難題“免疫耐受”，基于自主研發(fā)的復(fù)制子DNA疫苗載體PSVK，開展了系統(tǒng)性的免疫增效策略研究，并成功構(gòu)建了一種新型的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗。
[0016]本發(fā)明所提供的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗的活性成分包括以下組分:
[0017]I)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)的抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗，命名為pSVK-CAVA，所述腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR)基因、異位人絨毛膜促性腺激素hCG β -CTP37 (hmCTP)基因、人 IgG Fe 段基因(GenBank 號(hào):Z17370)、GPI 基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank 號(hào):NM-000758)和 B7.1 基因(GenBank 號(hào):NM-005191)構(gòu)成，腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)的結(jié)構(gòu)如圖1所示；
[0018]2)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)的抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗，命名為pSVK-CAVE，所述腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由異種化的小鼠VEGFR2胞外l-4IgG樣區(qū)域(腫瘤血管靶抗原)基因、人IgGFe 段(GenBank 號(hào):Z17370)基因、GPI 基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列和人 IL-12基因的 p35 亞基(GenBank 號(hào):GI24430218)和 p40 亞基(GenBank 號(hào):GI24497437)構(gòu)成，腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0019]所述復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0020]所述腫瘤抗原復(fù)合蛋白(CAVA)的氨基酸序列如序列表中序列2(939aa)所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列3 (3752bp)所示，抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4(14748bp)所示；
[0021]序列表中序列2由939個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_91位氨基酸殘基為凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR),自氨基端第92-169位氨基酸殘基為異位人絨毛膜促性腺激素hCGi3 -CTP37 (hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸殘基為人IgG Fe段，自氨基端第500-533位氨基酸殘基為GPI，自氨基端第534-677位氨基酸殘基為GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸殘基為B7.1 ；
[0022]序列表中序列3由3752個(gè)堿基組成，自5’端第1_273位堿基編碼凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位堿基編碼異位人絨毛膜促性腺激素hCG β-CTP37 (hmCTP)基因，自5’端第508-1774位堿基編碼人IgG Fe段，自5’端第1775-1901位堿基編碼GPI融合基因，自5’端第1902-2549位堿基為IRES序列，自5’端第2550-2978位堿基編碼GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位堿基編碼B7.1基因；
[0023]序列表中序列4由14748個(gè)堿基組成，自5’端第7484-11235位堿基編碼CAVA基因，其余部分為pSVK 載體序列。
[0024]所述腫瘤血管復(fù)合蛋白(CAVE)的氨基酸殘基序列如序列表中序列5(1341aa)所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列6 (4876bp)所示，抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7(15986bp)所示；
[0025]序列表中序列5由1341個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_416位氨基酸殘基為小鼠VEGFR2胞外l-4IgG樣區(qū)域(腫瘤血管靶抗原)，自氨基端第417-746位氨基酸殘基為人IgG Fe段，自氨基端第747-780位氨基酸殘基為GPI，自氨基端第781-1341位氨基酸殘基為人IL-12 (包含p35和p40兩個(gè)亞基)；
[0026]序列表中序列6由4876個(gè)堿基組成，自5’端第1-1248位堿基編碼小鼠VEGFR2胞外l-4IgG樣區(qū)域(腫瘤血管靶抗原)基因，自5’端第1249-2490位堿基編碼人IgG Fe段，自5，端第2491-2617位堿基編碼GPI基因，自5，端第2618-3194位堿基為IRES序列，自5’端第3195-4876位堿基編碼人IL_12(包含p35和p40兩個(gè)亞基)基因；
[0027]序列表中序列7由15986個(gè)堿基組成，自5’端第7484-12458位堿基編碼CAVE基因，其余部分為pSVK載體序列。
[0028]本發(fā)明的雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗可采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式進(jìn)行免疫，免疫劑量一般為 1-100 μ g (pSVK-CAVAl-100 μ g, pSVK-CAVE 1-100 μ g, pSVK-CAVA 與pSVK-CAVE的注射劑量比例為1:l)/kg，療程為1-6個(gè)月。免疫劑量和療程可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。
