專利名稱：在宿主中植入經(jīng)包被細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備經(jīng)包被細(xì)胞以植入宿主中的方法，此方法包括在體內(nèi)或體外將細(xì)胞暴露于一種或多種與所需植入位點(diǎn)處的條件更密切吻合的限制性條件下，暴露的時(shí)間應(yīng)足以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性。
當(dāng)植入宿主即可產(chǎn)生生物活性分子的經(jīng)包被細(xì)胞可用來(lái)預(yù)防或治療宿主的許多疾病或障礙，或者可提供、恢復(fù)或增強(qiáng)宿主的一種或多種代謝功能。
包被細(xì)胞的一種方法被稱作“微包被”，其中微球體包裹了含細(xì)胞溶液的微滴(Sefton等人，《生物技術(shù)與生物工程》29，第1135-1143頁(yè)(1987)；Sugamori等人，《泛美人工內(nèi)臟學(xué)會(huì)》35，第791-799頁(yè)(1989))。
包被細(xì)胞的另一種方法“大量包被法”包括將大量細(xì)胞包被在熱塑膠囊中。典型地，此方法是通過(guò)將細(xì)胞裝進(jìn)中空的纖維中，再封閉末端來(lái)實(shí)現(xiàn)的。多種類型的大膠囊是本技術(shù)中已知的。具體地說(shuō)，Dionne等人(WO 92/19195，此處引入作為參考)提到一種大膠囊，其具有的細(xì)胞分散在基質(zhì)和半滲透的表面套中。另外，Aebischer在美國(guó)專利5,158,881，5,283,187和5,284,761也提到通過(guò)將聚合物溶液和細(xì)胞懸液共同擠壓而形成的細(xì)胞膠囊。
典型地，當(dāng)用于包被和植入的細(xì)胞直接分離自組織(原代細(xì)胞)時(shí)，應(yīng)將它們分散、洗滌，然后進(jìn)行包被。例見(jiàn)Aebischer等人，《泛美人工臟器學(xué)會(huì)》32卷，第134-7頁(yè)(1986)；Altman等人，《糖尿病》35卷，625-633頁(yè)(1986)；Chang等人，美國(guó)專利5,084,350；Darquay和Reach，《糖尿病》28期，776-780頁(yè)(1985)；Sugamori和Sefton，《泛美人工臟器學(xué)會(huì)》35卷，791-799頁(yè)(1989)。
當(dāng)被包被和植入的是無(wú)限增殖化細(xì)胞或細(xì)胞系時(shí)，典型地，它們分離自富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)物。例見(jiàn)Aebischer等人，《生物材料》12卷，第50-55頁(yè)(1981)；《實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)》111卷，269-275頁(yè)(1981)(分泌多巴胺的PC12細(xì)胞)，及Ward等人WO 93/22427(分泌IgG的MOPC-31C細(xì)胞)。
經(jīng)包被的細(xì)胞通常在體外溫育，植入前再進(jìn)行功能鑒定。通常在此植入前階段，可在確定成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)包被的細(xì)胞。所述培養(yǎng)基通常是缺乏營(yíng)養(yǎng)添加劑的平衡鹽溶液(例Aebischer.文獻(xiàn)同上；Altman.文獻(xiàn)同上；Chang et al.、文獻(xiàn)同上)。另外，也可在如RPMI1640的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中溫育經(jīng)包被細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖(2g/l；11.11mM)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》，Pollard和Walker編輯，Humana出版公司，克利夫頓，新澤西，696-700頁(yè)(1990))，典型地，此培養(yǎng)基中添加有5％-15％胎?；蝰R血清。
與體外條件相比，需經(jīng)包被并植入宿主的細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)條件必須遭受至少兩次劇烈的變化。第一次變化在包被時(shí)發(fā)生。
與體外條件相比，包被環(huán)境中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)已耗盡。這種耗盡可以兩種方式顯現(xiàn)。在外部環(huán)境和膠囊內(nèi)部之間有一個(gè)營(yíng)養(yǎng)物梯度，此梯度橫跨膜自然形成。應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)此梯度，因?yàn)榉肿硬荒茉谕獠克拗鹘M織和膠囊內(nèi)部每一位置處的細(xì)胞之間自由擴(kuò)散。較靠近膠囊表面的細(xì)胞具有優(yōu)先的通路，可讓營(yíng)養(yǎng)成份穿過(guò)膠囊套擴(kuò)散進(jìn)來(lái)。另外，較靠近膠囊表面之細(xì)胞的廢產(chǎn)物更容易被排出。
如氧和葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)物濃度的第二次劇烈變化在植入宿主之時(shí)發(fā)生。這是因?yàn)轶w外的氧和至少一些其他營(yíng)養(yǎng)物水平通常比體內(nèi)出現(xiàn)的更高，因此體內(nèi)將這些分子擴(kuò)散至膠囊內(nèi)的驅(qū)動(dòng)力有所降低。
營(yíng)養(yǎng)物環(huán)境的這些變化可導(dǎo)致一種或多種細(xì)胞特性的變化。例如，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡或長(zhǎng)期細(xì)胞存活力的下降。另外，植入時(shí)環(huán)境條件的改變也會(huì)影響保持存活之包被細(xì)胞的其他特性，如細(xì)胞生長(zhǎng)速率或細(xì)胞產(chǎn)生生物活性分子的能力。不連續(xù)細(xì)胞亞群生長(zhǎng)速率的改變會(huì)導(dǎo)致膠囊被生長(zhǎng)較快的細(xì)胞亞群接收，從而有可能導(dǎo)致膠囊產(chǎn)品特征的明顯改變，或產(chǎn)生其他潛在的不必要的影響。
體內(nèi)植入條件和體外條件之間的一個(gè)重要差別是培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞所能適應(yīng)的葡萄糖濃度。組織培養(yǎng)條件和植入位點(diǎn)處的條件之間的另一個(gè)差別是細(xì)胞可利用的氧的量。培養(yǎng)物培養(yǎng)基中和給定植入位點(diǎn)處的其他營(yíng)養(yǎng)物濃度也顯著不同。
代謝活性高的細(xì)胞或組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)物和氧喪失(氧過(guò)少)的影響格外敏感。類似地，許多在正常情況下靠稠密的毛細(xì)層維持，因而可適應(yīng)在體內(nèi)高氧和營(yíng)養(yǎng)物水平下生長(zhǎng)的內(nèi)分泌組織即表現(xiàn)出此行為；朗氏和腎上腺嗜鉻細(xì)胞的胰島對(duì)氧過(guò)少休克特別敏感。
已知氧壓力和營(yíng)養(yǎng)物壓力的改變可改變影響多種細(xì)胞功能的大量基因的表達(dá)。這種改變可影響某些mRNA的穩(wěn)定性和功能。例如，營(yíng)養(yǎng)物壓力可影響酪氨酸羥化酶mRNA，該mRNA可編碼一種酶，此酶可催化多巴胺生產(chǎn)過(guò)程中的限速步驟。
此外，低葡萄糖或氨基酸水平也可影響多種熱激基因，以及如中間代射(如糖酵解和糖異生途徑)所涉及的那些代謝酶的表達(dá)。
重要的是，喪失氧的高度分化的細(xì)胞類型可失去它們的組織特異性功能直至它們從氧過(guò)少休克中恢復(fù)[例見(jiàn)Wolffe和Tata，《FEBS通訊》，176，第8-15頁(yè)(1984)]。喪失或降低的功能包括蛋白質(zhì)的合成和修飾。這可能會(huì)影響到細(xì)胞想提供給周圍宿主組織的真正的治療因子的產(chǎn)生和分泌。另外，在一些情況下，氧過(guò)少的條件可起動(dòng)惡性轉(zhuǎn)化(例見(jiàn)H.Goldblatt等人，《生化醫(yī)藥》，7，第241-252頁(yè)(1973))。
需要研究出一種植入方法，此方法包括在植入前將細(xì)胞暴露或適應(yīng)于一種或多種限制性條件以減少因植入時(shí)環(huán)境條件改變的影響而導(dǎo)致的細(xì)胞特性的變化，從而減少對(duì)宿主的任何不良后果。也需要開(kāi)發(fā)出如此制備出的細(xì)胞的細(xì)胞系。也需要提供體外研究遭受體內(nèi)環(huán)境變化的細(xì)胞的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及將經(jīng)包被細(xì)胞植入宿主的方法，此方法包括在將細(xì)胞植入宿主內(nèi)植入位點(diǎn)之前，在體外或體內(nèi)使細(xì)胞暴露于一種或多種限制性條件達(dá)足夠一段時(shí)間以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性。優(yōu)選地，由本發(fā)明方法建立的細(xì)胞特性植入后實(shí)際上也可保持。經(jīng)包被的細(xì)胞可產(chǎn)生生物活性分子，所述分子對(duì)于預(yù)防或治療宿主的疾病或障礙，或提供、恢復(fù)或增強(qiáng)宿主的代謝功能是有用的。根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的細(xì)胞在體外也可用于診斷或其他目的。
圖的簡(jiǎn)述

圖1表示經(jīng)包被的BHK細(xì)胞的NGF分泌狀況，所述細(xì)胞是在體外，于50mmHg，含0.8g/l葡萄糖(低O2/gl)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。BHK細(xì)胞被包裹在沖頭封閉的4型雙層膠囊內(nèi)。在第3、7、14、21和23天，測(cè)定每個(gè)膠囊每24小時(shí)所分泌的NGF，結(jié)果由線條的高度表示。
圖2表示經(jīng)包被的BHK細(xì)胞，所述細(xì)胞是在體外，于142mmHg、含5.5g/l葡萄糖(高O2/gl)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。BHK細(xì)胞被包裹在沖頭封閉的4型(T4)膠囊中，在第3、7、14、21和28天測(cè)量每個(gè)膠囊每24小時(shí)所分泌的NGF，結(jié)果由線條的高度表示。
圖3表示經(jīng)包被的BHK細(xì)胞分泌NGF的情況，所述細(xì)胞在體外于低O2/gl培養(yǎng)基(同圖1)中培養(yǎng)，在沖頭封閉的4型(T4)膠囊中維持一段時(shí)間，所述膠囊是由(a)10％PAN/PVC、(6)12.5％PAN/PVC，或(c)15％PAN/PVC制成的。在第3、7、14、21和28天測(cè)量每個(gè)膠囊每24小時(shí)分泌NGF的情況，結(jié)果由線條的高度表示。
圖4表示經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞在體外于20、40、60、80或140mmHg O2下培養(yǎng)14天，作為氧壓的函數(shù)的釋放的去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(EPI)。在第2天和第14天測(cè)量釋放。A組表示基本的NE釋放；B組表示K+引起的NE釋放；C組表示基本的EPI釋放；D組表示K+引起的EPI釋放。
圖5表示植入前及6周植入期之后的回收后，被2型膠囊包裹的小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞所釋放的兒茶酚胺。A組表示植入期之前和之后基本的NE和EPI釋放。B組表示植入期之前和之后由煙堿刺激的NE和EPI的釋放。C組表示植入期之前和之后由K+引發(fā)的NE和EPI的釋放。
圖6表示植入前及6周植入期之后的回收后，被4型膠囊包裹的小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞所釋放的兒茶酚胺。A組表示植入期之前和之后基本的NE和EPI釋放。B組表示植入期之前和之后由煙堿刺激的NE和EPI的釋放。C組表示植入期之前和之后由K+引發(fā)的NE和EPI的釋放。
圖7表示植入前及6個(gè)月植入期之后的回收后，經(jīng)包被的小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞在大鼠的背柱蛛網(wǎng)膜下隙釋放的基本(A)的和經(jīng)煙堿刺激(B)的兒茶酚胺。
圖8表示植入前及3個(gè)月植入期之后的回收后，經(jīng)包被的PC12和PC12A細(xì)胞在大鼠紋狀體所釋放的多巴胺和L-多巴。A組和B組分別表示植入前PC12和PC12A細(xì)胞的基本釋放。C組和D組分別表示外植后PC12和PC12A細(xì)胞的基本釋放。
圖9比較了體內(nèi)適應(yīng)正常的或降低的多巴胺水平的細(xì)胞所釋放的兒茶酚胺，降低的多巴胺水平是由大鼠黑質(zhì)內(nèi)的6-羥基-多巴胺(6-OHDA)損傷引起的。A組表示PC12細(xì)胞作為體內(nèi)適應(yīng)時(shí)間的函數(shù)的在黑質(zhì)的損傷(劃斜線的帶)或未損傷(空白帶)區(qū)域所釋放L-多巴的基本速率。B組表示作為體內(nèi)適應(yīng)時(shí)間的函數(shù)的在大鼠黑質(zhì)的損傷(劃斜線的帶)或未損傷(空白帶)區(qū)域所釋放的基本的L-多巴與多巴胺的比率。
圖10表示經(jīng)包被的PC12細(xì)胞作為體內(nèi)適應(yīng)時(shí)間(以月計(jì))的函數(shù)的在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦內(nèi)釋放的兒茶酚胺量?？招姆綁K表示基本的L-多巴，而空心圓表示基本的多巴胺水平。
