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用于異丁醇生產(chǎn)的宿主細胞和方法

文檔序號:510564閱讀:461來源:國知局
用于異丁醇生產(chǎn)的宿主細胞和方法
【專利摘要】本文提供了產(chǎn)生異丁醇的重組酵母宿主細胞及其使用方法。所提供的酵母宿主細胞包含:異丁醇生物合成途徑和降低或消除的醛脫氫酶活性、降低或消除的乙酰乳酸還原酶活性中的至少一個;或編碼具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性的多肽的異源多核苷酸。
【專利說明】用于異丁醇生產(chǎn)的宿主細胞和方法
[0001]政府許可權利
[0002]本發(fā)明根據(jù)能源部授予的合同號DE-AR0000006受到美國政府的支持。美國政府擁有本發(fā)明的某些權利。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明涉及用于異丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的重組宿主細胞和方法。
_4] 相關申請的交叉引用
[0005]本專利申請根據(jù)35U.S.C.§ 119 (e)要求美國專利申請61/472,484 (提交于2011 年 4 月 6 0),61/467, 261 (提交于 2011 年 3 月 24 0),61/472, 487 (提交于 2011 年
4月 6 H),61/467, 271 (提交于 2011 年 3 月 24 H),61/570, 513 (提交于 2011 年 12 月 14日)、61/467,249 (提交于2011年3月24日)、61/472,497 (提交于2011年4月6日)以及61/472,474 (提交于2011年4月6日)的優(yōu)先權,其各自全文以引用的方式并入本文。
[0006]對于通過EFS-WEB電子遞奪的序列表的引用
[0007]電子遞交的序列表(名稱:20120323_CL5367USNA_SEQLIST.txt ;大小 2,003, 893字節(jié);創(chuàng)建日期2012年3月23日)的內(nèi)容在此全文以引用的方式并入本文。
【背景技術】
[0008]丁醇是重要的工業(yè)`化學品,可用作為染料添加劑、作為塑料工業(yè)中的原料化學品以及作為食品和調(diào)味品工業(yè)中的食品級提取劑。每年度通過石油化學手段生產(chǎn)100至120億磅的丁醇并且對這一商業(yè)化學品的需求在未來很可能增加。
[0009]用于異丁醇的化學合成的方法是已知的,例如羰基合成、一氧化碳的催化氫化(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第 6 版,2003, Wiley-VCH VerlagGmbH andC0.,ffeinheim, Germany,第5卷,716-719頁)和甲醇與正丙醇的格爾伯特縮合(Carlini 等人,J.Molec.Catal.A.Chem.220:215-220,2004)。這些方法使用了來自于石化產(chǎn)品的起始物質(zhì),一般價格昂貴,且不環(huán)保。通過植物來源的原材料進行的異丁醇生產(chǎn)將使溫室氣體排放最小化并且將是本領域中的一個進步。
[0010]異丁醇作為酵母發(fā)酵的副產(chǎn)品而進行生物生產(chǎn)。其為由于真菌對氨基酸的不完全代謝而形成的“雜醇油”的組分。異丁醇通過L-纈氨酸的分解代謝而特異性產(chǎn)生。在L-纈氨酸的氨基基團被收集作為氮源后,所得的α-酮酸通過所謂的艾利希途徑(Ehrlich pathway)的酶進行脫羧化并且還原成為異丁醇(Dickinson等人,J.Biol.Chem.273:25752-25756,1998)。
[0011]對于通過糖直接生物合成丁醇的改進方案和替代方案將改善經(jīng)濟可行性并且將是本領域中的一個進步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本文提供了用于異丁醇生產(chǎn)的重組酵母宿主細胞和方法。[0013]在一些實施例中,重組宿主細胞包含工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑,以及(a)下列中的至少一個:(i)具有酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)活性的異源多肽,其選自(I)與來源于角雙歧桿菌(Bifidobacterium angulatum)、齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii )或類厭氧棒狀菌(Anaerostipes caccae)的KARI酶或其活性片段具有至少約90%同一性的多肽,(2)與SEQID N0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63 或 65 具有至少約90%同一性或具有至少約95%同一性的多肽;或(^)編碼(a)的具有KARI活性的異源多肽的異源多核苷酸;和6)至少一個宿主細胞修飾,其增強了所述工程化異丁醇生產(chǎn)途徑的性能。在一些實施例中,(a)和(b)的組合引起異丁醇生產(chǎn)途徑性能中的協(xié)同提高。
[0014]在一些實施例中,重組宿主細胞包含異丁醇生物合成途徑,以及(a)具有酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)活性的異源多肽,其選自(i)與來源于角雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、運動發(fā)酵單胞菌、拜氏梭菌或糞厭氧棒狀菌的KARI酶或其活性片段具有至少約90%同—性的多肽,(ii)與 SEQ IDN0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、
