一種頭狀鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素的新型培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種頭狀鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素的新型培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲裂霉素(Mitomycin)是一種廣譜抗腫瘤抗生素，自1956年Hata第一個從頭狀鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離到絲裂霉素開始，由于它特殊的抗腫瘤作用引起人們廣泛的關(guān)注。
[0003]目前，國內(nèi)絲裂霉素的發(fā)酵生產(chǎn)采用二發(fā)酵模式，存在的主要問題有以下幾點(diǎn):
[0004]1絲裂霉素發(fā)酵水平較低，一般控制在800u/ml左右。
[0005]2國內(nèi)外針對絲裂霉素的生產(chǎn)工藝文獻(xiàn)資料報(bào)道得較少。
[0006]3發(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素的培養(yǎng)基中加入葡萄糖，經(jīng)高溫滅菌，易導(dǎo)致部分葡萄糖碳化，降低總糖含量，影響發(fā)酵液質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種發(fā)酵工藝簡單，有效提高發(fā)酵單位，同時最大限度的降低原輔料對發(fā)酵單位的影響，降低生產(chǎn)成本，且原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)絲裂霉素穩(wěn)定、高效生產(chǎn)的頭狀鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素的培養(yǎng)基。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)絲裂霉素的培養(yǎng)方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
[〇〇1〇]—種頭狀鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于
[0011]所述種子培養(yǎng)基的組成為:甘露醇4?8g/L、甘蔗糖蜜8?12g/L、麥芽糖5?9g/L、麥芽糖酶〇.02?0.06g/L、蠶蛹粉4?8g/L、玉米漿10?14ml/L、玉米蛋白粉3?7g/L、硫酸銨3?7g/L、輕質(zhì)碳酸|丐1?5g/L;
[0012]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:甘露醇4?8g/L、甘蔗糖蜜11?15g/L、麥芽糖9?13g/L、麥芽糖酶0.04?0.08g/L、蠶蛹粉6?10g/L、玉米漿15?19ml/L、玉米蛋白粉5?9g/L、硫酸銨4?8g/L、輕質(zhì)碳酸|丐3?7g/L、磷酸鎂0.2?0.6g/L、氯化鈉0.3?0.7g/L、硫酸亞鐵0.01?0.05g/L、聚醚改性硅油0.03?0.07ml/L、維生素B6 0.05?0.09g/L、泛酸0.01?0.05g/L、氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯0.5?lg/L。
[0013]—種利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)絲裂霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于所述工藝步驟為:
[〇〇14]1)種子培養(yǎng):首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的頭狀鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照〇.5?0.9L/m3的接種量接入該種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，至菌體濃度35?40%、pH值6?7、培養(yǎng)時間40?50h時移種；[〇〇15]2)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，移種比例控制在9?11 %，至菌體濃度35?40 %、還原糖<2.0g/L、氨基氮< 15mg/l00ml、化學(xué)效價> 1300u/mL、pH6.0?7.5、培養(yǎng)時間200?220h時終止發(fā)酵。
[〇〇16] 滅菌后的種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40?60mg/100ml、還原糖50?70g/L、pH:6.5?7.5;
[0017]滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮70?80mg/100ml、還原糖70?90g/L、pH:
6?7〇
[0018]所述培養(yǎng)好的母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:PH6?8;菌體濃度10?20% ;鏡檢無雜菌；搖瓶發(fā)酵單位800?1000u/ml。
[〇〇19] 所述種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.05MPa;罐溫28?29°C;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機(jī)械攪拌；1 lh?移種:30?50m3/h;攪拌轉(zhuǎn)速70?80r/min。
[0020]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
[0021] a溫度:采用變溫控制方法，0?60h:培養(yǎng)溫度29?30°C;61?170h:培養(yǎng)溫度28?29°C; 171?發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)溫度26?27°C;
[0022] b攪拌轉(zhuǎn)速:采用變頻攪拌控制方法，0?60h:轉(zhuǎn)速控制在90r/min; 61?170h:轉(zhuǎn)速控制在120r/min; 171h?發(fā)酵結(jié)束:轉(zhuǎn)速控制在80r/min;
[0023] c壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa;
[0024]d pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在6?7;
[0025] e 空氣流量:0 ?60h: 150 ?200m3/h; 61 ?170h: 250 ?300m3/h; 171h?發(fā)酵結(jié)束:100?150m3/h;
[0026] f溶氧控制:
[〇〇27]發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧；
[0028] 61?170h，溶氧控制在30%以上；
[〇〇29] 171?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在40%以上。
[0030]在發(fā)酵過程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料包括補(bǔ)蛋白胨、補(bǔ)水、補(bǔ)糖和pH控制，其中
[0031 ] a補(bǔ)蛋白胨工藝控制:
[〇〇32]發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)油，
