專利名稱：：腫瘤相關(guān)抗原50化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種腫瘤相關(guān)抗原50(CA50)化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一類嚴重威脅人類生命和健康的惡性疾病。冊0指出及早診斷和治療是對抗癌癥的有效手段之一，腫瘤的早期診斷是非常重要的。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)有一百多種，由于大多數(shù)情況下體內(nèi)肺瘤標(biāo)志物的含量都非常低，一般的檢測方法很難對其進行精確的定量。CA50是一種非特異性的廣譜腫瘤標(biāo)志物，其對胰腺、肝臟、結(jié)腸等消化系統(tǒng)腫瘤的診斷有較高的價值。因此，如何能夠有效地在腫瘤診斷中應(yīng)用CA50—直是人們關(guān)注并希望解決的問題。近十年來標(biāo)記免疫分析技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究及臨床疾病診斷各領(lǐng)域。其中技術(shù)工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術(shù)的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號各不相同。根據(jù)大量的實驗結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來看，依次為化學(xué)發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在諸多缺點，如操作復(fù)雜、測定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時間短、放射性污染、儀器昂貴等?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，然而，目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在CA50免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用方面仍是空白。一方面，產(chǎn)業(yè)應(yīng)用需要解決成品的高效性和穩(wěn)定性問題。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒均為封閉式全自動化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于開放式的化學(xué)發(fā)光測量儀，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明同時解決了上述問題，即將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與CA50的免疫分析學(xué)有效地結(jié)合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測CA50的試劑盒，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤相關(guān)抗原50(CA50)化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)包被有腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體的載體；3)酶標(biāo)記的肺瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體；以及4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。進一步，根據(jù)本發(fā)明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以肺瘤相關(guān)抗原50純品配制肺瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)用酶標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體；3)以腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體包被栽體；4)分裝上述腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及5)組裝為成品。在上述根據(jù)本發(fā)明的試劑盒及其制備方法中，所述載體可以為固相栽體、優(yōu)選微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。所述酶可以為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。所述化學(xué)發(fā)光底物可以為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1，2-二氧乙烷類衍生物可以為(金剛烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，其中所述包被栽體的步驟3)包括以下步驟1)包被配制包被液，基于1000mL所述包被液包含7.30g的檸檬酸三鈉和4.45g的檸檬酸，所迷包被液的pH值為4.5~4.8，然后將制備的包被液與腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體混合，并將所得混合液負栽于栽體上；2)用生理鹽水洗滌上述載體；以及3)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO42H20,2.9gNaH2P04.12H20、10gBSA、和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.0-7.5，然后將所得封閉液負栽于上述洗滌后的載體上。具體的上述試劑盒可以包括CA50校準(zhǔn)品、抗體包被板、酶標(biāo)記物與化學(xué)發(fā)光底物液、20倍濃縮洗滌液等。其中，所述CA50校準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于90%、抗體包被板為48或96孔的微孔板條、酶標(biāo)記CA50單抗為偶聯(lián)堿性磷酸酶、化學(xué)發(fā)光底物液為AMPPD、濃縮洗滌液為Tris-HCl。本發(fā)明"腫瘤相關(guān)抗原50化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒"可以非常專一地定量檢測出病人CA50的含量，可以根據(jù)CA50含量的多少判斷治療胰腺、肝臟、結(jié)腸等消化系統(tǒng)腫瘤病人藥物的效果及其病情的變化。它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。該CA50測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的各項指標(biāo)均達到酶聯(lián)免疫分析法。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標(biāo)記的CA50單抗與載體上包被的CA50單抗和^皮測樣品的CA50抗原形成"雙抗體夾心"結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心一步法"反應(yīng)模式，既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理、又確保了檢測的靈敏性。