圖11表示植入前和植入14個(gè)月以后BHK-hNGF克隆23細(xì)胞釋放NGF的速率，所述細(xì)胞包裹在含Vitrogen基質(zhì)或不含基質(zhì)的HF 120794-6單層纖維中。細(xì)胞庫(kù)(CB)細(xì)胞是未適應(yīng)的BHK-hNGF克隆23細(xì)胞。
發(fā)明的詳細(xì)描述“細(xì)胞特性”包括可被測(cè)量的任何表型特性，包括細(xì)胞存活力、生長(zhǎng)速率、細(xì)胞生產(chǎn)的生物活性分子。所需細(xì)胞特性指的是對(duì)限制性條件反應(yīng)的一種或多種生物活性分子生產(chǎn)水平的變化、或者兩種生物活性分子產(chǎn)量比率的變化。另外，所需細(xì)胞特性也可指對(duì)限制性條件反應(yīng)的生物活性分子產(chǎn)量的穩(wěn)定作用。
術(shù)語(yǔ)“限制性條件”是指體外正?；蜃钸m于培養(yǎng)細(xì)胞的一種或多種條件已被改變成與體內(nèi)所需宿主植入位點(diǎn)處的實(shí)際或預(yù)期條件更密切吻合的條件。
“生物活性分子”可以(a)在制備它的細(xì)胞中起作用(如bcl-2以預(yù)防細(xì)胞程序死亡)，(b)可在細(xì)胞表面表達(dá)并影響細(xì)胞與其他細(xì)胞或生物活性分子(如神經(jīng)遞值受體或細(xì)胞粘附分子)、或(c)從制備它的細(xì)胞中釋放或分泌并將它的影響施加給分離的靶細(xì)胞(如神經(jīng)遞質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、或其他細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)傳遞介質(zhì))。生物活性分子可用于治療或預(yù)防宿主的疾病或障礙，或者可以提供、恢復(fù)或增強(qiáng)宿主的一種或多種代謝功能。
術(shù)語(yǔ)“宿主”或“受體”是指包括哺乳動(dòng)物，尤其是人類受試者的適當(dāng)動(dòng)物受試者。術(shù)語(yǔ)“受體”指一種動(dòng)物，細(xì)胞在其中暴露于一種或多種限制性條件以致細(xì)胞表現(xiàn)出所需的細(xì)胞特性。術(shù)語(yǔ)“宿主”指其中植入了表現(xiàn)出所需細(xì)胞特性的經(jīng)包被細(xì)胞的動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”指任何形式的細(xì)胞，包括但不局限于組織、細(xì)胞簇中保留的細(xì)胞，以及單個(gè)分離的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生生物活性分子。細(xì)胞可以是自然產(chǎn)生生物活性分子的原代細(xì)胞或分離細(xì)胞，或者是已被基因工程操作從而能產(chǎn)生生物活性分子的細(xì)胞。
“生物可容性膠囊”是指膠囊植入宿主哺乳動(dòng)物時(shí)，所產(chǎn)生的宿主反應(yīng)不足以有害影響膠囊的功能或使它變得不可操作。例如，通過(guò)在膠囊周圍形成纖維變性結(jié)構(gòu)從而限制營(yíng)養(yǎng)物擴(kuò)散到其中的細(xì)胞即會(huì)出現(xiàn)這種不可操作性。有害的影響還包括膠囊的排斥或者膠囊向周圍的宿主組織釋放有毒或熱性的化合物(例如合成的聚合物副產(chǎn)品)。
“免疫分離的膠囊”是指膠囊植入宿主哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，可使宿主免疫系統(tǒng)對(duì)其內(nèi)部核心的細(xì)胞的有害影響減至最小，從而使膠囊在體內(nèi)的作用維持更長(zhǎng)一段時(shí)間。
術(shù)語(yǔ)“水凝膠”是指交聯(lián)親水聚合物的三維網(wǎng)狀物。網(wǎng)狀物是基本上由水組成的凝膠形式，優(yōu)選但不限于含90％水以上的凝膠。交聯(lián)水凝膠也可被當(dāng)作固體，因?yàn)闆](méi)有可感覺(jué)到的使用了切應(yīng)力，它們就不會(huì)流動(dòng)或變形。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在植入宿主內(nèi)的植入位點(diǎn)之前，在體外被包裹在生物可容性膠囊中并暴露于一種或多種限制性條件下。細(xì)胞應(yīng)在限制性條件下暴露足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性。優(yōu)選此細(xì)胞特性在經(jīng)包被的細(xì)胞植入宿主內(nèi)的植入位點(diǎn)之后基本上可以保持。
舉例說(shuō)明的限制性條件包括下列一種或多種的變化溫度、pH或大氣壓，或一種或多種代謝物或輔因子的有效濃度變化，它們包括但不限于糖、醇、羧酸、氨基酸、脂肪酸、核酸、氣體、金屬離子或任何其他對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、功能或存活力有貢獻(xiàn)的生物因子，上述改變的結(jié)果與所需植入位點(diǎn)的體內(nèi)條件更密切吻合。另外，限制性條件也可改變一種或多種生物活性分子的有效濃度，這些分子包括但不限于激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子或其他參與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)傳遞的生物活性分子。
應(yīng)理解體內(nèi)一些營(yíng)養(yǎng)物和生物活性因子的濃度要比正常情況下體外所遇到的濃度低。作為另一種選擇，體內(nèi)一些營(yíng)養(yǎng)物和生物活性因子的濃度也可比正常情況下體外所遇到的濃度高。
另外，本發(fā)明舉例說(shuō)明的限制性條件包括在體內(nèi)或體外將經(jīng)包被的細(xì)胞暴露于選定植入位點(diǎn)處的靶細(xì)胞以在經(jīng)包被的細(xì)胞中產(chǎn)生所需的細(xì)胞特性。例見(jiàn)Wainer和Heller，“神經(jīng)元雜交細(xì)胞系產(chǎn)生，鑒定和利用”，《神經(jīng)元細(xì)胞系》，J.Wood編輯，IRL出版，第20頁(yè)(1992)。
本發(fā)明的方法可使用任何適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可修改確定成分的基本組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基以得到符合所需植入位點(diǎn)特性的關(guān)鍵性氣體營(yíng)養(yǎng)物的所需濃度或其他限制性條件。
當(dāng)細(xì)胞暴露于體外的限制性條件時(shí)，培養(yǎng)條件可緩慢而連續(xù)地改變，或者可以經(jīng)過(guò)一步或多步的變化來(lái)得到所需的限制性條件。
在較優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞植入受體內(nèi)的選定植入位點(diǎn)，而使細(xì)胞在體內(nèi)暴露于一種或多種限制性條件。選定植入位點(diǎn)附近的分子環(huán)境會(huì)影響植入此位點(diǎn)并適應(yīng)此位點(diǎn)的細(xì)胞的特性。例如，一種或多種生物活性因子(如激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)或細(xì)胞因子)的濃度會(huì)影響植入細(xì)胞生長(zhǎng)的能力、通過(guò)改變基因表達(dá)輪廓以在植入位點(diǎn)存活的適應(yīng)能力、或產(chǎn)生所需的治療因子的能力。一旦細(xì)胞已在體內(nèi)暴露于限制性條件達(dá)足夠一段時(shí)間從而表現(xiàn)出所需的細(xì)胞特性，即可回收細(xì)胞并植入宿主中。
我們優(yōu)選體內(nèi)暴露于限制性條件是因?yàn)榧?xì)胞表現(xiàn)出的所需靶細(xì)胞特性是通過(guò)調(diào)整與限制性條件一致的所有細(xì)胞表型特性來(lái)建立的。相反，體內(nèi)適應(yīng)或暴露于限制性條件會(huì)導(dǎo)致某些所需細(xì)胞特性的建立。然而，當(dāng)這些細(xì)胞被植入宿主時(shí)，其他細(xì)胞特性會(huì)有所變化并影響到所需的已建立的靶細(xì)胞特性。
優(yōu)選地，受體和宿主都是靈長(zhǎng)類，最優(yōu)選宿主為人類。優(yōu)選宿主內(nèi)的植入位點(diǎn)與受體中的一致。
根據(jù)此實(shí)施方案體內(nèi)制備的細(xì)胞也可保持在一種或多種限制性條件下，并在體外用作診斷或其他目的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在包被前在體外被暴露于多種限制性條件。優(yōu)選地，再包被細(xì)胞并在植入宿主前暴露于另外的限制性條件下。在包被前暴露于一種或多種限制性條件可使人從最初的種群中選擇存活的細(xì)胞并僅包被那些細(xì)胞。如果所用細(xì)胞是有絲分裂后的細(xì)胞或其他未分離的細(xì)胞，即可根據(jù)它們明顯的生長(zhǎng)狀況，和表型從最初的種群中選擇細(xì)胞，表型最好通過(guò)所需生物活性分子的產(chǎn)生來(lái)測(cè)量。如果所用細(xì)胞是活性分離細(xì)胞，存活細(xì)胞典型地會(huì)長(zhǎng)出最初種群的范圍。
足以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性的時(shí)間根據(jù)所用細(xì)胞以及限制性條件而有所變化。典型地，當(dāng)細(xì)胞最初暴露于限制性條件時(shí)，需經(jīng)受一個(gè)過(guò)渡期，在此期間細(xì)胞表型持續(xù)改變直至建立了對(duì)限制性條件反應(yīng)的細(xì)胞特性。通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)可確定過(guò)渡所需的時(shí)間。
在較優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)基因工程操作可分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK細(xì)胞)被懸浮在膠原/Vitrogen基質(zhì)中并被包裹在兩端封閉的中空半透纖維中。如已引入本文作為參考的PCT/US 94/09299中描述了這種BHK-hNGF細(xì)胞的制備。在體外使膠囊適應(yīng)低氧和低葡萄糖條件，將膠囊釋放的NGF量測(cè)定為體外適應(yīng)時(shí)間的函數(shù)。每個(gè)膠囊的NGF產(chǎn)率隨體外適應(yīng)時(shí)間的增加而增加(圖1)。
在另一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)包被的BHK-hNGF細(xì)胞被植入宿主的旁心室并在體內(nèi)適應(yīng)。外植膠囊，移出適應(yīng)的細(xì)胞并通過(guò)重復(fù)傳代培養(yǎng)，然后重新包裹以在體內(nèi)將適應(yīng)細(xì)胞植入受體。在重新植入前和重新植入受體后的不同時(shí)間檢測(cè)含未適應(yīng)細(xì)胞或體內(nèi)適應(yīng)細(xì)胞之膠囊的NGF釋放情況(圖11)。
在另一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，將包裹在單層半透膜內(nèi)的PC12細(xì)胞體內(nèi)暴露于靈長(zhǎng)類腦中的限制性條件達(dá)6個(gè)月。6個(gè)月的植入期之后，細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性，即細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生有所變化，這是通過(guò)L-多巴與多巴胺的基本釋放量比值測(cè)出的，細(xì)胞還表現(xiàn)出與植入前的水平相比，其他兒茶酚胺相對(duì)釋放量的變化(圖7)。
在另一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，PC12細(xì)胞被包裹，并在體內(nèi)適應(yīng)黑質(zhì)腦區(qū)域，該區(qū)域具有正常的多巴胺水平，或具有通過(guò)預(yù)先施用6-羥基多巴胺(6-OHDA)而單向誘導(dǎo)的降低的多巴胺水平。體內(nèi)適應(yīng)28或60天的PC12細(xì)胞比適應(yīng)較短時(shí)間的PC12細(xì)胞產(chǎn)生的L-多巴水平要高一些。在正常多巴胺水平的存在下體內(nèi)適應(yīng)的細(xì)胞重新植入受體時(shí)比在多巴胺水平降低的6-OHDA損傷的黑質(zhì)中適應(yīng)的細(xì)胞所產(chǎn)生L-多巴與多巴胺的比率更高(圖9)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包裹在雙層半透膜中的腎上腺嗜鉻細(xì)胞在人體內(nèi)蛛網(wǎng)膜下隙的限制性條件中暴露了55和84天。植入期之后，細(xì)胞表現(xiàn)出改變的神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生。
舉例說(shuō)明了大量不同的植入位點(diǎn)。這些植入位點(diǎn)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它包括腦和眼的水樣和玻璃狀液。優(yōu)選的腦位點(diǎn)包括紋狀體、大腦皮層、丘腦下核和邁內(nèi)特氏核上顎基片。其他優(yōu)選的位點(diǎn)是腦脊髓液，最優(yōu)選蛛網(wǎng)膜下隙和旁室。本發(fā)明還舉例說(shuō)明了植入腎囊下位點(diǎn)，和腹膜內(nèi)、皮下位點(diǎn)、或任何其他對(duì)治療有利的位點(diǎn)。
