經(jīng)由β-丙內(nèi)酯處理的殘留細(xì)胞DNA水平降低的細(xì)胞衍生病毒疫苗的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防病毒感染的疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明還提供減少與細(xì)胞培養(yǎng)物疫苗制備有關(guān)的污染物的方法。用DNA烷基化劑，例如β-丙內(nèi)酯(BPL)處理使殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解，從而提供了含有免疫原性蛋白并且基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的疫苗，所述蛋白衍生自用細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖的病毒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】經(jīng)由（3-丙內(nèi)酯處理的殘留細(xì)胞DNA水平降低的細(xì)胞衍生 病毒疫苗
[0001] 本申請(qǐng)是2006. 11.01提交的CN 200680046034. 8,題為"經(jīng)由0-丙內(nèi)酯處理的 殘留細(xì)胞DNA水平降低的細(xì)胞衍生病毒疫苗"的分案申請(qǐng)。
[0002] 本文引用的所有文件和在線信息通過(guò)引用方式全文納入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明提供雜質(zhì)減少的改良細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種改 良方法以使會(huì)與細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的產(chǎn)物維持結(jié)合的任何殘留功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解。按 照本發(fā)明，用DNA烷基化劑，例如0 -丙內(nèi)酯（BPL)處理以使殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降 解?？刹捎迷摲椒ㄌ幚戆ㄒ呙绾椭亟M蛋白在內(nèi)的各種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。

【背景技術(shù)】
[0004] 商業(yè)生產(chǎn)病毒疫苗通常需要大量病毒作為抗原來(lái)源。可以在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng) 和復(fù)制種子病毒（seed virus)以獲得疫苗生產(chǎn)所用的商業(yè)數(shù)量的病毒。適用于病毒復(fù)制 的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞，但對(duì)于病毒疫苗特別優(yōu)選哺乳 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，從而確保病毒抗原蛋白質(zhì)能正確糖基化和折疊。出于相似的原因，重組 蛋白質(zhì)表達(dá)也同樣優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0005] 如果未修飾細(xì)胞培養(yǎng)物的天然狀態(tài)，其復(fù)制能力有限，因而對(duì)產(chǎn)生商業(yè)疫苗或重 組蛋白質(zhì)所需數(shù)量的材料而言行不通且無(wú)效。因此，出于生產(chǎn)目的，優(yōu)選將細(xì)胞修飾成"連 續(xù)"或"無(wú)限增殖"的細(xì)胞系，從而增加它們能分裂的次數(shù)。許多這種修飾所用的機(jī)制類(lèi)似 于致癌細(xì)胞所涉及的那些機(jī)制。因此，關(guān)注的是應(yīng)該除去在這些系統(tǒng)中產(chǎn)生的疫苗或重組 蛋白產(chǎn)物的最終制劑中細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的任何殘留物質(zhì)，例如宿主細(xì)胞DNA。
[0006] 除去殘留宿主細(xì)胞DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是采用DNA酶處理。歐洲專(zhuān)利0870508和 美國(guó)專(zhuān)利5948410披露了這種類(lèi)型的常規(guī)方法，其涉及兩步處理，首先用DNA酶（例如， Benzonase)，然后用陽(yáng)離子洗絳劑（例如，CTAB)。
[0007] 目前降低該風(fēng)險(xiǎn)的努力集中在減少殘留宿主細(xì)胞DNA的總濃度。本發(fā)明的目的是 通過(guò)消除任何殘留宿主細(xì)胞DNA的功能而進(jìn)一步降低風(fēng)險(xiǎn)。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供雜質(zhì)減少的改良細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種改 良方法以使能與細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的產(chǎn)物維持結(jié)合的任何殘留功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解。按 照本發(fā)明，用DNA烷基化劑，例如0 -丙內(nèi)酯（BPL)處理以使殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降 解?？刹捎迷摲椒ㄌ幚戆ㄒ呙绾椭亟M蛋白在內(nèi)的各種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明包括一種疫苗，其包含衍生自用細(xì)胞培養(yǎng)物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA。此外，本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中表 達(dá)的重組蛋白，最終重組蛋白制劑基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA。
[0011] 可用烷基化劑處理來(lái)消除任何殘留宿主細(xì)胞DNA的功能，所述烷基化劑能將要轉(zhuǎn) 移入人受者染色體中，或者為受者DNA復(fù)制機(jī)制所識(shí)別的DNA切割成足夠小的部分，因而其 不能編碼功能蛋白。降解的殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng)度優(yōu)選短于500個(gè)堿基對(duì)。降解的殘 留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng)度更優(yōu)選短于200個(gè)堿基對(duì)。
[0012] 發(fā)明詳述
[0013] 本發(fā)明提供雜質(zhì)減少的改良細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種改 良方法以使與細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的產(chǎn)物維持結(jié)合的任何殘留功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解。按照 本發(fā)明，用DNA烷基化劑，例如0-丙內(nèi)酯（BPL)處理以使殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解。 可采用該方法處理包括疫苗和重組蛋白在內(nèi)的各種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物。
[0014] 本發(fā)明包括一種疫苗，其包含衍生自用細(xì)胞培養(yǎng)物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA。此外，本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中表 達(dá)的重組蛋白，最終重組蛋白制劑基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA。