另夕卜，這種模式還便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現(xiàn)今的酶聯(lián)免疫吸附分析靈敏度提高約10倍，可為乳腺癌的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。圖1說明了本發(fā)明的腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒臨界值的確定。圖2顯示了天壇醫(yī)院用本發(fā)明的定量測定試劑盒和PerkinElmer試劑盒檢測69份腫瘤病人相關(guān)性的結(jié)果。其中，PerkinElmer試劑盒的測定值為X軸，本發(fā)明的試劑盒的測定值為Y軸，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理得相關(guān)系數(shù)r=0.9卯2,y=0.9569x+3.0073。圖3顯示了友誼醫(yī)院用本發(fā)明的試劑盒和PerkinElmer試劑盒檢測50份腫瘤病人相關(guān)性的結(jié)果。其中，PerkinElmer試劑盒的測定值為X軸，本發(fā)明腫的試劑盒的測定值為Y軸，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理得相關(guān)系數(shù)r=0.9835,y=0.8940x+0.5785。圖4顯示了北華醫(yī)院用本發(fā)明的試劑盒杏PerkinElmer試劑盒檢測63份腫瘤病A^目關(guān)性的結(jié)果。其中，PerkinElmer試劑盒的測定值為X軸，本發(fā)明腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的測定值為Y軸，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理得相關(guān)系數(shù)r=0.9829，y=0.9872x+0.1394。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的CA50定量測定試劑盒一、酶標(biāo)抗體制備CA50單抗用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對PBS充分透析，加等體積甘油，-20。C以下保存。二、CA50校準(zhǔn)品的制備用CA50純品配制，分裝O、10、20、40、80、140U/ml共6瓶。三、酶標(biāo)抗體濃度選定采用方陣法選擇酶標(biāo)抗體的工作濃度大于1:6000。四、固相包被板的制備(1)包被擰檬酸三鈉2.92g檸檬酸1.78g雙蒸水400ml溶解混勾后，調(diào)整PH至4.8，加入適量CA50單抗混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔130nL，4。C24h。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin3001ml雙蒸水定容至1000ml將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2~8'C保存。五、酶標(biāo)單抗稀釋液Tris12.120gBSA5gProclin1ml雙蒸水1000ml六、化學(xué)發(fā)光底物液NaH2P04.2H204gNa2HP04'12H2026g雙蒸水1000mLProclin3001mLAMPPD200ml溶解后混合均勻。七、20倍洗滌液Tris24gNaCl160gKC14gHC115ml去離子水1000ml調(diào)整PH至7.4八、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質(zhì)量鑒定，包括標(biāo)記抗體與包被抗體的活性、載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩沖液和保護液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于ALP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比實驗最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標(biāo)記物長期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。本發(fā)明的發(fā)明人還對試劑盒的反應(yīng)模式和反應(yīng)條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應(yīng)模式，并就不同的反應(yīng)時間對實驗結(jié)果的影響進行了實驗，確定最適合的反應(yīng)時間。通過對化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時間的測定及不同發(fā)光時間對測定值的影響實驗表明在加入化學(xué)發(fā)光底物液后30-90分鐘之間進行測量為最佳，其結(jié)果也較為準(zhǔn)確。實施例2-3制備本發(fā)明的CA50定量測定試劑盒除以辣根過氧化酶標(biāo)記CA50單抗、以魯米諾(luminol)作為化學(xué)發(fā)光底物、分別以塑料珠和塑料管作為載體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5外，其余均以與實施例1相同的方法制備CA50定量測定試劑盒。實施例4制備本發(fā)明的CA50定量測定試劑盒除以磁性顆粒作為栽體外，其余均以與實施例1相同的方法制備CA50定量測定定劑盒。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的CA50定量測定試劑盒的具體操作如下1)自4。C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)取出包被板條，插入板架上。3)反應(yīng)孔中分別加各濃度校準(zhǔn)品每孔加0、10、20、40、80、140U/ml各25yl,每次實驗設(shè)空白l孔，然后除空白孔外各孔加酶標(biāo)記物lOO)Lll,用微量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育l小時。4)甩去反應(yīng)液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學(xué)發(fā)光底物液50)a1,用樣i量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25'C)避光反應(yīng)30分鐘。6)必須于加化學(xué)發(fā)光底物液后的第30~90分鐘內(nèi)測量，在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU),測量時間1秒/孔。7)以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的CA50的濃度。實施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，見下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>說明"腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)"的準(zhǔn)確性、特異性、精密性、靈敏度和穩(wěn)定性是完全合格的。