57、59、61、63或65具有至少約90%同一性或具有至少約95%同一性的多肽;(iii)與來自形雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、鵓雞腸球菌(Enterococcus gal I inarum)、鏈球菌嗜熱菌(Streptococcus thermophiles)、運動發(fā)酵單胞菌、拜氏梭菌、糞厭氧棒狀菌或乳酸乳球菌乳脂亞種 MG1363 (Lactococcus lactis subsp.cremorisMG1363)的 KARI 酶或其活性片段具有至少約90%同一性或至少約95%同一性的多肽,其中所述多肽針對NADH具有小于約50的KM,(iv)與來自頭葡萄球菌(Staphylococcus capitis) SK14,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) M23864-W1,人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)SKl 19,金黃色葡萄球菌金黃亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus) TCHl30,沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri) L37603,表皮葡萄球菌W23144,腐生葡萄球菌腐生亞種(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus) ATCC15305,肉葡萄球菌肉亞種(Staphylococcus carnosus subsp.Carnosus) TM300,單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes) E`GD_e、格氏李斯特菌(Listeria grayi) DSM20601、酪黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus) EC30,鵓雞腸球菌EG2,溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus) JCSC5402,前庭鏈球菌(Streptococcus vestibularis)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans) UA159,格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)str,cgakkus sybstr.CHl,豬鏈球菌(Streptococcus suis) 89/1591、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種(Streptococcus infantarius subsp.1nfantarius) ATCCBAA-102、乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363,乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostoc mesenteroidessubsp mesenteroides) ATCC8293,布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri) ATCC11577、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) JCSC1435,表皮葡萄球菌 ATCC12228,肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) CGSP14,肺炎鏈球菌TIGR4,血鏈球菌(Streptococcus sanguinis) SK36,唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius) SK126,嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) LMD-9、肺炎鏈球菌CCRI1974M2,乳酸乳球菌乳酸亞種 11403,腸膜明串珠菌乳脂亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris)ATCC19254,腸膜明串珠菌乳脂亞種、短乳桿菌格雷夫斯亞種(Lactobacillus brevissubsp.gravesensis)ATCC27305或乳酸乳球菌乳酸亞種NCD02118的KARI酶或其活性片段具有至少約90%同一性或至少約95%同一性的多肽,其中所述異源多肽針對NADH具有小于約 50 的 Km, (V)與 SEQIDNO:67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133 或 135 或它
們的活性片段具有至少約90%同一性或具有至少約95%同一性的具有KARI活性的多肽,其中所述異源多肽針對NADH具有小于約50的Km ; (b)編碼具有KARI活性的異源多肽的異源多核苷酸;(c)降低或消除的醛脫氫酶活性;(d)降低或消除的醛氧化酶活性;(e)降低或消除的乙酰乳酸還原酶活性;或(丨)它們的組合。
[0015]在一個實施例中,所述重組宿主細胞包含降低或消除的醛脫氫酶表達活性和降低或消除的乙酰乳酸還原酶表達或活性。
[0016]在另一個實施例中,所述重組宿主細胞包含(i )降低或消除的醛脫氫酶表達或活性或降低或消除的乙酰乳酸還原酶表達或活性,以及(ii)編碼具有KARI活性并且針對NADH具有小于300 μ M的Km的多肽的異源多核苷酸。