[0029]本發(fā)明提供了一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗，其活性成分是選擇在多種實(shí)體腫瘤中廣泛表達(dá)的兩種腫瘤抗原h(huán)CG和Survivin，并選擇與腫瘤血管新生關(guān)系密切的靶點(diǎn)VEGFR2，利用異種化抗原設(shè)計(jì)技術(shù)，配合多種免疫增效策略，可以有效打破腫瘤自身抗原的免疫耐受，激活高效的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。通過預(yù)防模型免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 pSVK-CAVA與pSVK-CAVE聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤療效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用兩種可復(fù)制型DNA疫苗pSVK-CAVA及pSVK-CAVE與單獨(dú)應(yīng)用及空白對(duì)照組相比，在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，能夠抑制移植瘤的生長(zhǎng)，通過這兩種疫苗的聯(lián)合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了:①直接攻擊瘤細(xì)胞本身，抑制和清除術(shù)后殘存的腫瘤細(xì)胞；②遏制腫瘤新生血管生成，使腫瘤生長(zhǎng)缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；③最終依靠激發(fā)的雙重免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)徹底控制腫瘤、并保持長(zhǎng)期不復(fù)發(fā)狀態(tài)，提高惡性腫瘤的臨床治愈率。本發(fā)明通過構(gòu)建新型雙質(zhì)?？蓮?fù)制型抗腫瘤DNA疫苗，實(shí)現(xiàn)了特異性腫瘤抗原異種化改造、加強(qiáng)抗原遞呈能力、分子內(nèi)佐劑協(xié)同增效、高效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，有望打破惡性腫瘤治療中“免疫耐受”這一核心難題，為抗腫瘤主動(dòng)免疫治提供一種新的選擇，應(yīng)用前景廣闊。
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為腫瘤抗原復(fù)合基因的構(gòu)成示意圖
[0032]圖2為腫瘤血管復(fù)合基因的構(gòu)成示意圖
[0033]圖3為復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK的物理圖譜
[0034]圖4為抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA的物理圖譜
[0035]圖5為攜帶腫瘤血管復(fù)合基因的重組質(zhì)粒pVAXl-CAVE的物理圖譜
[0036]圖6為經(jīng)酶切、純化獲得的pSVK載體及腫瘤血管復(fù)合基因目的片段的電泳檢測(cè)結(jié)果
[0037]圖7為pSVK-CAVE菌液的PCR鑒定結(jié)果
[0038]圖8為抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE的物理圖譜
[0039]圖9為各組免疫小鼠皮下移植瘤成瘤時(shí)間
[0040]圖10為各組小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線
[0041]圖11為手術(shù)剝離各組小鼠腫瘤的離體瘤重
[0042]圖12為皮下移植瘤攻擊后各組小鼠的存活時(shí)間
[0043]圖13為ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中的特異抗體的OD450值
[0044]圖14為ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中抗體與人VEGFR2交叉免疫反應(yīng)0D450nm值
[0045]圖15為免疫后各組小鼠IFN- Y分泌水平的ELI SPOT檢測(cè)結(jié)果
[0046]圖16為小鼠皮下移植海藻酸鹽包裹Renca腫瘤細(xì)胞顆粒表面毛細(xì)血管生成情況
[0047]圖17為海藻酸鹽包裹Renca腫瘤細(xì)胞顆粒表面毛細(xì)血管含血量檢測(cè)結(jié)果
[0048]圖18為免疫后小鼠腫瘤組織中毛細(xì)血管密度病理切片及免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。[0050]所述百分比濃度如無(wú)特別說明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0051]實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。
[0052]所用引物由大連寶生物公司合成。
[0053]實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0054]實(shí)施例1、制備廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗
[0055]本發(fā)明廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗的活性成分為抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA和抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE，具體構(gòu)建方法如下:
[0056]一、構(gòu)建抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA
[0057]以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)的抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA。