在某些情況下，體內(nèi)適應(yīng)之前或同時(shí)修飾植入位點(diǎn)以產(chǎn)生最適環(huán)境是有用的。例如，已知的帕金森氏病的模型包括對(duì)腦黑質(zhì)施用6-羥基多巴胺。此毒素是為產(chǎn)多巴胺的神經(jīng)之選擇的?？蓪⒓?xì)胞植入此損傷區(qū)域并使細(xì)胞適應(yīng)此區(qū)域。植入此損傷腦部可分泌兒茶酚胺的PC12細(xì)胞在體內(nèi)約1個(gè)月后所釋放的兒茶酚胺量表現(xiàn)出全面的增長(zhǎng)。另外，在體內(nèi)約14天后，兒茶酚胺種類的比率隨著基本的L-多巴與多巴胺比率的降低而變化。
植入位點(diǎn)之間和不同種之間的局部環(huán)境是不同的?？赡芟嗤N的個(gè)體之間任何給定植入位點(diǎn)的局部環(huán)境都有所不同。通常，無(wú)需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)即可從公開(kāi)的文獻(xiàn)中估計(jì)出或由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定出給定植入位點(diǎn)的代謝物和氣體濃度。
例如，對(duì)人而言，已知人體典型的局部氧壓在動(dòng)脈血的約90mmHg到工作的肌肉組織的低于1mmHg之間變化。其他典型的氧壓是靜脈血(40mmHg)、腹膜腔(47mmHg)、和腦脊髓液(59mmHg)。
同樣，典型的葡萄糖值在供血組織的80-120mg/分升(4.4-6.7mM)和腦脊髓液(CSF)的40-70mg/分升(2.2-3.9mM)之間變化〔《蓋吉科技表》第1卷，“測(cè)定單位、體液、機(jī)體組合物、營(yíng)養(yǎng)”，第8版，希巴—蓋吉，1984〕。在引入本文作為參考的《蓋吉科技表》中也可發(fā)現(xiàn)這些和其他此例。表I比較了血清和CSF中存在的多種化合物的濃度。
表1化合物腦脊髓液 血液(血清)氧59 mmHg 40 mmHg葡萄糖100±20 mg/dI 55±15 mg/dL半乳糖166±99 μm17±μm甘油 13.5±2.5μm120±65 μm乳酸 1.6±0.2 mM0.76±0.34mM丙酮酸115±17 μm32±19 μm磷脂 5.21±0.9 μm 2.9±1.2 μm脂肪 3.5 μm 500 μmcAMP 21±8nM 11±2.4 nMcGMP 2.4±0.5 nM 9.5±2.1 nM氧化物125±3 mM 102.5±4.5mM磷0.52±0.07 mM 1.05±0.31mM鈉145±3.9 mM 140±2.38 mM鈣1.19±0.08 mM 2.44±0.1 mM鎂0.89±0.17 mM 0.78±0.04mM鋅0.49±0.12 μM 16.7±3.1μM鐵0.8±0.4μM 17.2±0.75 μM銅0.25±0.06 μM 16.25±0.75 μM錳21±6nM 10±2.4 nM膽堿 8.3±1.7μM 15.5±2.3μM組胺 87±nM 3.4±0.7 nM去甲上腺素1.4± nM 1.65±1.0 nM腎上腺素 0.24±nM 0.13±0.1 nM血清素3.9±1.08nM 50±20nM包括葡萄糖、氨基酸、乳酸和核苷的分子跨過(guò)血腦屏障被轉(zhuǎn)運(yùn)到CSF中以供應(yīng)如室、蛛網(wǎng)膜下隙和脊髓溝的CSF-浸泡區(qū)域。典型地，CSF中半乳糖濃度比血漿中高出10倍，CSF中的丙酮酸和乳酸也比血漿中更濃。相反，血液中的大多數(shù)氨基酸比CSF中的濃5至30倍(見(jiàn)蓋吉科技表，第1卷，出處同前，第169頁(yè)。)。
如維生素C、葉酸鹽(維生素B復(fù)合物類)、脫氧核苷和比哆醇(維生素B6)的其他“微量營(yíng)養(yǎng)物”物質(zhì)跨過(guò)血腦屏障被活性轉(zhuǎn)運(yùn)到CSF。另外，CSF中的離子濃度，如鈉、鉀、鈣、鎂和氯的濃度應(yīng)被嚴(yán)格調(diào)節(jié)(Sepctor和Johanson，《科技美國(guó)人》，第68-74頁(yè)(1989年11月))。
典型地，培養(yǎng)物培養(yǎng)基中存在的代謝物應(yīng)選擇為最適于細(xì)胞在組織培養(yǎng)中的生長(zhǎng)和存活力。這些化合物的濃度與給定植入位點(diǎn)存在的濃度有偏差。通常細(xì)胞生長(zhǎng)所需的鹽和葡萄糖濃度比所需植入位點(diǎn)處的濃度要高一些。例如，RPMI 1640培養(yǎng)基含有11.1mM葡萄糖，而血清中葡萄糖水平約為4.5mM，CSF中僅為2.2-3.9mM。
類似地，RPMI 1640中的鈣水平為0.42mM，而CSF中的鈣水平為1.2mM，血清中為2.44mM(表1)。CSF中的鋅離子濃度為0.5μM，血清中為16.7μm，而RPMI 1640培養(yǎng)基中則不含鋅。
另外，大多數(shù)細(xì)胞在體外于大氣氧水平(142mmHg)或帶有環(huán)境中的潮濕空氣和5％-7％CO2的溫箱中培養(yǎng)(例Aebicher等人，生物材料文獻(xiàn)同上，Ward等人，文獻(xiàn)同上)。這比宿主體內(nèi)選定植入位點(diǎn)處存在的氧濃度顯著較高。
而且，所有組織培養(yǎng)用的培養(yǎng)基都缺乏體內(nèi)存在的短生分子。這些短生分子在體內(nèi)快速降解并被不斷合成或補(bǔ)充。一些培養(yǎng)物培養(yǎng)基添加有熱滅活的胎?；蝰R血清以取代一些物質(zhì)，但血清中的短生分子通常也很少或沒(méi)有。當(dāng)添加血清時(shí)，典型地，培養(yǎng)基總量中少于20％的量為血清時(shí)，這些分子存在的濃度最多僅為血清中濃度的1/50。另外，添加有血清的培養(yǎng)物培養(yǎng)基會(huì)含有不一致宿主中不會(huì)出現(xiàn)的分子，所述分子對(duì)經(jīng)包被的細(xì)胞具有不良影響。最終，當(dāng)大多數(shù)成分的血清濃度是它們?cè)诮M織液中濃度的反映時(shí)，血清和組織液中的特殊物質(zhì)的濃度將會(huì)顯著不同。
本發(fā)明所用細(xì)胞可以與宿主同種異體(即來(lái)自與宿主相同的種)或與宿主異種異體(即來(lái)自不同種)。我們優(yōu)選將細(xì)胞植入異種異體宿主。應(yīng)理解制備植入到異種宿主內(nèi)的細(xì)胞可能涉及到與植入同種宿主所不同的限制性條件，可能產(chǎn)生具有不同細(xì)胞將性的表型不同的細(xì)胞種群。
可從供體(即原代細(xì)胞或組織，包括成年，出生不滿一月和胎細(xì)胞或組織)制備細(xì)胞，或者也可從體外復(fù)制的細(xì)胞，如無(wú)限增殖化細(xì)胞或細(xì)胞系，包括基因修飾細(xì)胞中制備細(xì)胞。
原代細(xì)胞可來(lái)自未分離(有絲分裂后)的正常組織，如肝中的那些自然分離(有絲分裂)的細(xì)胞，或來(lái)自如脾中和骨髓中的那些多能干細(xì)胞。
本發(fā)明中所用的原代細(xì)胞包括來(lái)自哺乳動(dòng)物CNS的對(duì)生長(zhǎng)因子敏感的神經(jīng)祖干細(xì)胞〔Peynolds和Weiss，《科學(xué)》，255，1707-1710(1992)；Richards等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》89，8591-95頁(yè)(1992)；Ray等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》90，第3602-06頁(yè)(1993)〕，原代成纖維細(xì)胞、Schwann細(xì)胞、星形細(xì)胞、β-TC細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞、ATT20細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及它們的前體、成肌細(xì)胞、肌管、腎上腺髓質(zhì)組織或腎上腺嗜鉻細(xì)胞。我們優(yōu)選神經(jīng)干細(xì)胞和腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
同樣優(yōu)選的Schwann細(xì)胞可根據(jù)Bunge的方法(PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO 92/03536)制備?？蓪⒔?jīng)包被的Schwann細(xì)胞植入腦的適當(dāng)區(qū)域以防止與帕金森氏病相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體通道的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)元的變質(zhì)。通常，優(yōu)選的植入位點(diǎn)是紋狀體或其附近的位置。由于細(xì)胞不與神經(jīng)元近側(cè)接觸，而且不會(huì)出現(xiàn)髓鞘形成，因此包被細(xì)胞可增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。為了這種目的，包括星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的其他膠質(zhì)細(xì)胞類型也可被包被和植入。
分離可產(chǎn)生選定產(chǎn)物的細(xì)胞或組織的技術(shù)是已知的，或者也可由已知技術(shù)修改。例如，如Scharp等人的、US專利號(hào)4,868,121中所述，聯(lián)合使用機(jī)械膨脹和膠原酶消化即可從大型動(dòng)物的胰腺(如人或豬)中分離朗氏細(xì)胞的子集，使用Scharp等人《糖尿病》第29卷，增刊1，第19-30(1980)的方法即可從如大鼠的小型動(dòng)物中分離子集。
類似地，如Sun等人在《人工細(xì)胞，人工器官生物學(xué)》第15卷，第483-496(1987)中所述，先使用膠原酶消化，再使用組織分級(jí)沉淀即可從肝臟組織中分離肝細(xì)胞。通過(guò)已知的方法〔Livett，《生理學(xué)評(píng)論》第64期，第1103-61頁(yè)(1984)；Sagen等人的美國(guó)專利4,753,635〕可分離腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
無(wú)限增殖化細(xì)胞可來(lái)自原代細(xì)胞，或者也可從被病毒、病毒基因產(chǎn)物、癌基因或其他無(wú)限增殖化基因或基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇。適于本發(fā)明實(shí)際操作的公眾可利用的細(xì)胞系例子包括幼倉(cāng)鼠腎(BHK)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、小鼠成纖維細(xì)胞(L-M)、NIH Suiss小鼠胚(NIH/3T3)、非洲綠猴細(xì)胞系(包括COS-a、COS-7、BSC-1、BSC-40、BMT-10和Vero)，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(PC12)、PC12A、大鼠膠質(zhì)腫瘤(C6)細(xì)胞、RAJI(人淋巴瘤)細(xì)胞、MOPC-31C小鼠漿細(xì)胞、MN9D、MN9H細(xì)胞和rip Tag轉(zhuǎn)基因小鼠衍生的細(xì)胞。我們優(yōu)選BHK和PC12細(xì)胞。
細(xì)胞無(wú)限增殖化技術(shù)描述于Land等人，《自然》第304期，596-602頁(yè)(1983)和Cepko，《神經(jīng)元》第1期，345-353頁(yè)(1988)。候選細(xì)胞系包括可分泌胰島素的基因工程β-細(xì)胞系，如NIT細(xì)胞(Hamaguchi等人，《糖尿病》第40期，第842頁(yè)(1991))和RIN細(xì)胞(Chick等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》第74期，628-632頁(yè)(1977))、ATT細(xì)胞(Hughes等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》第89期，688-692頁(yè)(1992))、CHO細(xì)胞(Matsumoto等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》第87期，9133-37頁(yè)(1990))、和β-TC-3細(xì)胞(Tal等人，《細(xì)胞分子生物學(xué)》第12期，422-32頁(yè)(1992))。
本發(fā)明的細(xì)胞或者可從自然產(chǎn)生生物活性分子，或者可經(jīng)過(guò)基因工程操作而產(chǎn)生生物活性分子。例如，可用選定產(chǎn)物(如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、胰島素、CNTF或因子VIII)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。
用于治療疾病或障礙的生物活性分子的例子包括可用于治療糖尿病的胰島素，可用于治療甲狀旁腺機(jī)能減退的甲狀旁腺激素，用于治療貧血的促紅細(xì)胞生成素以及治療癲的γ-氨基丁酸。
類似地，如營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的生物活性分子可用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病，如杭廷頓氏舞蹈病和早老性癡呆、與AIDS相關(guān)的癡呆和帕金森氏病。如淋巴因子或細(xì)胞因子的生物反應(yīng)因子可增強(qiáng)病人的免疫系統(tǒng)或可用作抗炎癥劑，并可用于治療某些慢性感染性疾病或癌癥。另外，經(jīng)包被的細(xì)胞也可提供兒茶酚胺、內(nèi)啡肽、腦啡肽和其他阿片樣肽以治療疼痛。
可使用經(jīng)包被細(xì)胞提供對(duì)修正酶缺陷有用的生物活性分子。這種缺陷的例子之一是暴發(fā)的肝損傷，其中肝組織不再能清除毒素或排出代謝廢產(chǎn)物。另一個(gè)例子是苯丙酮酸尿癥，其中氨基酸苯丙氨酸在受侵襲的未成年人血流中增多至危險(xiǎn)的水平。
另外，經(jīng)包被的細(xì)胞也可產(chǎn)生能從宿主中除去有毒或不需要的產(chǎn)物的生物活性分子。例如，經(jīng)包被的細(xì)胞可產(chǎn)生能從宿主中“清除”膽固醇的生物活性分子。