[0017]在另一個實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其與SEQID Ν0:27、29、141、143、275或277具有至少約90%或至少約95%同一性。
[0018]在一些實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其在對應于SEQ ID Ν0:27的S56和S58的氨基酸處包含替換。在一些實施例中,具有KARI活性的多肽還包含對應于SEQ ID Ν0:27的Ι86、Ν87、Τ131、或Τ191的一個或多個氨基酸的替換。在一些實施例中,具有 KARI 活性的多肽對于 SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、59、61、63或65具有至少約90%同一性或至少約95%同一性。
[0019]在一些實施例中,所述重組宿主細胞在約48小時后具有至少約3、至少約4、或至少約5克/克細胞的有效異丁醇產(chǎn)率,其中所述48小時中的至少最后約24小時處于厭氧條件下。`
[0020]在一些實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其在ρΗ6.8下針對NADH具有小于約350、小于約100、小于約50、或小于約10 μ M的ΚΜ。
[0021]在一些實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其與SEQ IDΝ0:376、382、378或275具有至少約90%同一性或至少約95%同一性。
[0022]在一些實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其包含在對應于來自糞厭氧棒狀菌的KARI酶(SEQ ID Ν0:27)的氨基酸A41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或Q246的一個或多個位點上具有氨基酸替換。
[0023]在一些實施例中,所述重組宿主細胞包含具有KARI活性的異源多肽,其包含SEQID N0:33或SEQ ID NO:35或它們的活性片段。
[0024]在另一個實施例中,所述重組宿主細胞在編碼具有醛脫氫酶活性的多肽的內(nèi)源多核苷酸中包含缺失、突變和/或替換。在一些實施例中,所述具有醛脫氫酶活性的多肽催化異丁醛向異丁酸的轉(zhuǎn)化。在一些實施例中,所述具有醛脫氫酶活性的多肽對應于酶學委員會編號(EnzymeCommission Number) ECl.21.3、ECl.2.1.4 和 / 或 ECl.2.1.5。在一些實施例中,所述宿主細胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6或它們的同源物。在一些實施例中,所述宿主細胞是乳酸克魯維酵母(K.lactis)并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021或KLLA0D09999G。在一些實施例中,所述宿主細胞是樹干畢赤酵母(P.stipitis)并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是八0)2、40)3、40)4、40)5、或40)7。在一些實施例中,所述宿主細胞是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是AldH。在一些實施例中,所述宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是aldA、aldB或aldH。
[0025]在另一個實施例中,所述宿主細胞包含編碼具有醛氧化酶活性的多肽的內(nèi)源多核苷酸中的缺失、突變和/或替換。在一些實施例中,所述具有醛氧化酶活性的多肽催化異丁醛至異丁酸的轉(zhuǎn)化。在一些實施例中,所述具有醛氧化酶活性的多肽對應于酶學委員會編號ECl.2.3.1。在一些實施例中,所述具有醛氧化酶活性的多肽是AOXl和/或A0X2。
[0026]在另一個實施例中,所述宿主細胞包含編碼具有乙酰乳酸還原酶的多肽的內(nèi)源多核苷酸中的缺失、突變和/或替換。在一些實施例中,所述具有乙酰乳酸還原酶的多肽包含由選自 SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ ID NO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686,SEQ ID NO:688, SEQ ID NO:690,SEQ ID NO:692, SEQ ID NO:694, SEQ IDNO:696、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ IDNO:722、SEQ ID NO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728 和 SEQ ID NO:730 的多核苷酸所編碼的多肽。在一些實施例中,所述具有乙酰乳酸還原酶的多肽是YMR226C。
[0027]在另一個實施例中,所述重組宿主細胞是酵母宿主細胞。在一些實施例中,所述酵母選自糖酵母(Saccharomyce )、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母(Hansenula)、假絲酵母(Candida)、克魯維酵母菌(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、伊薩酵母(Issatchenkia)或畢赤酵母(Pichia)。在一些實施例中,所述宿主細胞是啤酒糖酵母。