[〇〇33]發(fā)酵時間在61?170h，當(dāng)氨基氮含量低于40mg/100ml，補(bǔ)入蛋白胨，控制氨基氮為40?60mg/100ml，每隔6?8h檢測發(fā)酵液氨基氮含量，
[〇〇34]發(fā)酵時間在171?200h，當(dāng)氨基氮含量低于20mg/100ml，補(bǔ)入蛋白胨，控制氨基氮含量為20?40mg/100ml，每隔6?8h檢測發(fā)酵液氨基氮含量，
[〇〇35]發(fā)酵時間在201h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)氨基氮含量低于10mg/100ml，補(bǔ)入蛋白胨，控制氨基氮含量為10?15mg/100ml，每隔6?8h檢測發(fā)酵液氨基氮含量；
[〇〇36] b補(bǔ)水工藝控制:
[〇〇37]發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，
[〇〇38]發(fā)酵時間在61?120h，當(dāng)菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45 %，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
[〇〇39]發(fā)酵時間在121?200h，當(dāng)菌體濃度高于40 %，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在35?40 %，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
[0040]發(fā)酵時間在201h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于35%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在30?35 %，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；
[0041 ]c補(bǔ)入麥芽糖控制:
[〇〇42]發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制，
[〇〇43]發(fā)酵61h至120h:還原糖含量<50g/L時，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在50?55g/L，
[0044]發(fā)酵121h至200h:還原糖含量<30g/L時，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在30?35g/L，
[0045]發(fā)酵201h至發(fā)酵結(jié)束:還原糖含量<5g/L時，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在5?10g/L。
[0046]上述麥芽糖溶液中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001?0.003%。
[0047]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在:
[0048]1本發(fā)明確認(rèn)了種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0049]2本發(fā)明對種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)的工藝進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，確認(rèn)了絲裂霉素最佳的發(fā)酵工藝和控制參數(shù)。達(dá)到的技術(shù)效果為發(fā)酵單位在1300u/ml以上。
[0050]3采用麥芽糖代替葡萄糖，經(jīng)高溫滅菌后，不影響培養(yǎng)基質(zhì)量。
[0051]4本發(fā)明適用于企業(yè)規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)絲裂霉素，能夠滿足年產(chǎn)100kg絲裂霉素生產(chǎn)需求。
[〇〇52]具體實(shí)施方法
[〇〇53]下面用實(shí)例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[〇〇54]下述實(shí)施例的菌種選用頭狀鏈霉菌:母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:pH6?8;菌體濃度10?20% ;鏡檢無雜菌;搖瓶發(fā)酵單位800?1000u/ml。
[0055]實(shí)施例1
[〇〇56]種子培養(yǎng):種子罐有效體積為lm3。
[0057]種子培養(yǎng)基的組成為:甘露醇4kg、甘蔗糖蜜8kg、麥芽糖5kg、麥芽糖酶0.02kg、蠶蛹粉4kg、玉米漿10L、玉米蛋白粉3kg、硫酸銨3kg、輕質(zhì)碳酸鈣lkg。滅菌后的種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮42/10〇1111、還原糖5]^凡4!1:7.4。
[〇〇58]將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的頭狀鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照0.5L/m3的接種量接入該種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)。
[〇〇59]種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.05MPa;罐溫28?29°C;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機(jī)械攪拌；llh?移種:30m3/h;攪拌轉(zhuǎn)速70r/min。至菌體濃度35%、pH6.8、培養(yǎng)時間40h時移種。
[0060]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵罐有效體積為10m3。
[〇〇611發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:甘露醇40kg、甘蔗糖蜜110kg、麥芽糖90kg、麥芽糖酶0.4kg、蠶蛹粉60kg、玉米衆(zhòng)150L、玉米蛋白粉50kg、硫酸銨40kg、輕質(zhì)碳酸|i530kg、磷酸鎂2kg、氯化鈉3kg、硫酸亞鐵0.lkg、聚醚改性硅油0.3L、維生素B6 0.5kg、泛酸0.1kg、氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯5kg。先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮70mg/100ml、還原糖71g/L、pH: 6.9。發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，移種比例控制在9%。
[〇〇62]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
[〇〇63] a溫度:采用變溫控制方法，0?60h:培養(yǎng)溫度29?30°C;61?170h:培養(yǎng)溫度28?29°C; 171?發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)溫度26?27°C。
[〇〇64] b攪拌轉(zhuǎn)速:采用變頻攪拌控制方法，0?60h:轉(zhuǎn)速控制在90r/min; 61?170h:轉(zhuǎn)速