本發(fā)明的生物活性分子包括激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、血管生成因子、抗體、血液凝集因子、淋巴因子、酶和其他治療劑或其拮抗劑、前體、活性類似物或其活性片段。它們包括兒茶酚胺、內(nèi)啡肽、腦啡肽和其他阿片樣肽、強(qiáng)啡肽、胰島素、因子VIII、促紅細(xì)胞生成素、P物質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、來(lái)自膠質(zhì)細(xì)胸系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、來(lái)自血小板的生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、來(lái)自腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4/5(NT-4/5)系列成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、CNTF相關(guān)分子和胰島素樣生長(zhǎng)因子I、II和III。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性分子是神經(jīng)遞質(zhì)。這種神經(jīng)遞質(zhì)包括多巴胺、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羥色胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素、腎上腺素、谷氨酸和其他肽神經(jīng)遞質(zhì)，優(yōu)選多巴胺、去甲腎上腺素或腎上腺素。另外，生物活性分子也可以是神經(jīng)遞質(zhì)的拮抗劑、類似物、衍生物或片段，包括例如多巴胺的前體L-多巴。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，適應(yīng)細(xì)胞可分泌抗傷害感受劑，包括兒茶酚胺、腦啡肽、阿片樣肽或其拮抗劑或類似物，它們可被使用，或者可包括它們的混合物。優(yōu)選分泌兒茶酚胺或腦啡肽，最優(yōu)選分泌兒茶酚胺和腦啡肽的混合物。
用于本發(fā)明的膠囊典型地至少具有一個(gè)半透外表面膜或包周含細(xì)胞核心的套。此套允許營(yíng)養(yǎng)物、生物活性分子和其他選定產(chǎn)物透過(guò)膠囊擴(kuò)散。此膠囊是生物可容性的，優(yōu)選為免疫分離性的。核心內(nèi)含有分離的細(xì)胞，或者懸浮于液體介質(zhì)中或者固定在水凝膠基質(zhì)內(nèi)部。
用來(lái)構(gòu)建膠囊之材料的選擇由許多因素確定，并詳細(xì)描述于Dionne WO 92/19195中。簡(jiǎn)單地說(shuō)，多種聚合物和聚合物混合物可用來(lái)制備膠囊套。形成膠囊的聚合物膜可包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸酯類共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜類、Polyphosp-hazenes、聚丙烯腈、PAN/PVC及其衍生物、共聚物和混合物。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法形成膠囊。其中一種方法包括共擠壓聚合物噴射溶液和促凝劑，其包括生物組織片段，細(xì)胞器或細(xì)胞和/或其他治療劑的懸浮液。膠囊套可為單層(1，2型)或雙層(4型)。當(dāng)共擠壓時(shí)通過(guò)反淬滅聚合物溶液的一個(gè)表層即可產(chǎn)生單層中空纖維。當(dāng)共擠壓時(shí)通過(guò)淬滅聚合物溶液的兩個(gè)表層即可產(chǎn)生雙層中空纖維。典型地，1型中空纖維與4型中空纖維相比，其表面被大氣孔占據(jù)的百分比更大。2型中空纖維居中。例見(jiàn)列入本文作為參考的Dionne WO 92/19195和美國(guó)專利5,158,881，5,283,187和5,284,761。
許多膠囊構(gòu)型都是可能的，例如圓筒形、圓盤形或球形。
載體的套所具有的微孔大小可決定選擇通透性膜切斷的分子量(MWCO)。大于MWCO的分子受到物理阻礙，不能橫跨膜。選擇膜微孔的大小以允許細(xì)胞產(chǎn)生的特殊因子從載體中擴(kuò)散出來(lái)，但可阻止宿主免疫反應(yīng)因子進(jìn)入載體。典型地，MWCO在50和200KD之間變化，優(yōu)選為50至100KD之間。最適合的膜組合物也可以使已知存在于選定植入位點(diǎn)上的宿主免疫效應(yīng)物分子和載體外膜成分之間的反應(yīng)性減至最小。
構(gòu)建免疫分離載體的核心以提供在其中分離的特殊細(xì)胞的適當(dāng)局部環(huán)境。此核心可包含足以維持細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。液體核心特別適合維持如PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系?？蛇x擇地，核心也可包含凝膠基質(zhì)，此凝膠基質(zhì)由小凝膠(藻酸鹽、“Vitrogen”等)或細(xì)胞外的基質(zhì)成分組成。例見(jiàn)Dionne WO 92/19195。
形成小凝膠的組合物可分成三種一般類型。第一類攜帶凈負(fù)電荷(如藻酸鹽)。第二類攜帶凈正電荷(如膠原和層粘連蛋白)。商業(yè)上可得到的細(xì)胞外基質(zhì)成分的例子包括MatrigelTM和VitrogenTM。第三類為凈電中性(如高度交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷或聚乙烯醇)。
由水凝膠基質(zhì)制成的核心特別適于維持趨于形成附聚物或聚集體的細(xì)胞或組織，如朗氏細(xì)胞的子集細(xì)胞或腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
影響膠囊核心內(nèi)裝入的細(xì)胞數(shù)目或組織量的因子包括(1)膠囊大小和幾何形狀；(2)膠囊內(nèi)的細(xì)胞有絲分裂活性，和(3)核心的制備和/或裝入的粘度需要。這些因子詳細(xì)描述于Dionne WO 92/19195中。
通過(guò)在膠囊上裝備一個(gè)繩即可容易地回收植入的大膠囊。使用吸出法或任何其他適當(dāng)?shù)姆椒苫厥瘴⒛z囊。尤其是，使用PCT/US 93/07076中描述的袋裝置可便于微膠囊的回收。
可使用任何適于封閉膠囊的方法，包括使用聚合物膠粘劑和/或卷曲、連結(jié)和熱封閉。這些封閉技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。另外，也可使用任何適當(dāng)?shù)摹案稍铩狈忾]方法。在這種方法中，提供了一個(gè)基本上無(wú)孔的裝置，含有細(xì)胞的溶液通過(guò)此裝置被引入，裝滿之后封閉膠囊。列入本文作為參考的PCT/US 94/07015中描述了此方法。
植入體內(nèi)之前，優(yōu)選使用一種或多種體外測(cè)定以確定膠囊的功能。本領(lǐng)域熟知的測(cè)定法或診斷試驗(yàn)可用于這些目的。例見(jiàn)《酶學(xué)方法》，Abelson編輯，研究出版社，1993。例如可使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、層析或酶測(cè)定法或分泌產(chǎn)物的特定生物測(cè)定法。如果需要，可通過(guò)從受體搜集適當(dāng)樣品(如血清)并檢測(cè)之來(lái)監(jiān)測(cè)植入物的分泌功能達(dá)一段時(shí)間)。如果受體是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，則可使用微量透析。
另外，通過(guò)監(jiān)測(cè)如氧攝取、葡萄糖利用或線粒體功能的這些功能還可測(cè)定細(xì)胞的代謝活性。使用本領(lǐng)域已知的方法(如使用Dia-mond General Oxygen Uptake System(#1271)和帶有聚乙烯膜的Clark-style電極(#731)可測(cè)量氧攝取率。
通過(guò)使用本領(lǐng)域已知技術(shù)測(cè)定基因插入物的拷貝數(shù)即可評(píng)價(jià)工程化細(xì)胞表達(dá)異源基因產(chǎn)物的遺傳穩(wěn)定性。例如，通過(guò)酶解消化基因組DNA、印跡、探測(cè)并使用Phoshor Imager(Molecular Dynamics)將信號(hào)與已知標(biāo)準(zhǔn)相比較即可測(cè)出質(zhì)粒拷貝數(shù)。
當(dāng)植入由特殊應(yīng)用所需生物活性量來(lái)確定時(shí)，膠囊數(shù)目和膠囊大小應(yīng)足以產(chǎn)生治療效果。在分泌細(xì)胞釋放治療物質(zhì)的情況下，可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)劑量考慮和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定所需分泌物質(zhì)的量。Dionne，WO 92/19195中討論了要考慮的因子。
經(jīng)包被細(xì)胞的植入在無(wú)菌條件下進(jìn)行。通常，植入膠囊的宿主位點(diǎn)允許適當(dāng)傳遞分泌產(chǎn)物或?qū)λ拗鞯淖饔?，以及將營(yíng)養(yǎng)物傳遞劑植入細(xì)胞或組織，此位點(diǎn)也允許接近膠囊以回收和/或替換。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明，不要認(rèn)為它以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1暴露于低氧和葡萄糖環(huán)境中的經(jīng)包被BHK細(xì)胞所分泌的NGFBHK-hNGF細(xì)胞系的產(chǎn)生產(chǎn)生可分泌NGF的BHK細(xì)胞系并將它暴露于低氧和葡萄糖環(huán)境中。在以DHFR為基礎(chǔ)的PNUT表達(dá)載體中，緊接小鼠金屬硫蛋白-1啟動(dòng)子(-650至+7)和大鼠胰島素II基因的第一內(nèi)含子下游亞克隆了約含有第一內(nèi)含子3′末端37bp的2.51Kb片段，據(jù)信為pre-pro-NGF蛋白質(zhì)翻譯起始信號(hào)的兩個(gè)ATG序列以及人基因的完整編碼序列和完整的3′非翻譯區(qū)(Hoyle等人，《神經(jīng)元》第10期，第1019-34頁(yè)(1993)(Baetge等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院公報(bào)》第83期，5454-58頁(yè)(1986)。
使用磷酸鈣法用pNUT-βNGF構(gòu)建體轉(zhuǎn)染幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞。37℃下，于5％CO2，含10％胎牛血清、1×pen/strep/amph B(0.8g/l)和L-谷氨酰胺(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)BHK細(xì)胞。在含有200μm氨甲蝶呤(Sigma)的培養(yǎng)基中選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞達(dá)3-4周，用或不用200μm氨甲蝶呤將抗性細(xì)胞保持為多克隆種群。PAN/PVC纖維的制備通過(guò)干噴-濕旋技術(shù)可制備選擇通透性的中空纖維〔Cabasso，《中空纖維膜》第12卷，《科克—奧期瑪化學(xué)技術(shù)百科全書》，Wiley，紐約，第3版，第492-517頁(yè)，1980；Dionne的國(guó)際專利WO 92/19195〕。不對(duì)稱的中空纖維由二甲基亞砜中的10％(W/W)聚丙烯腈聚氯乙烯(PAN/PVC)共聚物溶液澆鑄而成，并在凝結(jié)劑浴中直接淬火。在無(wú)溶劑水浴中收集所得雙層(4型)纖維，用甘油處理并干燥之?；|(zhì)的制備在1ml酚紅/磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中加入8ml大鼠尾部膠原(IV型、Collaborative、lot 91-1083)并將溶液調(diào)至pH7.0。在2ml酚紅/PBS中加入8ml Vitrogen(Celtrix Palo Alto、CA；Lot 92H176)。將等體積的膠原和Vitrogen溶液相混合以形成基質(zhì)溶液。裝入和封閉步驟用PBS(不含鈣和鎂)沖洗生長(zhǎng)至90％鋪滿的產(chǎn)NGF的BHK細(xì)胞之單細(xì)胞懸液，用胰蛋白酶消化約1分鐘，在1000rpm下離心3分鐘以沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中至最終細(xì)胞濃度為2×107細(xì)胞/ml。然后將此細(xì)胞懸浮與膠原/Vitrogen基質(zhì)溶液按1∶1混合，使最終細(xì)胞濃度為1×107細(xì)胞/ml。
在基質(zhì)中輕緩地混合細(xì)胞以確保包被前懸浮液可平均分布。使用24-孔徑斜截導(dǎo)管滴頭和Hamilton注射器將2.5微升(μl細(xì)胞/基質(zhì)懸浮液(10.000細(xì)胞/μl)裝入纖維中。通過(guò)在沖頭上封固一個(gè)1-1.1cm長(zhǎng)的干燥中空纖維即可封閉膠囊，所述沖頭在最接近的末端具有一個(gè)隔膜固定裝置，此末端具有可使細(xì)胞注射進(jìn)裝置腔的裝載入口。注入2.5μl細(xì)胞懸浮液之后，隔膜裂開(kāi)，使用光硫化丙烯酸酯(LuxtrakTMLCM 24、ICI樹(shù)脂，美國(guó)馬里蘭州威明頓)封閉入口(“沖頭”)封閉。然后通過(guò)將一個(gè)1.5cm的0.020”硅橡膠管放在丙烯酸類沖頭上即可“栓住”膠囊。
在大氣氧水平下使膠囊適應(yīng)3天，檢測(cè)基線NGF分泌情況。用1毫升(ml)新鮮培養(yǎng)基替換使用了3天的培養(yǎng)基。
然后將膠囊放在含低葡萄糖(0.8mg/l)和低氧(50mmHg)或高葡萄糖(5.5mg/l)和大氣(142mmHg)氧水平的24孔培養(yǎng)板中。每隔7天更換一次培養(yǎng)基并進(jìn)行NGF測(cè)定。更換前一天，將新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到每個(gè)適應(yīng)條件下的適當(dāng)氧濃度中，用此方法培養(yǎng)經(jīng)包被的細(xì)胞達(dá)4周。