實施例7正常人的CA50含量及臨Ki的確定隨機取300例健康人血清用實施例1~4中制備的"腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)"測定結(jié)果如下300例健康人血清，求得出健康人測定值的平均值為13.16U/ml，標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.02U/ml，計算出的平均值加上2.7倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng)的濃度值作為臨界值，其結(jié)果為29.41U/ml。實施例8本發(fā)明的CA50定量測定試劑盒的臨床應(yīng)用與PerkinEhner試劑盒比較首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院、北華大學(xué)附屬醫(yī)院使用實施例1的腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒和PerkinElmer試劑盒同時檢測腫瘤病人182份，以比較兩種試劑盒之間的相關(guān)性。一、臨床血清標(biāo)本的來源各醫(yī)院臨床收集腫瘤病人血清標(biāo)本182份，正常人血清標(biāo)本300份。二、使用CA50定量測定試劑盒與PerkinElmer試劑盒比較1、方法三家醫(yī)院分別使用本發(fā)明實施例1的"胖瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒"(按其說明書操作)和PerkinElmer試劑盒(按其說明書操作)檢測同樣血樣182份，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表明，該兩種方法檢測的結(jié)果高度相關(guān)，如圖l-4顯示所示。2、結(jié)果三家醫(yī)院分別使用實施例1的"胂瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒"和PerkinElmer試劑盒檢測同樣血樣182份結(jié)果(見表2)表2.三家醫(yī)院兩種方法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>三家醫(yī)院使用"腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)"與PerkinElmer試劑盒檢測同樣血樣的比較結(jié)果，兩種方法均高度相關(guān)，P值均O.Ol。說明兩種方法具有同等的使用價值。上述結(jié)果表明試劑盒的各項指標(biāo)均達到或超過了ELISA法，且與ELISA法呈高度相關(guān)。試劑盒的穩(wěn)定性實-驗進行了37°C恒溫箱存放實驗和4'C恒溫儲存試驗。結(jié)果顯示，4'C放置9個月，37'C放置3天，試劑盒各項指標(biāo)符合穩(wěn)定性要求。權(quán)利要求1、一種腫瘤相關(guān)抗原50定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)包被有腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體的載體；3)酶標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體；以及4)上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述載體為固相載體。3、如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述栽體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。6、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。7、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以腫瘤相關(guān)抗原50純品配制腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)用酶標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體；3)以腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體包被載體；4)分裝上述肺瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及5)組裝為成品。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被栽體的步驟3)包括以下步驟1)包被配制包被液，基于lOOOmL所述包被液包含7.30g的檸檬酸三鈉和4.45g的檸檬酸，所述包被液的pH值為4.54.8，然后將制備的包被液與腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體混合，并將所得混合液負載于栽體上；2)用生理鹽水洗滌上述載體；以及3)封閉酉己制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO42H20,2.9gNaH2P0412H20、10gBSA、和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.0-7.5,然后將所得封閉液負栽于上述洗滌后的栽體上。9、如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述栽體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。10、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。11、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。12、如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種腫瘤相關(guān)抗原50化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體包被載體；3)腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體酶標(biāo)記物；以及4)化學(xué)發(fā)光底物。進一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以腫瘤相關(guān)抗原50純品配制腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品；2)以腫瘤相關(guān)抗原50的單克隆抗體包被載體；3)分裝上述腫瘤相關(guān)抗原50校準(zhǔn)品和化學(xué)發(fā)光底物；以及4)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N33/577GK101178405SQ200610114488公開日2008年5月14日申請日期2006年11月10日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者唐寶軍,應(yīng)希堂,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司