[0058]其中，腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR)基因、異位人絨毛膜促性腺激素hCGi3-CTP37(hmCTP)基因、人IgG Fe段基因(GenBank 號(hào):Z17370)、GPI 基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank號(hào):NM-000758)和B7.1基因(GenBank號(hào):NM_005191)組成，腫瘤抗原復(fù)合基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0059]抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA具體構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0060]1、構(gòu)建復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK
[0061]1.1構(gòu)建攜帶PS與KANA融合基因(PS-KANA)的重組載體pUC19-PS_KANA
[0062]重組載體pUC19-PS-KANA的構(gòu)建方法如下:
[0063]I)擴(kuò)增PS基因:以含有氨芐青霉素抗性基因的復(fù)制子DNA疫苗載體 pSCAl (構(gòu)建方法參見文獻(xiàn) Yu Y Z, Sun Z W，Yu W Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005，21 (5):33-38)為模板，在引物 PSCA_F(5’ -CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3’ )和 PSCA-R(5，-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3’ )的引導(dǎo)下 PCR 擴(kuò)增氨芐青霉素抗性基因的旁側(cè)序列，所述5’端旁側(cè)序列含有限制性內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn)，所述3’端旁側(cè)序列含有限制性內(nèi)切酶Sph I識(shí)別位點(diǎn)；PCR反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液10 μ I ,MgCl2 (2.5mM) 10 μ I，dNTPs 混合物(2.5mM)8y I，合成引物(20 μ M) PSCA-F 和 PSCA-R各2μ l，Taq DNA聚合酶(5U/μ I) 2 μ 1，加去離子水至100 μ I ;PCR反應(yīng)條件為:先94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸Imin，共30個(gè)循環(huán)，最后72。。繼續(xù)延伸IOmin ;反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了全長(zhǎng)1273bp的基因片段，回收并純化該基因片段，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因片段的核苷酸與預(yù)期結(jié)果相符，將該基因片段命名為PS基因。然后，將PS基因用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sph I進(jìn)行雙酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Sph I雙酶切的載體pUC19連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)濃度50 μ g/mL的氨芐青霉素抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定結(jié)果表明用上述方法構(gòu)建得到了序列及插入位置均正確的攜帶PS基因的重組載體，命名為PUC19-PS。
[0064]2)獲得PS與KANA融合基因(PS-KANA):以含有卡那霉素抗性基因的載體PVAXI (購(gòu)自 Invitrogen 公司)為模板，在引物 KANA_F(5’ -CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’)和KANA-R (5’ -CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’ )的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增5’端攜帶限制性內(nèi)切酶Spe I識(shí)別位點(diǎn)、3’端攜帶限制性內(nèi)切酶Xho I識(shí)別位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因；PCR反應(yīng)體系為:10XPCR 緩沖液 5 μ 1，MgCl2 (2.5mM)5y I, dNTPs 混合物(2.5πιΜ)4μ 1，合成引物(20 μ Μ)KANA-F和 KANA-R各 I μ I, Taq DNA聚合酶(5U/μ I) I μ I，加去離子水至 50 μ I ；PCR反應(yīng)條件為:先94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C繼續(xù)延伸IOmin ;反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了全長(zhǎng)795bp的基因片段，回收并純化該基因片段，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因片段的核苷酸序列與預(yù)期結(jié)果相符，將該基因片段命名為KANA ；然后將KANA基因用限制性內(nèi)切酶SpeI和Xho I進(jìn)行雙酶切后，與同樣經(jīng)SpeI和Xho I雙酶切的重組載體PUC19-PS (步驟I)得到)連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)濃度50μ g/mL的氨芐青霉素抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR和酶切鑒定；鑒定結(jié)果表明用上述方法構(gòu)建得到了序列及插入位置均正確的攜帶PS與KANA融合基因(PS-KANA)的重組載體，命名為PUC19-PS-KANA。[0065]1.2獲得復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK
[0066]延續(xù)上述步驟，將復(fù)制子DNA載體pSCAl (以載體pSFVl為骨架，用CMV IE啟動(dòng)子替換SP6啟動(dòng)子，并在3’ UTR下游插入BGH轉(zhuǎn)錄終止子，構(gòu)建基于DNA的復(fù)制子載體PSCA1，使得在多克隆位點(diǎn)插入外源基因而構(gòu)建的質(zhì)粒DNA可直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄 RNA 的繁瑣操作[Yu Y Z, Sun Z V, Yu V Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005,21 (5):33-38])中的氨芐青霉素基因置換為卡那霉素基因，得到復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK，進(jìn)行以下步驟:
[0067]3)抗性基因置換:具體方法為:將載體pSCAl先用SphI單酶切，回收并純化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，將酶切后產(chǎn)生的粘性末端補(bǔ)平后回收、純化，再用SpeI進(jìn)行單酶切并回收、純化后作為目的載體(該目的載體的一端為平末端，另一端則是粘性末端Spel)，經(jīng)過該步操作載體pSCAl中的氨芐抗性基因及其旁側(cè)序列已被酶切去除；將步驟2)得到的重組載體pUC19-PS-KANA先用Hind III單酶切，回收并純化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，將酶切后產(chǎn)生的粘性末端補(bǔ)平后回收、純化，然后再用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理，最后再用Xba I單酶切，回收并純化2100bp的DNA片段(該DNA片段的一端為平末端，另一端為粘性末端XbaI)，該步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCAl載體中氨芐抗性基因的旁側(cè)序列與KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA ;利用SpeI和XbaI屬于同尾酶的特性，將回收并純化的目的載體和DNA片段連接，經(jīng)該步操作，PS-KANA融合基因被連入載體pSCAl中原氨芐基因及其旁側(cè)序列所在位置，實(shí)現(xiàn)了 pSCAl載體中抗性基因的置換；
[0068]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行抗性篩選，篩選結(jié)果表明連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中后在氨芐青霉素抗性的LB平板中不再生長(zhǎng)，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生長(zhǎng)良好，表明復(fù)制子DNA疫苗載體pSCAl中的氨芐青霉素基因被成功置換為卡那霉素基因；再進(jìn)行PCR和酶切鑒定。[0069]鑒定結(jié)果表明:用上述方法構(gòu)建得到了序列及插入位置均正確的攜帶卡那霉素抗性基因的復(fù)制子DAN疫苗載體，命名為pSVK，測(cè)序結(jié)果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其物理圖譜如圖3所示。
[0070]2、抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA (又稱PSCK_2PFcGB)的構(gòu)建
[0071 ] 抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗命名為pSVK-CAVA (又稱PSCK_2PFcGB)的構(gòu)建方法參見博士論文:《新型可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的抑瘤活性及免疫學(xué)機(jī)制研究》，張亮，中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯，2012年第7期，
【公開日】期，20120710。其中腫瘤抗原復(fù)合基因CAVA的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示,其物理圖譜如圖4所示。
[0072]序列表中序列2由939個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_91位氨基酸殘基為凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR),自氨基端第92-169位氨基酸殘基為異位人絨毛膜促性腺激素hCGi3 -CTP37 (hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸殘基為人IgG Fe段，自氨基端第500-533位氨基酸殘基為GPI，自氨基端第534-677位氨基酸殘基為GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸殘基為B7.1 ；
[0073]序列表中序列3由3752個(gè)堿基組成，自5’端第1_273位堿基編碼凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位堿基編碼異位人絨毛膜促性腺激素hCG β-CTP37 (hmCTP)基因，自5’端第508-1774位堿基編碼人IgG Fe段，自5’端第1775-1901位堿基編碼GPI融合基因，自5’端第1902-2549位堿基為IRES序列，自5’端第2550-2978位堿基編碼GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位堿基編碼B7.1基因； [0074]序列表中序列4由14748個(gè)堿基組成，自5’端第7484-11235位堿基編碼CAVA基因，其余部分為pSVK載體序列。
[0075]二、構(gòu)建抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE
[0076]以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)的抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE。
[0077]腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由異種化的小鼠VEGFR2胞外l_4IgG樣區(qū)域(腫瘤血管靶抗原)基因、人IgG Fe段(GenBank號(hào):Z17370)基因、GPI基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列和人 IL_12p35 亞基(GenBank 號(hào):GI24430218)和 p40亞基(GenBank號(hào):GI24497437)基因組成，腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0078]抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE具體構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0079]1、構(gòu)建復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK
[0080]與步驟一中內(nèi)容相同。
[0081]2、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pVAX1-mVEGFR2(1_4)Fe hIL12 (簡(jiǎn)稱 pVAXl-CAVE)
[0082]攜帶腫瘤血管復(fù)合基因的重組質(zhì)粒pVAXl-CAVE的構(gòu)建方法參見碩士論文:《免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗的基礎(chǔ)研究》，王偉，
【公開日】期2010年5月，其物理圖譜如圖5所示。
[0083]3、抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE的構(gòu)建
[0084]3.1pSVK 及 pVAXl-CAVE 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0085]將質(zhì)粒pVAXl-CAVE和pSVK分別轉(zhuǎn)化E.col1.DH5 α感受態(tài)大腸桿菌，具體操作步驟如下:
[0086]a.從_70°C冰箱取2支感受態(tài)E.col1.DH5 α，立即置于冰浴中，分別加入上述質(zhì)粒各I μ 1，輕柔混勻后于4°C冰箱中冰浴30min ；
[0087]b.冰浴結(jié)束后，將上述感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至42°C水浴鍋中熱休克90s ；
[0088]c.熱休克結(jié)束后，將感受態(tài)細(xì)胞重新放置在冰浴中靜置l_2min ;
[0089]d.取轉(zhuǎn)化后的菌體分別均勻涂布于含10 μ g/mL(pSVK)、50 μ g/mL (p VAX 1-CAVE)卡那霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)約12h ；
[0090]e.培養(yǎng)結(jié)束后，挑取單一克隆菌落，分別接種于含有上述卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C搖床中振蕩培養(yǎng)過夜(10-12小時(shí))。
[0091]3.2pSVK及pVAXl-CAVE質(zhì)粒的小量提取
[0092]按照北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提這兩種質(zhì)粒，具體操作步驟參見質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書。
[0093]3.3pSVK載體的酶切、純化
[0094]首先利用限制性內(nèi)切酶Sma I對(duì)pSVK載體進(jìn)行單酶切，使環(huán)狀質(zhì)粒線性化，獲得擁有兩個(gè)平端的線性化的pSVK載體，酶切體系如下:
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其活性成分包括以下組分: 1)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)的抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗，命名為pSVK-CAVA，所述腫瘤抗原復(fù)合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin腫瘤抗原(SUR)基因、異位人絨毛膜促性腺激素hCG β -CTP37 (hmCTP)基因、人 IgG Fe 段基因(GenBank 號(hào):Z17370)、GPI 基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列、GM-CSF 基因(GenBank 號(hào):NM-000758)和 B7.1 基因(GenBank 號(hào):NM-005191)組成； 2)以復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)的抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗，命名為pSVK-CAVE，所述腫瘤血管復(fù)合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由異種化的小鼠VEGFR2胞外l-4IgG樣區(qū)域(腫瘤血管靶抗原)基因、人IgG Fe段(GenBank 號(hào):Z17370)基因、GPI 基因(GenBank 號(hào):XM676434)、IRES 序列和人 IL_12(包含P35和p40兩個(gè)亞基，通過Furin2A多肽連接)基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其特征在于:所述復(fù)制子DNA疫苗載體pSVK的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗，其特征在于:所述腫瘤抗原復(fù)合蛋白(CAVA)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其特征在于:編碼所述腫瘤抗原復(fù)合蛋白(CAVA)的氨基酸殘基序列如序列表中序列3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，抗腫瘤抗原復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其特征在于:所述腫瘤血管復(fù)合蛋白(CAVE)的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)?？蓮?fù)制型DNA疫苗，其特征在于:編碼腫瘤血管復(fù)合蛋白(CAVE)的氨基酸殘基序列如序列表中序列6所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒可復(fù)制型DNA疫苗，其特征在于:抗腫瘤血管復(fù)制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103948944SQ201410211389
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月20日
【發(fā)明者】于繼云, 閻瑾琦, 王偉, 張亮, 徐元基, 張巍, 賈銳, 王越, 王宇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所