在第0、3、7、14、21和28天，通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)測(cè)定NGF水平。用4％低聚甲醛固定代表性膠囊以組織學(xué)測(cè)定細(xì)胞存活力的分布情況。
在4％低聚甲醛中固定之后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗回收的膠囊，在超過(guò)95％級(jí)的乙醇中脫水，在甲基丙烯酸乙二醇酯浸潤(rùn)液(Historesine封固劑，Reichert-Jung)中包埋。在切片機(jī)(Supercut2065、Leica)上切下3微米厚的切片，在玻璃載片上封固并用甲酚紫染色。NGF ELISA按下述對(duì)經(jīng)包被的BHK/NGF的細(xì)胞所釋放的hNGF進(jìn)行定量測(cè)定。在每孔中用150μl于外被緩沖液(不含CaCl2并不含MgCl2/0.1％疊氮化鈉；pH9.6)中的濃度為1ng/ml的抗-小鼠-β(2.5S)NGF覆蓋Nunc-Immuno Maxisorp ELISA培養(yǎng)板，在37℃下至少保溫2小時(shí)或可選擇地在4℃下過(guò)夜。
棄去外被溶液，用300μl洗滌緩沖液(50mm Tris-HCl/200mmNaCl/1％曲通x-100/0.1％疊氮化鈉；pH7.0)將孔洗3次，在室溫下用含有10mg/ml BSA的300μl外被溶液封閉30分鐘。再用300μl洗滌緩沖液將孔洗3次。在2倍樣品緩沖液(樣品緩沖液與洗滌緩沖液相同，只是含2％BSA)中將條件培養(yǎng)基樣品按1∶1稀釋，在孔中裝入10μl制備好的樣品。37℃下溫育培養(yǎng)板至少2小時(shí)或4℃下過(guò)夜。
倒空每孔，用300μl洗滌緩沖液洗3次，加入100μl 4u/ml的抗-小鼠-β(2.5S)NGF-β-gal綴合物。37℃下將培養(yǎng)板溫育至少1小時(shí)。倒空每孔，用300μl洗滌緩沖液洗3次，加入200μl氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷底物溶液(40mg CPRG，溶于100mm Hepes/150mm NaCl/2mm MgCl2/0.1％疊氮化鈉/1％BSA；pH7.0中)。37℃下將培養(yǎng)板溫育30分鐘至1小時(shí)或直至顏色的生成足以在570nm下進(jìn)行光度測(cè)定。結(jié)果圖1和圖2顯示了在兩種環(huán)境條件下，每個(gè)以沖頭封口的10％4型纖維膠囊作為時(shí)間函數(shù)的NGF釋放量。數(shù)據(jù)表示為每個(gè)膠囊每24小時(shí)釋放的ng NGF。在評(píng)價(jià)階段，每個(gè)膠囊所產(chǎn)生的NGF呈上升趨勢(shì)。實(shí)施例2包裹在具有變化的液壓滲透性的膠囊之后有所適應(yīng)的BHK細(xì)胞分泌的NGF本實(shí)施例所用的BHK-hNGF細(xì)胞如實(shí)施例1中所述。按實(shí)施例1所述制備中空纖維，不同之處在于使用12.5％和15％PAN/PVC以及含10％PAN/PVC的噴射溶液來(lái)制備大膠囊。PAN/PVC雙層纖維(T4)為1cm長(zhǎng)并具有下列特性％固體I.D.(μm)液壓滲透性10 7216012.57332015 74613(液壓滲透性為ml/min/m2/mmHg)將BHK-hNGF細(xì)胞裝進(jìn)三種類型的大膠囊中，并按實(shí)施例1的描述封口。將此膠囊在低葡萄糖和低氧條件下暴露4周，并按實(shí)施例1的描述檢測(cè)NGF的釋放。
圖3顯示了從三種不同的膠囊類型中釋放的作用時(shí)間函數(shù)的NGF量。4周后，由10％的PAN/PVC膠囊所釋放的NGF平均值為約50ng/膠囊/24小時(shí)，而由12.5％PAN/PVC膠囊所釋放的NGF平均值約為30ng/膠囊/24小時(shí)。在1、2、3或4周后，由15％PAN/PVC膠囊產(chǎn)生的NGF為不可檢測(cè)的水平。對(duì)膠囊的組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)了在10％和12.5％的PAN/PVC膠囊中存在生長(zhǎng)良好的細(xì)胞簇。4周后只有15％的PAN/PVC膠囊中存在死細(xì)胞。實(shí)施例3經(jīng)包被的BHK-hNGF細(xì)胞被植入宿主將實(shí)施例1的經(jīng)包被細(xì)胞暴露于實(shí)施例1的低氧和葡萄糖濃度下直至BHK細(xì)胞的NGF釋放水平在這些限制性條件下穩(wěn)定為止。將經(jīng)包被的細(xì)胞植入人宿主。植入位點(diǎn)包括旁室和腦紋狀體。引入本文作為參考的Aebischer等人、WO 93/00127中公開(kāi)了將膠囊植入腦的方法。實(shí)施例4經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞體外暴露于限制性條件如Livett，《生理學(xué)評(píng)論》，第64期，第1103-62頁(yè)(1984)所述，通過(guò)用膠原酶消化從牛腎上腺腺體中獲取腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
在與CaCl2交聯(lián)的1.5％藻酸鹽基質(zhì)中固定腎上腺細(xì)胞聚集體，并將所述細(xì)胞聚集體包裹在雙層4型，免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜中(ID 750μm、Wall 85μm、MWCO 60KD)，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
在20、40、60、80和142mmHg的PO2下將經(jīng)包被細(xì)胞培養(yǎng)2周。在第2和14天，檢測(cè)細(xì)胞的基本和K+-引發(fā)的兒茶酚胺釋放情況。14天后，在4％低聚甲醛中固定膠囊，并進(jìn)行組織學(xué)分類處理，切片和形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。
通過(guò)使用電化學(xué)檢測(cè)的HPLC分析兒茶酚胺。層析系統(tǒng)使用一個(gè)庫(kù)侖多電極檢測(cè)器(5100A型、ESA、Inc.)一個(gè)日立牌L6200泵(Hitachi、Inc.)、和一個(gè)配備有MPLC NewGuard Column(AppliedBiosystems、Inc.)的Hypersil 150mm×4.6mm、3微米OPS柱(Key-stone Scientific Inc.)，層析在26℃下進(jìn)行。
移動(dòng)相由75mM NaH2PO4、1.4mM辛烷磺酸、0.274mM EDTA和100ml/l CH3CN組成。用濃磷酸將pH調(diào)至3.0，流速維持在1.0ml/min。
檢測(cè)器裝備有預(yù)注射器保衛(wèi)元件(5020型)和高分辨率的雙重分析元件(5011型，前者在+450mV下操作，后者對(duì)電極1和2而言分別在-40mV和+400mV下以氧化屏的方式操作。在檢測(cè)器2中測(cè)量分析物。
使用三份標(biāo)準(zhǔn)以證實(shí)52fmol的L-多巴(L-、3、4-二羥基苯丙氨酸)、Dopac(3、4-二羥基苯乙酸)，去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)以及柱上104fmol HVA(同源香草酸)的檢測(cè)閾值，上述物質(zhì)的百分標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為閾值2-5％、9-12％、15-24％和6-17％。單份7點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線線形穿過(guò)柱上分析物的范圍，此范圍對(duì)L-多巴、Dopac、NE和DA而言為52至3300fmol，對(duì)HVA而言為104至6600fmol，它們的r2值分別為0.999、0.998、0.999和0.999。
使用Waters 845 VAx層析工作站捕獲數(shù)據(jù)并求峰面積的積分。
結(jié)果示于圖4。數(shù)據(jù)表示為每30分鐘的皮摩爾數(shù)(基本釋放量)或每15分鐘的皮摩爾數(shù)(K+-引發(fā)的釋放量)。在較高的O2濃度下，第14天基本的，更特別地為K+-引發(fā)的去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(EPI)的釋放量比第2天的要高一些。因此，將經(jīng)包被的細(xì)胞暴露于限制性條件可導(dǎo)致一種或多種細(xì)胞特性的改變。實(shí)施例5經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞暴露于體內(nèi)限制性條件如實(shí)施例4中所述制備牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞。在與CaCl2交聯(lián)的1.5％藻酸鹽基質(zhì)中固定腎上腺細(xì)胞聚集體，并將此細(xì)胞聚集體包裹在單層2型、免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜(ID500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中或雙層4型免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜(ID 500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
通過(guò)將經(jīng)包被細(xì)胞植入大鼠受體紋狀體可使之暴露于體內(nèi)限制性條件。在每只大鼠中兩側(cè)植入兩顆膠囊。沿中線切開(kāi)后，在顱骨上鉆一個(gè)洞，此洞的坐標(biāo)距前囟+0.5mm，位于門齒欄架側(cè)面3.0mm，在內(nèi)耳線下方-0.3mm。將膠囊放低使它深居硬腦膜7mm。
在植入前和體內(nèi)適應(yīng)6周后，檢測(cè)膠囊產(chǎn)生的兒茶酚胺。如實(shí)施例4所述檢測(cè)兒茶酚胺的量。
圖5顯示了使用2型膜得到的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為每個(gè)膠囊每15分鐘的皮摩爾數(shù)。植入前和植入6周后，基本的(A組)和K+-引發(fā)的(C組)NE和EPI釋放水平相似。然而，體內(nèi)暴露6周后，煙堿-引發(fā)的(B組)NE和EPI釋放水平高于植入前的水平。
圖6顯示了使用4型膜得到的結(jié)果。植入前和植入6周后，K+-引發(fā)的(C組)NE和EPI釋放水平類似。然而，體內(nèi)暴露6周后，煙堿-引發(fā)的(B組)NE和EPI釋放水平高于植入前的水平。另外，植入前和植入6周后(A組)的兒茶酚胺基本釋放水平之間有所不同。實(shí)施例6經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞暴露于體內(nèi)限制性條件如實(shí)施例4所述制備牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞。在與CaCl2交聯(lián)的1.5％藻酸鹽基質(zhì)中固定腎上腺細(xì)胞聚集體，將此細(xì)胞聚集體包裹在雙層4型、免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜(ID 500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
通過(guò)將經(jīng)包被的細(xì)胞植入大鼠受體的脊柱蛛網(wǎng)膜下隙可使細(xì)胞暴露于體內(nèi)限制性條件?；景碅ebischer et al.、WO 93/00127所述進(jìn)行外科步驟。
植入前和體內(nèi)暴露6周后檢測(cè)膠囊產(chǎn)生的兒茶酚胺。按實(shí)施例4所述檢測(cè)兒茶酚胺。數(shù)據(jù)表示為每個(gè)膠囊每30分鐘的皮摩爾數(shù)。
圖7表示植入前和植入后NE和EPI生產(chǎn)水平的差異。經(jīng)包被細(xì)胞的植入期為6個(gè)月。體內(nèi)植入6個(gè)月后，基本的和由煙堿刺激的EPI產(chǎn)量顯著降低，而NE產(chǎn)量顯著增加。實(shí)施例7經(jīng)包被的PC12細(xì)胞暴露于靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中的體內(nèi)限制性條件在添加有10％熱滅活的馬血清、5％胎牛血清和100單位青霉素/鏈霉素的RPMI懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)PC12細(xì)胞，收獲細(xì)胞，離心并棄去上清液。
70℃下通過(guò)劇烈攪拌將Fluka High MW脫乙酰殼多糖(4.4g)溶于150ml無(wú)菌的0.85％鹽水中，用45ml 100MM HEPES緩沖鹽水(pH8.0)將溶液的pH調(diào)至6.2。使溶液通過(guò)一個(gè)0.22μm的微孔濾膜以過(guò)濾除菌。
將脫乙酰殼多糖溶液與等體積的RPMI相混合，并用此混合液重新懸浮細(xì)胞沉淀物至終濃度為5×106細(xì)胞/ml。共擠壓細(xì)胞/脫乙酰殼多糖溶液(約1,000μl)與PAN/PVC以形成單層、xp11免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜(ID 450-500μm，Wall 50-65μm、MWCO 65-100KD，液壓滲透性為53ml/min/m2/mmHg、葡萄糖質(zhì)量轉(zhuǎn)移系數(shù)為8×10-4cm/s、微孔大小滲透性為88％BSA排斥系數(shù))。使用美國(guó)專利5,158,881、5,283,187和5,284,761所述的一般方法可形成這些纖維。將纖維調(diào)整為適當(dāng)?shù)某叽?約為1cm)并通過(guò)熱卷曲末端封閉纖維。