[0015] 可用烷基化劑處理來(lái)消除任何殘留宿主細(xì)胞DNA的功能，所述烷基化劑能將要轉(zhuǎn) 移入人受者染色體中，或者為受者DNA復(fù)制機(jī)制所識(shí)別的DNA切割成足夠小的部分，因而其 不能編碼功能蛋白。降解的（無(wú)功能的）殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng)度優(yōu)選短于1000個(gè)堿 基對(duì)（例如，短于 1000、800、700、600、500、400、300、200、150、100、75 或 50 個(gè)堿基對(duì)）。降 解的殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng)度優(yōu)選短于500個(gè)堿基對(duì)。降解的殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng) 度更優(yōu)選短于200個(gè)堿基對(duì)。
[0016] 本文所用的"功能DNA"或"功能RNA"表示能翻譯成功能蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng) 物染色體中的核苷酸序列。通常，能翻譯成功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列需要啟動(dòng)子區(qū)域、起始 密碼子、終止密碼子和功能蛋白質(zhì)的內(nèi)部編碼序列。如果DNA發(fā)生損傷，例如加入烷基化劑 所致，許多這些區(qū)域發(fā)生改變或遭破壞，從而不再進(jìn)行翻譯或只進(jìn)行到形成所需蛋白的寡 肽亞基。
[0017]"降解的殘留功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA"指不能翻譯成功能蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物染 色體的功能DNA。"降解的殘留功能DNA"的長(zhǎng)度優(yōu)選短于1000個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選短于500 個(gè)堿基對(duì)，甚至更優(yōu)選短于200個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選短于100個(gè)堿基對(duì)?？赏ㄟ^(guò)包括凝膠電泳 在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定降解的殘留功能DNA的長(zhǎng)度。
[0018] 本發(fā)明提供基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的疫苗組合物和重組蛋白制 劑。本文所用的"基本上不含殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA"指某種組合物或制劑，其中每 0. 5ml檢測(cè)到短于200個(gè)堿基對(duì)的殘留DNA片段少于10ng?？赏ㄟ^(guò)包括毛細(xì)管電泳與核酸 擴(kuò)增技術(shù)在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)任何殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的大小。
[0019] 本發(fā)明使用烷基化劑，例如BLP提供了減少凝聚作用和污染物的額外益處。凝聚 物減少的疫苗制劑的免疫原性也增強(qiáng)。疫苗的免疫原性依賴(lài)于針對(duì)特定病毒表位的特異 性。如果蛋白質(zhì)的表面與有害的分子結(jié)合或?yàn)橹谏w或因凝聚作用而掩藏在大分子中，則 表位可能不易識(shí)別，因而在疫苗中的效率較低。此外，凝聚物減少的疫苗制劑可具有其它加 工益處。純化過(guò)程依賴(lài)于分離所需蛋白質(zhì)，例如流感疫苗中的血凝素和神經(jīng)氨酸酶。如果 蛋白質(zhì)因存在凝聚物或交聯(lián)作用而在結(jié)構(gòu)上得到修飾，它可能不能被識(shí)別，因此不能用柱 層析、過(guò)濾或離心除去。
[0020] 烷基化劑
[0021] 本發(fā)明所用的烷基化劑包括將烷基引入化合物的物質(zhì)。烷基化劑優(yōu)選單烷基化劑 (monoalkylating agent)，例如BPL。BPL是在許多疫苗的制備中廣泛用于滅活病毒的單燒 基化劑。BPL與包括核酸在內(nèi)的各種生物分子反應(yīng)，其中BPL通過(guò)烷化和脫嘌呤作用來(lái)修飾 結(jié)構(gòu)。BPL通常如以下結(jié)構(gòu)所示：
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種流感疫苗，其包含衍生自用細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗中殘留的細(xì)胞培養(yǎng)物DNA總量低于20ng/ml，降解的殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的長(zhǎng)度短 于200個(gè)堿基對(duì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，用烷基化劑處理使任何殘留的細(xì)胞培養(yǎng)物 DNA降解。
3. 如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述烷基化劑對(duì)疫苗中的病毒滅活。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，所述烷基化劑是0 -丙內(nèi)酯（BPL)。
5. 如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述0-丙內(nèi)酯（BPL)低于0.1%。
6. 如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有游離丙酸和BPL低于0. 01 %。
7. 如前任一權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)物選自下組:MDCK細(xì)胞、 Vero細(xì)胞和PER. C. 6細(xì)胞。
8. 如前任一所述的疫苗，其特征在于，還包含水包油乳液佐劑。
9. 如權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述乳液中油滴的直徑是亞微米的。
10. 如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述水包油乳液佐劑包含角鯊烯、吐溫80 和司盤(pán)85。
11. 如權(quán)利要求8或9所述的疫苗，其特征在于，所述水包油乳液佐劑包含角鯊烯、生育 酚和吐溫80。
12. 如前任一權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含裂解病毒顆?；蚣兓?病毒蛋白形式。
13. 如前任一權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，任何殘留細(xì)胞培養(yǎng)物DNA的大小通過(guò) 毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
14. 如前任一權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是三價(jià)疫苗。
15. 如權(quán)利要求1-13任一所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含來(lái)自一種流感病毒 株的抗原。
16. 如前任一權(quán)利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有少于5 y g/ml汞物質(zhì)。
17. -種流感疫苗，其包含衍生自用細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗用包含以下步驟的方法制備： (i) 用0 -丙內(nèi)酯純化病毒顆粒，使殘留的功能細(xì)胞培養(yǎng)物DNA降解，以滅活病毒； (ii) 利用破裂濃度的溴化十六烷基三甲銨使完整病毒破裂或破碎；和 (iii) 分離該免疫原性蛋白。
【文檔編號(hào)】A61K39/145GK104474543SQ201410631136
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2006年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月1日
【發(fā)明者】J·-P·格雷格森, H·科斯特 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限兩合公司