在3只Cynomologous猴中植入經(jīng)包被細(xì)胞，基本上按Aebischeret al.、WO 93/00127所述進(jìn)行外科步驟。在尾的不同位置植入兩個(gè)膠囊，在核的不同位置植入三個(gè)膠囊。植入核和尾的命名立體定位坐標(biāo)經(jīng)推知如下所述核位點(diǎn)1＝距內(nèi)耳O前方23.0mm，距矢狀縫側(cè)面9.0mm，距腦表面下方16.5mm；核位點(diǎn)2＝距內(nèi)耳O前方19.0mm，距矢狀縫側(cè)面10.0mm，距腦表面下方19.5mm；核位點(diǎn)3＝距內(nèi)耳O前方15.5mm，距矢狀縫側(cè)面11.5mm，距腦表面下方21.0mm；尾位點(diǎn)1＝距內(nèi)耳O前方18.0mm，距矢狀縫側(cè)面4.0mm，距腦表面下方15.0mm；尾位點(diǎn)2＝距內(nèi)耳O前方22.0mm、距矢狀縫側(cè)面4.5mm，距腦表面下方18.0mm。
將經(jīng)包被的細(xì)胞植入約6個(gè)月，然后回收。如實(shí)施例4所述檢測(cè)膠囊在植入前和植入后基本的和K+-引發(fā)的L-多巴(L-d)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(EPI)、dopac(dpc)、多巴胺(DA)、和同源香草酸(HVA)的釋放水平。表2所示數(shù)據(jù)表示為每個(gè)膠囊每30分鐘的皮摩爾數(shù)(基本的)或每個(gè)膠囊每15分鐘的皮摩爾數(shù)(K+-引發(fā)的)。表2的結(jié)果表明經(jīng)包被的細(xì)胞在限制性條件下暴露6個(gè)月后，其特性顯著不同。
表2
表2(續(xù))
表2(續(xù))
L-d＝L-多巴 dpc ＝dopac C1，C2＝尾位點(diǎn)NE ＝去甲腎上腺素DA＝多巴胺P1，P2，P3＝核EPI＝腎上腺素HVA ＝同源香草酸nd＝未檢測(cè)實(shí)施例8在人體內(nèi)植入經(jīng)包被的PC12細(xì)胞按實(shí)施例7所述包裹PC12細(xì)胞并植入受體。6個(gè)月后，外植膠囊并檢測(cè)L-多巴與多巴胺的比率。將細(xì)胞鋪在多孔平皿中，在體外O2條件范圍中培養(yǎng)。定期檢測(cè)細(xì)胞釋放的L-多巴和多巴胺的量。選擇釋放靶L-多巴與多巴胺比率的細(xì)胞，并使用基本上如WO 92/00127所述的外科步驟將細(xì)胞植入人腦。實(shí)施例9經(jīng)包被的PC12細(xì)胞暴露于大鼠紋狀體的體內(nèi)限制性條件膠囊基本上按實(shí)施例7所述，經(jīng)用使用PAN/PVC中空纖維的相轉(zhuǎn)化技術(shù)由中空纖維制備膠囊(ID 450-500μm、Wall 50-65μm、MW-CO 100KD、液壓滲透性53ml/min/m2/mmHg)。細(xì)胞培養(yǎng)和包被于37℃，在水飽和的7％CO2空氣氛中，將PC12和PC12A細(xì)胞在無(wú)血清的確定成分培養(yǎng)基HL-1(Ventrex、Inc.、Portland、Maine)中以80RPM的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)了500ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物。通過(guò)搜集旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物上清并在800g下離心以收獲細(xì)胞。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)的排斥評(píng)價(jià)細(xì)胞存活力，包裹前細(xì)胞存活力顯示為90±5％。
將細(xì)胞重新懸浮在HL-1、pH7.3中至濃度為4×107細(xì)胞/ml、在PC12和PC12A細(xì)胞中加入等體積的含2％(W/V)pH6.7低粘度脫乙酰殼多糖(PROTOSAN、脫乙酰殼多糖氯化物、Protan Biopoly-mer、Drammen、Norway)的溶液至終細(xì)胞濃度為2.0×107細(xì)胞/ml。
單個(gè)膠囊長(zhǎng)為7±0.5mm。分兩批制作裝滿了PC12和PC12A細(xì)胞的膠囊，并將其放入含1ml HL-1培養(yǎng)基的24多孔組織培養(yǎng)板中。
包被后5-7天，用1ml HBSS HEPES緩沖鹽水(含10μm抗壞血酸)將自由漂浮的膠囊洗滌兩次以除去殘留的培養(yǎng)物培養(yǎng)基。取樣由250μl HBSS中的30min保溫過(guò)程(基本釋放7組成)。快速加入檸檬酸鹽減少酸化緩沖液(CRAB)以防止所有的樣品氧化，在10mM檸檬酸，20μm偏亞硫酸氫鈉和0.1N高氯酸中產(chǎn)生穩(wěn)定的樣品制品。在-80℃下提供保藏。通過(guò)用HBSS稀釋貯存液并用CRAB和0.1N高氯酸穩(wěn)定稀釋液即可制備標(biāo)準(zhǔn)液。紋狀體的多巴胺耗盡肌內(nèi)注射1.0ml/Kg的氯胺酮(33mg/ml)、Xylazine(1.7mg/ml)和acepromazine(10mg/ml)混合物以麻醉大鼠，并將大鼠放在Kopf立體定位器中。以1.0μl/分鐘的速度灌注總量為12μg的6-OHDA(溶于含0.2μg/ml抗壞血酸的0.9％鹽水中，6μl體積，濃度為2μg/ml)。在灌注套管緩慢液回之前允許擴(kuò)散5分鐘。灌注坐標(biāo)為距前囟后面4.2mm，距中線側(cè)面1.0mm，距硬腦膜前側(cè)7.4mm。膠囊植入損傷后4個(gè)月(末次注射阿樸嗎啡2.75個(gè)月之后)植入膠囊，按前述麻醉大鼠，在其頭皮上切一矢狀切口并鉆一洞以放入聚合物膠囊。通過(guò)將膠囊放入裝備在立體定位框架上的18孔徑Teflon導(dǎo)管中可將膠囊植入大鼠。在套管內(nèi)放入一個(gè)不銹鋼封閉器，將此裝置放入腦內(nèi)，封閉器維持在原來(lái)位置，而外套管被升高至可被動(dòng)地將膠囊放進(jìn)宿主紋狀體。植入位點(diǎn)的立體定位坐標(biāo)是距前囟前方0.5mm、距矢狀縫側(cè)面3.8mm，距腦皮層表面下方7.5mm。對(duì)未接受移植的大鼠進(jìn)行假外科手術(shù)(麻醉、撕裂頭皮、顱骨穿孔、硬腦膜穿刺)。生化分析行為測(cè)定完成之后，在CO2室中麻醉不具膠囊、具PC12、PC12A的大鼠以及半數(shù)具空膠囊的大鼠并快速去頭。從它們的顱骨內(nèi)摘除腦，除去膠囊，將兩個(gè)紋狀體都切成碎片，放入Eppendorf管中并在液氮下快速冷凍。從宿主紋狀體中回收膠囊之后，將膠囊放入1ml磷酸鹽HBSS中的30分鐘，除去磷酸鹽HBSS并加入1mlHEPES HBSS。如實(shí)施例4所述進(jìn)行兒茶酚胺分析。兒茶酚胺測(cè)定完成后，將裝置放入4％低聚甲醛中并經(jīng)受形態(tài)學(xué)分析。
圖8顯示了對(duì)單個(gè)膠囊作圖的30分鐘后測(cè)量的多巴胺和L-多巴的釋放情況，每個(gè)膠囊都有指定的鑒定人數(shù)目。如圖8所示，植入后90天L-多巴和多巴胺的產(chǎn)生水平與植入前的水平顯著不同。實(shí)施例10經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞暴露于人蛛網(wǎng)膜下隙的體內(nèi)限制性條件按實(shí)施例4所述制備牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞，在與CaCl2交聯(lián)的1.5％藻酸鹽基質(zhì)中固定腎上腺細(xì)胞聚集體，并將此細(xì)胞聚集體包裹在雙層4型、免疫分離的PAN/PVC中空纖維膜(ID 770μm、Wall70μm、MWCO 60-100KD)中，所用方法基本如WO 92/19195中所述。
將經(jīng)包被細(xì)胞植入兩個(gè)病人的蛛網(wǎng)膜下隙，所述病人患有晚期癌癥，其疼痛因麻醉劑治療而得到不完全的緩解，而且沒(méi)有活性感染的癥狀，病人或者也可以患有腦膜下隙腫瘤。病人承認(rèn)了被告知的贊同意見(jiàn)，瑞士洛桑大學(xué)醫(yī)學(xué)院道德倫理委員會(huì)也接受了此贊同意見(jiàn)。
用1.0％利多卡因局部浸潤(rùn)以確保麻醉皮膚以及骨膜和其下方的其他深層結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，包括黃韌帶。在中線右或左1-2cm處的旁矢狀面切開(kāi)皮膚3-5cm并延伸至腰背筋膜以下。使用包括髂嵴和腰棘突起的傳統(tǒng)骨界標(biāo)以及熒光鏡指導(dǎo)，通過(guò)斜正中旁接近在L-3和L-4之間將18孔徑的Touhy針引入蛛網(wǎng)膜下隙。引入針以使它能以淺的向上的不超過(guò)30-35°的引入角進(jìn)入下隙，所述進(jìn)入角在矢狀平面或者橫截面上與脊髓相關(guān)。
一根引線穿到Touhy針沖頭腔下方直至它延伸到蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)4-5cm(經(jīng)預(yù)測(cè)量確定)。從線上除去Touhy針。
然后在引線上放一個(gè)7 French擴(kuò)張器，當(dāng)引線沿著朝向蛛網(wǎng)膜下隙之引線路徑，輕輕地但有力地穿過(guò)筋膜、旁棘肌和黃韌帶推進(jìn)時(shí)，即可用來(lái)引導(dǎo)擴(kuò)張器。
當(dāng)引線路徑被7 French擴(kuò)張器“過(guò)度擴(kuò)張”之后，可裝配一個(gè)6French擴(kuò)張器和套管殼并將它們放在引線上。仔細(xì)地將6 French擴(kuò)張器和套管推進(jìn)蛛網(wǎng)膜下隙直至套管的開(kāi)口滴頭位于下隙內(nèi)7cm處。
當(dāng)確證套管的定位適當(dāng)時(shí)，按順序從套管腔中輕輕取下引線和6 French擴(kuò)張器。
無(wú)菌雙外殼容器提供了經(jīng)包被的腎上腺嗜鉻細(xì)胞，所述細(xì)胞在轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中清洗過(guò)，并被完整地裝配，它包括管形硅氧烷系繩。裝置中的膜部分被仔細(xì)地引入套管。推進(jìn)膠囊直至膜的前端到達(dá)距蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)的套管頭部頂端內(nèi)2-10mm的點(diǎn)處。使用推進(jìn)器定位膠囊后，完全棄去套管和推進(jìn)器，膠囊的最終放置為裝置的5cm長(zhǎng)的膜部分完全放在馬尾下方含CSF的蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)。
在病人1中植入84天后外植膠囊，在病人2中植入55天后外植膠囊。暴露于體內(nèi)限制性條件后，將兒茶酚胺釋放量一一去甲腎上腺素(“NE”)和腎上腺素(“EPI”)與植入前的水平相比較(表3)。如實(shí)施例4所述測(cè)量?jī)翰璺影贰１?的數(shù)據(jù)表示為每個(gè)膠囊每30分鐘的皮摩爾數(shù)(基本的)或每個(gè)膠囊每15分鐘的皮摩爾數(shù)(煙堿刺激的N-S)。暴露于限制性條件之后兒茶酚胺的釋放量比植入前顯著不同。
表3膠囊的兒茶酚胺釋放量植入 外植NE E NEE病人1植入84天基本的 084 37N-S2932 26736366 8病人2植入55天基本的 48 120 4.1 69.3N-S5027 506310.6 65實(shí)施例11已適應(yīng)并重新包被的BHK-hNGF細(xì)胞暴露于體內(nèi)限制性條件根據(jù)實(shí)施例1制備經(jīng)包被的BHK-hNGF細(xì)胞，植入大鼠腦的旁室并在體內(nèi)限制性條件下暴露14個(gè)月以適應(yīng)。14個(gè)月后，外植膠囊，合并兩個(gè)膠囊內(nèi)的適應(yīng)細(xì)胞并通過(guò)在10％FBS DMEM培養(yǎng)基中傳代以擴(kuò)充細(xì)胞。此次實(shí)驗(yàn)使用的是被稱為BHK-hNGF克隆23的克隆系。等分這些細(xì)胞，將小傷細(xì)胞置液氮中冷凍。未在體內(nèi)適應(yīng)的對(duì)照BHK-hNGF克隆23細(xì)胞在體外于10％FBSDMEM中生長(zhǎng)(BHK-hNGF克隆23細(xì)胞庫(kù))。
檢測(cè)了下列六組細(xì)胞和膠囊組1BHK-hNGF 23細(xì)胞(來(lái)自體內(nèi)外植膠囊的適應(yīng)細(xì)胞)；重新包裹在Vitrogen基質(zhì)中；膠囊被植入大鼠腦旁室中；組2BHK-hNGF 23細(xì)胞；(適應(yīng)細(xì)胞)重新懸浮在10％FBSDMEM中以包裹(無(wú)基質(zhì))；膠囊被植入大鼠腦旁室中；組3BHK-hNGF 23對(duì)照細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞庫(kù)；以前未被植入過(guò))；包裹在Vitrogen基質(zhì)中；膠囊被植入大鼠腦旁室中；組4BHK-hNGF 23對(duì)照細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞庫(kù)；以前未被植入過(guò))；重新懸浮在10％FBS DMEM中以包裹(無(wú)基質(zhì))；膠囊被植入大鼠腦旁室中；組5BHK-對(duì)照細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞庫(kù)；以前未被植入過(guò))；包裹在Vitrogen基質(zhì)中；膠囊被植入大鼠腦旁室中；和組6BHK-對(duì)照細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞庫(kù)；以前未被植入過(guò))；重新懸浮在10％FBS DMEM(無(wú)基質(zhì))中以包裹；膠囊被植入大鼠腦旁室中。膠囊基本上按實(shí)施例1的描述包裹適應(yīng)的BHK-hNGF克隆23細(xì)胞。大多數(shù)膠囊由HF120794-6纖維制成，最終長(zhǎng)度為7mm。幾個(gè)對(duì)照膠囊由101-97-9纖維制成，此纖維與實(shí)施例7-9中所用的xp11纖維是可相容的。
平均而言，HF120794-6單層纖維的壁厚為86.4μ；內(nèi)徑(I.D.)為453.2μ；外徑(O.D.)為625.1μ；液壓滲透性(HP)為43.0mm/min/m2/mmHg；基于葡聚糖擴(kuò)散試驗(yàn)的截?cái)喾肿恿?MWCO)為187KD。
平均而言，101-97-9單層纖維的壁厚為59μ；I.D.為541μ；拉伸強(qiáng)度為31g；HP為62mm/min/m2/mmHg；基于葡聚糖擴(kuò)散試驗(yàn)的MWCO為88KD。
包裹包裹在基質(zhì)中的細(xì)胞(組1，3和5)被重新懸浮在Vitrogen中，該基質(zhì)已經(jīng)用PC-1培養(yǎng)基以1×107細(xì)胞/ml的負(fù)載密度稀釋了一倍。植入前使膠囊在PC-1培養(yǎng)基中維持5-7天。未用基質(zhì)包裹的組2，4和6的細(xì)胞被重新懸浮在10％FBS DMEM中，植入前維持期間將此懸液放進(jìn)滾筒上的管中。植入膠囊已在體內(nèi)適應(yīng)過(guò)的含BHK-hNGF細(xì)胞的膠囊和對(duì)照膠囊被隨機(jī)選擇并植入大鼠旁室的兩側(cè)。未適應(yīng)過(guò)的BHK-hNGF細(xì)胞的平行樣品用作對(duì)照。生化分析如實(shí)施例1所述，檢測(cè)組1-6的膠囊所釋放的NGF。植入前和植入一個(gè)月后測(cè)量含適應(yīng)或未適應(yīng)細(xì)胞的膠囊所釋放的NGF。組1-4的膠囊所釋放的NGF量示于圖11。沒(méi)有顯示未產(chǎn)生NGF的對(duì)照細(xì)胞數(shù)據(jù)。檢測(cè)過(guò)NGF釋放量之后，在4％低聚甲醛中固定膠囊并進(jìn)行處理以供組織學(xué)、切片和形態(tài)學(xué)分析。實(shí)施例12經(jīng)包被的PC12細(xì)胞暴露于單側(cè)黑質(zhì)損傷的大鼠體內(nèi)條件細(xì)胞培養(yǎng)和包裹基本上按實(shí)施例9的描述培養(yǎng)和包裹PC12細(xì)胞。黑質(zhì)多巴胺的耗盡6-羥基多巴胺(6-OHDA)對(duì)黑質(zhì)中的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)元具有選擇性毒性。黑質(zhì)中具6-OHDA損傷的大鼠會(huì)出現(xiàn)與低多巴胺水平相關(guān)的帕金森氏病樣特征，如實(shí)施例9所述麻醉大鼠并將它固定在Kopff立體定位器上。單側(cè)灌注總量為10μg的6-OHDA(4μg的量以2.5μg/μl溶于含0.2μg/μl抗壞血酸的0.9％鹽水中)并在灌注套管緩慢縮回之前允許擴(kuò)散5分鐘。灌注坐標(biāo)為距前囟后面3.2mm，距中線側(cè)面2.7mm，距硬腦膜下方8.0mm，門齒欄套位于其+5.0mm處。膠囊的植入大鼠被單側(cè)損傷后3至4周，雙側(cè)植入膠囊。使用實(shí)施例9所述的方法和立體定位坐標(biāo)麻醉大鼠并植入膠囊。生化分析植入后3、10、28和60天除去裝置，在CO2室中麻醉大鼠并快速去頭。從顱骨內(nèi)取出腦，從腦的損傷和未損傷(對(duì)照)側(cè)取出膠囊。通過(guò)將紋狀體和緊貼的核放在Eppendorf管中并在液氮中快速冷凍Eppendorf管即可使紋狀體和緊貼的核被撕成碎片以供兒茶酚胺分析。將膠囊放入1ml磷酸鹽HBSS中約30分鐘，除去磷酸鹽HBSS，加入1ml HEPES HBSS。如實(shí)施例4所述進(jìn)行兒茶酚胺分析。兒茶酚胺測(cè)定完成之后，將膠囊放在4％低聚甲醛中以進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
圖9(A組)表示植入前(“pre-”)的8個(gè)膠囊和植入損傷(低多巴胺)或未損傷(對(duì)照)紋狀體之后5、14、28或60天外植的膠囊在30分鐘內(nèi)平均釋放的L-多巴量。A組表示由經(jīng)包被的PC12細(xì)胞產(chǎn)生的兒茶酚胺相對(duì)量隨時(shí)間而變化。在體內(nèi)適應(yīng)兩至三周后，從損傷側(cè)和對(duì)照側(cè)外植的膠囊顯示出較高的L-多巴釋放速率。
圖9(B組)表示由上述A組膠囊釋放的L-多巴與多巴胺的比率。B組表示在體內(nèi)適應(yīng)了低多巴胺環(huán)境后，經(jīng)包被的細(xì)胞產(chǎn)生的L-多巴與多巴胺的比率比在對(duì)照環(huán)境中適應(yīng)的細(xì)胞要低一些。體內(nèi)適應(yīng)約14天后，L-多巴與多巴胺的比率變得相對(duì)穩(wěn)定。在體內(nèi)適應(yīng)之后，從損傷側(cè)和對(duì)照側(cè)外植的膠囊釋放的L-多巴與多巴胺比率水平比移植前的釋放水平要高。實(shí)施例13在靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中適應(yīng)的經(jīng)包被的PC12細(xì)胞在植入前和植入后所釋放的兒茶酚胺量的比較如實(shí)施例7所述，將PC12細(xì)胞包裹在“相當(dāng)于xp11”的纖維中并在靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中適應(yīng)。將大量研究此膠囊得出的兒茶酚胺釋放量與植入前相同膠囊所釋放的兒茶酚胺量相比較。檢測(cè)植入前經(jīng)包被的PC12細(xì)胞基本的L-多巴和多巴胺釋放速率。表4報(bào)道的數(shù)據(jù)表示植入前釋放的兒茶酚胺量。然后將膠囊植入靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦中以體內(nèi)適應(yīng)，植入后1、2.5、3、4、5和6個(gè)月外植膠囊并檢測(cè)基本的L-多巴和多巴胺釋放速率(圖10)。
圖10和表4的簡(jiǎn)要數(shù)據(jù)相比較表明植入前的釋放量和外植釋放量有顯著差別。表4第一行的植入前數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)于圖11中的1個(gè)月間隔處的外植數(shù)據(jù)點(diǎn)。同樣，表4中其他行的數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)于圖11中繪出的其他每月數(shù)據(jù)點(diǎn)。
表4植入前的植靈長(zhǎng)類動(dòng)物PC12膠囊釋放的兒茶酚胺量外植的PC12“相當(dāng)于xp-11”的纖維植入前對(duì)應(yīng)的基本的L-多巴 基本的多巴胺體內(nèi)時(shí)間pm/15min/ml pm/15min/ml平均值(S.D.) 平均值(S.D.)1(n＝6) 2.02(0.08) 2.95(4.1)2.5(n＝6)0.78(0.16) nd3(n＝6) 0.79(0.25) nd4(n＝2) 10.6(2.33) 2.39(0.82)5(n＝6) 2.06(0.01) 4.26(1.62)6(n＝15) 3.09(1.84) 21.3(21.7)實(shí)施例14產(chǎn)生可分泌hCNTF的BHK細(xì)胞系(BHK-CNTF)將人的CNIF(hCNTF)基因插入以二氫葉酸還原酶(DHFR)為基礎(chǔ)的表達(dá)載體pNUT中，該載體含有包括多接頭的完整pUC18序列。偏碼DHFR突變體形式的cDNA的轉(zhuǎn)錄由SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，3′末端與乙型肝炎病毒基因的3′末端(HBV3′)相融合以確保有效的多聚腺苷酸化和成熟的信號(hào)。
通過(guò)PCR擴(kuò)增人DNA可得到hCNTF基因。所用引物含有位于天然hCNTF起始密碼子位置處的EcoRI位點(diǎn)。hCNTF基因在其5′末端與小鼠免疫球蛋白(Ig)基因的150bp序列相融合。EcoRI位點(diǎn)以hCNTF蛋白的氨基末端部分對(duì)應(yīng)于Ig基因的前18個(gè)氨基酸的形式被使用，在hCNTF基因的3′末端克隆了人生長(zhǎng)激素基因(hGH)的325 bp AvaI片段，該片段含有多聚腺苷酸化序列和其他對(duì)于mRNA3′末端成熟很重要的序列。簡(jiǎn)單地說(shuō)，此片段被插入Blue-script多接頭的speI位點(diǎn)，從而在5′和3′末端分別產(chǎn)生了BamHI和NotI位點(diǎn)。將BamHI位點(diǎn)與hCNTF3′末端工程化的BglII位點(diǎn)連接。
將此構(gòu)建體插入小鼠MT-I啟動(dòng)子的位置+6，并在pNUT載體的KpnI-NotI位點(diǎn)插入完整的3050bp的MT/Ig/hCNTF/hGHKpnI-NotI片段。最后，在載體的NotI位點(diǎn)克隆HSV-TK基因，從而通過(guò)完整的PUC-18質(zhì)粒將HSV-TK基因與DHFR基因分離開(kāi)來(lái)。此最終構(gòu)建體被稱為RP3224EZ。
在標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌菌株(HB101)中擴(kuò)增RP3224EZ載體的DNA，并使用Qiagen-Plasmid試劑盒(Kontron)純化。使用標(biāo)準(zhǔn)的鈣/磷酸鹽轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染DNA，并用濃度漸增的氨甲喋呤選擇。在PC-1組織培養(yǎng)基中維持時(shí)應(yīng)不斷地在氨甲喋呤中選擇細(xì)胞。PC-1培養(yǎng)基是含有人重組源蛋白質(zhì)的確定成分的培養(yǎng)基。
藥物選擇后(25至200μm氨甲喋呤)，未經(jīng)藥物選擇使BHK細(xì)胞(BHK-CNTF)在體外維持幾個(gè)月，經(jīng)用Northern印跡分析，生物測(cè)定或ELISA評(píng)價(jià)時(shí)，顯示出CNTF表達(dá)沒(méi)有損失，由生物測(cè)定和ELISA確定時(shí)，CNTF的產(chǎn)生水平約為1.0ng/103細(xì)胞/小時(shí)。實(shí)施例15在人腰蛛網(wǎng)膜下隙適應(yīng)過(guò)并重新植入人體中的BHK-CNTF細(xì)胞可治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化細(xì)胞包裹基本上按實(shí)施例1所述包裹實(shí)施例14中可分泌CNTF的BHK細(xì)胞(BHK-CNTF)，不同之處在于使用了長(zhǎng)度適于植入人腰蛛網(wǎng)膜下隙的較長(zhǎng)的系繩。用密度為2×105轉(zhuǎn)染細(xì)胞/μl的膠原溶液(Zyderm)裝滿裝置。通過(guò)將膠囊放入2ml新鮮PC1培養(yǎng)基中浸30分鐘可測(cè)量每個(gè)膠囊釋放的CNTF。然后使用Rd D ELISA系統(tǒng)在收集培養(yǎng)基上進(jìn)行CNTF測(cè)定。選擇膠囊以鞘內(nèi)傳遞劑量為1μ/天的CNTF。每個(gè)病人接受一個(gè)裝置。經(jīng)包被的BHK-CTNF細(xì)胞在腰蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)體內(nèi)適應(yīng)經(jīng)包被的BHK-CNTF細(xì)胞已植入人受試者腰蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)1個(gè)月。其他的膠囊將在體內(nèi)適應(yīng)6個(gè)月以上。在第一個(gè)月外植時(shí)，如實(shí)施例12所述測(cè)定了每個(gè)膠囊釋放CNTF的速率。進(jìn)行了CNTF測(cè)定之后，在4％低聚甲醛中固定膠囊并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
從膠囊中取出在體內(nèi)適應(yīng)的BHK-CNTF細(xì)胞，合并并立即在經(jīng)選擇與受試者蛛網(wǎng)膜下隙環(huán)境最密切吻合的低氧和葡萄糖限制性條件下，通過(guò)在PC1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以培養(yǎng)細(xì)胞。在環(huán)境條件下培養(yǎng)BHK-CNTF細(xì)胞以作為并列的對(duì)照。鑒定適應(yīng)過(guò)的細(xì)胞，并使此細(xì)胞進(jìn)一步適應(yīng)其他限制性條件。
在一套實(shí)驗(yàn)中，在體外于環(huán)境或限制性條件下培養(yǎng)的已在體內(nèi)適應(yīng)過(guò)的BHK-CNTF細(xì)胞需經(jīng)重新包裹(基本上與第一次包裹所用方法相同)并植入宿主受試者。
在另一套實(shí)驗(yàn)中，植入人宿主的適應(yīng)細(xì)胞首先應(yīng)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物受體的體外限制性條件下適應(yīng)。
受試者是被診斷為ALS的病人，此病是由上肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在多種水平上短缺；闡明了3肢或2肢和延髓肌肉系統(tǒng)的活性和慢性去神經(jīng)法的起確定作用的電生理學(xué)研究；在隨意運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)外部沒(méi)有神經(jīng)病學(xué)的介入；沒(méi)有能導(dǎo)致神經(jīng)病短缺，尤其是漿細(xì)胞惡液質(zhì)的頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬的原發(fā)性疾病的跡象聯(lián)合證實(shí)的。病人相對(duì)強(qiáng)壯，即無(wú)需幫助即可行走并處于病程的早期。本專利強(qiáng)迫進(jìn)入時(shí)的生存能力＞正常情況下的75％。
在第一周每天、從第二周至第四周每周一次，以后每月一次監(jiān)測(cè)病人特別的副反應(yīng)，如發(fā)燒、口炎、咳嗽和皰疹的復(fù)能。每月進(jìn)行一次下列試驗(yàn)以評(píng)價(jià)效能；叢定量神經(jīng)病學(xué)測(cè)驗(yàn)(TQNE)；延髓協(xié)調(diào)；強(qiáng)制呼吸功能的存活能力、呼吸流量。前四周每周一次，以后每月一次抽取血液以檢測(cè)血漿CNTF、CNTF的潛在抗體、C-反應(yīng)性蛋白、血纖蛋白原。外科步驟植入經(jīng)包被的BHK-CNTF細(xì)胞的外科步驟如下所述。建立了IV通道并服用了預(yù)防性抗生素(頭孢唑啉鈉，1g IV)之后，將病人固定在手術(shù)臺(tái)上，病人通常采取腰椎前屈的側(cè)臥位或膝胸位。手術(shù)區(qū)域經(jīng)消毒處理，并用帷簾擋住，暴露出從S-1水平至L-1水平的中線背面的腰區(qū)域，并允許用C-臂熒光檢查使腰脊骨內(nèi)部手術(shù)成像。用1.0％利多卡因局部浸潤(rùn)以確保麻醉皮膚以及骨膜和其下方的其他深層結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，包括黃韌帶。
使用電烙術(shù)止血，在中線右或左1-2cm處的旁矢狀面切開(kāi)皮膚3-5cm并延伸至腰背筋膜以下。使用包括髂嵴和腰棘突起的傳統(tǒng)骨界標(biāo)以及熒光鏡指導(dǎo)，通過(guò)斜正中旁接近在L-3和L-4之間將18孔徑的Touhy針引入蛛網(wǎng)膜下隙。引入針以使它能以淺的向上的不超過(guò)30-50°的引入角進(jìn)入下隙，所述進(jìn)入角在矢狀平面或者橫截面上與脊髓相關(guān)。通過(guò)取出nml腦脊髓液(CSF)以供植入前兒茶酚胺、腦啡肽、萄萄糖、人CNTF和蛋白質(zhì)水平分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)從而可證實(shí)針頭的適當(dāng)位置。
重新檢查Touhy針沖頭以證實(shí)針頭的開(kāi)口向上定位)針沖頭上的封閉器指向刻痕標(biāo)示出開(kāi)口方向)、一根引線穿到針腔下方直至它延伸到蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)4-5cm(經(jīng)預(yù)測(cè)量確定)。在穿線過(guò)程中需注意的是對(duì)脫出針的線的推進(jìn)沒(méi)有阻力，病人沒(méi)有訴說(shuō)他們有神經(jīng)性綜合癥的痛苦，這些觀察結(jié)果中的任一個(gè)都可表明引線的方向錯(cuò)誤和可能逼近神經(jīng)根或脊髓損傷處。
引線似乎已適當(dāng)放置在蛛網(wǎng)膜下隙之后，從引線上分別取下并取出Touhy針。然后用熒光檢查法證實(shí)在脊髓管中線中的引線位置在馬尾預(yù)期位置的前方，并沒(méi)有紐結(jié)或無(wú)法解釋的彎曲。取出Touhy針之后，引線應(yīng)該能夠自由移進(jìn)和移出下隙，由于引線粗糙的表面穿過(guò)密集的和纖維狀的黃韌帶前進(jìn)，因而僅有很輕微的阻力。
然后在引線上放一個(gè)7 French擴(kuò)張器，當(dāng)引線沿著朝向蛛網(wǎng)膜下隙之引線路徑，輕輕地但有力地穿過(guò)筋膜、旁棘肌和黃韌帶推進(jìn)時(shí)，即可用來(lái)引導(dǎo)擴(kuò)張器。停止推進(jìn)7 French擴(kuò)張器，一旦穿過(guò)黃韌帶之后引導(dǎo)的阻力消失即從引線上取下擴(kuò)張器。這樣做是為了避免在任何顯著的程度上在蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)推進(jìn)和操作這個(gè)相對(duì)堅(jiān)硬的擴(kuò)張器。
當(dāng)引線路徑被7 French擴(kuò)張器“過(guò)度擴(kuò)張”之后，可裝配一個(gè)6French擴(kuò)張器和套管殼并將它們放在引線上。仔細(xì)地將6 French擴(kuò)張器和套管推進(jìn)蛛網(wǎng)膜下隙直至套管的開(kāi)口滴頭位于下隙內(nèi)7cm處。對(duì)7 French擴(kuò)張器而言，裝配的6 French擴(kuò)張器和套管被擴(kuò)張器腔內(nèi)的引線引導(dǎo)。通過(guò)預(yù)先側(cè)量此裝置以確定蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)的位置并通過(guò)熒光檢查法粗略地證實(shí)此位置。在蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)操作擴(kuò)張器和套管應(yīng)加倍小心以避免方向錯(cuò)誤和可能的神經(jīng)性損傷。
當(dāng)確證套管的定位適當(dāng)時(shí)，按順序從套管腔中輕輕取下引線和6 French擴(kuò)張器。根據(jù)病人在手術(shù)臺(tái)上的位置，在此點(diǎn)穿過(guò)套管的CSF流量應(yīng)該可以注意得到，并且可能很活躍，需要給套管加帽或很快速地放入植入膠囊以防止過(guò)量的CSF損耗。
無(wú)菌雙外殼容器提供了經(jīng)包被的適應(yīng)過(guò)的BHK-CNTF細(xì)胞，所述細(xì)胞在轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中清洗過(guò)，并被完整地裝配，它包括管形硅氧烷系繩。通過(guò)套管植入蛛網(wǎng)膜下隙之前，將膠囊轉(zhuǎn)移到插入試劑盒盤中，其定位的位置允許膠囊在其被粗略檢查損壞或主要的欠缺之處時(shí)可維持在轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中。
通過(guò)將推進(jìn)器的小直徑引線部分插到裝置的膜部分可使膠囊的系繩部分裝備到不銹鋼推進(jìn)器上，并仔細(xì)地引入套管中。推進(jìn)膠囊直至膜前端到達(dá)蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)的套管頭部頂端由2-10mm的點(diǎn)處。這種放置是通過(guò)預(yù)先測(cè)量套管和膠囊—系繩—推進(jìn)器裝置而得到的，它可以確保膠囊的膜部分在推進(jìn)至位置的完整時(shí)間進(jìn)程中被套管保護(hù)。
膠囊在套管內(nèi)定位之后，使用推進(jìn)器將膠囊維持在蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)的原有位置(不推進(jìn)或取下)，下并從膠囊和推進(jìn)器上完全取下套管。然后通過(guò)從硅氧烷系繩上滑下其引線部分以從膠囊上取下推進(jìn)器。使用此方法，膠囊最終的放置位置是裝置的膜部分完全平放在馬尾下方的含CSF的蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)。使用粗長(zhǎng)度為1-2cm的硅氧烷系繩在其尾端固定膠囊，所述系繩在通過(guò)硬腦膜和黃韌帶退出之前在蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)穿行。系繩由穿過(guò)旁棘肌的水平在外部延伸，并從腰背筋膜處出現(xiàn)，一般留出系牢裝置可以使用的10-12cm自由的系繩材料。
通過(guò)在被旁棘肌中系繩占據(jù)的通道中注射血纖蛋白膠(Tissel)并通過(guò)錢袋繩縫合緊緊關(guān)閉通道的表淺筋膜開(kāi)口即可使CSF滲漏減至最少量。然后用非吸收性的縫線固定系繩的自由端，并用皮膚和皮下組織的2層封閉物完全覆蓋。
然后將病人轉(zhuǎn)移到神經(jīng)外科恢復(fù)區(qū)，手術(shù)后24小時(shí)嚴(yán)格臥床休息，不能活動(dòng)。植入步驟之后，抗生素預(yù)防也需持續(xù)24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.在宿主中植入細(xì)胞的方法，包括(a)將細(xì)胞包裹在生物可容性膠囊中，(b)將細(xì)胞暴露于一種或多種限制性條件達(dá)足夠一段時(shí)間以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性，和(c)在宿主的植入位點(diǎn)植入經(jīng)包被的細(xì)胞，植入后細(xì)胞特性基本能夠維持。
2.權(quán)利要求1的方法，其中經(jīng)包被的細(xì)胞暴露于體外的限制性條件。
3.權(quán)利要求1的方法，其中經(jīng)包被的細(xì)胞通過(guò)植入受體的植入位點(diǎn)而暴露于體內(nèi)的限制性條件。
4.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞與宿主異源，膠囊為免疫分離性的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種限制性條件是在約40mg/分升至約70mg/分升之間變化的葡萄糖濃度。
6.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種限制性條件是在約40mmHg至約65mmHg之間變化的氧濃度。
7.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種限制性條件是低于腦脊髓液或腦實(shí)質(zhì)中生理多巴胺濃度的多巴胺濃度。
8.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞選自由腎上腺嗜鉻細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和PC12細(xì)胞組成的組中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞是PC12細(xì)胞，并被植入受體達(dá)6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。
10.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞是腎上腺嗜鉻細(xì)胞并被植入受體4個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。
11.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞是PC12細(xì)胞，并被植入受體達(dá)3周或更長(zhǎng)時(shí)間。
12.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞產(chǎn)生了生物活性分子，所述分子選自由神經(jīng)遞質(zhì)、止痛藥和生長(zhǎng)因子組成的組中。
13.權(quán)利要求12的方法，其中生物活性分子是至少一種兒茶酚胺。
14.權(quán)利要求1的方法，其中膠囊在植入位點(diǎn)處被植入宿主，所述位點(diǎn)選自由腦脊髓液和腦實(shí)質(zhì)組成的組中。
15.權(quán)利要求1的方法，其中宿主是人。
16.表現(xiàn)出對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性的細(xì)胞，所說(shuō)細(xì)胞的產(chǎn)生是通過(guò)(a)在生物可容性膠囊中包被細(xì)胞，和(b)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物受體的植入位點(diǎn)處植入經(jīng)包被的細(xì)胞，細(xì)胞與受體異源，植入期至少為6個(gè)月以建立對(duì)植入位點(diǎn)處所遇限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性。
17.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中細(xì)胞選自由非靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎上腺嗜鉻細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和PC12細(xì)胞組成的組中。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中細(xì)胞是非靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腎上腺嗜鉻細(xì)胞。
19.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中細(xì)胞是PC12細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18或19的細(xì)胞，其中所需細(xì)胞特性是細(xì)胞經(jīng)改變的兒茶酚胺釋放量。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所需細(xì)胞特性是細(xì)胞增加的兒茶酚胺釋放量。
22.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中膠囊在植入位點(diǎn)處被植入，所述位點(diǎn)選自由腦脊髓液或腦實(shí)質(zhì)組成的組中。
23.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中宿主是人。
24.將細(xì)胞植入異源宿主的方法，包括(a)在兩種或多種限制性條件下培養(yǎng)細(xì)胞，(b)將細(xì)胞包被在生物可容性膠囊內(nèi)并進(jìn)一步使經(jīng)包被的細(xì)胞暴露于一種或多種限制性條件達(dá)足夠一段時(shí)間以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性，和(c)將經(jīng)包被的細(xì)胞植入宿主內(nèi)的植入位點(diǎn)，植入后細(xì)胞特性基本上可以維持。
全文摘要
本發(fā)明提供了將經(jīng)包被細(xì)胞植入宿主的方法，此方法包括使細(xì)胞暴露于限制性條件達(dá)足夠一段時(shí)間以建立對(duì)限制性條件反應(yīng)的所需細(xì)胞特性，將經(jīng)包被的細(xì)胞植入宿主，植入后細(xì)胞特性基本上可以維持。本發(fā)明還提供了通過(guò)暴露于限制性條件而產(chǎn)生的細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1146155SQ95192579
公開(kāi)日1997年3月26日 申請(qǐng)日期1995年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月15日
發(fā)明者L·M·霍蘭德, J·P·哈曼格, S·A·魯尼克, M·J·利薩特, K·E·迪奧尼 申請(qǐng)人:細(xì)胞治療公司