[0028]在另一個實施例中,所述宿主細胞是細菌細胞。在一些實施例中,所述細菌細胞是梭菌(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、沙門氏菌(Salmonella)、紅球菌(Rhodococc`us)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽抱桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillus)、腸球菌(Enterococcus)、片球菌(Pediococcus)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、類芽抱桿菌(PaenibaciIIus)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌(Brevibacterium)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)、片球菌(Pediococcus)或鏈球菌(Streptococcus)的細胞。在一些實施例中,所述細菌細胞并非大腸桿菌。
[0029]在一些實施例中,所述重組宿主細胞的工程化異丁醇生產(chǎn)途徑包括下列底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化:Ca)丙酮酸至乙酰乳酸,(b)乙酰乳酸至2,3- 二羥基異戊酸,(c) 2,3- 二羥基異戊酸至2-酮異戊酸,(d) 2-酮異戊酸至異丁醛,以及(e)異丁醛至異丁醇,并且超過一種所述底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過對于所述宿主細胞異源的酶催化。在一些實施例中,編碼對于所述宿主細胞異源的酶中的至少一個異源多核苷酸通過染色體整合到該宿主細胞中。在一些實施例中,所述底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過基本上定位于細胞溶膠的酶催化。在一些實施例中,異丁醛至異丁醇的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過利用NADH作為輔因子的醇脫氫酶催化。在一些實施例中,乙酰乳酸至2,3- 二羥基異戊酸的轉(zhuǎn)化通過使用NADH作為輔因子的KARI催化。
[0030]在一些實施例中,所述宿主細胞包含質(zhì)粒pLH702或pLH701或具有相同編碼區(qū)的質(zhì)粒。在一些實施例中,所述宿主細胞包含質(zhì)粒PBP915或具有相同編碼區(qū)的質(zhì)粒。在一些實施例中,所述宿主細胞包含質(zhì)粒PYZ067 Δ kivD Δ hADH或具有相同編碼區(qū)的質(zhì)粒。
[0031]在一些實施例中,所述宿主細胞包含降低、破壞或消除的將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成2,3- 二羥基-2-甲基丁酸的能力。
[0032]在一些實施例中,所述宿主細胞是酵母并且具有降低或消除的丙酮酸脫羧酶表達或活性。在一些實施例中,所述宿主細胞具有降低或消除的PDC1、PDC5、或H)C6活性或它們的組合。
[0033]在一些實施例中,所述宿主細胞具有降低或消除的NAD-依賴型甘油-3-磷酸酯脫氫酶表達或活性。在一些實施例中,所述宿主細胞具有降低的GPD2活性。
[0034]在一些實施例中,所述宿主細胞具有降低或消除的FRA2表達或活性。
[0035]在一些實施例中,所述宿主細胞在厭氧條件下產(chǎn)生異丁醇,并且異丁醇與甘油的摩爾比大于I。
[0036]在一些實施例中,具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性的多肽以〈10_3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
[0037]在一些實施例中,所述宿主細胞以大于理論收率約25%、約50%、約75%、或約90%的收率生產(chǎn)異丁醇。
[0038]在一些實施例中,產(chǎn)生異丁醇和乙醇。
[0039]用于生產(chǎn)異丁醇的方法包括:提供如上所述的重組宿主細胞,以及在由此產(chǎn)生異丁醇的條件下,使所述宿主細胞與碳底物接觸。在一些實施例中,所述接觸的至少一部分在厭氧條件下進行。在一些實`施例中,所述接觸在提取劑存在下進行。在一些實施例中,所述接觸在足量的有機提取劑存在下進行以形成包含水相和有機相兩相體系。在一些實施例中,與使用不包含具有KARI活性的異源多肽、不包含編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脫氫酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸還原酶活性或其組合的重組宿主細胞的方法相比,異丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一個或多個是提高的。在一些實施例中,與使用不包含(i)具有KARI活性的異源多肽或編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸以及(ii)增強工程化異丁醇生產(chǎn)途徑的性能的至少一個修飾的重組宿主細胞的方法相比,異丁醇的有效速率、有效滴度或有效收率中的一個或多個是提高的。在一些實施例中,與使用不包含具有KARI活性的異源多肽、不包含編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脫氫酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸還原酶活性或它們的組合的重組宿主細胞的方法相比,DHMB生產(chǎn)、異丁酸生產(chǎn)或兩者均是降低的。在一些實施例中,與使用不包含(i)具有KARI活性的異源多肽或編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸以及(ii)增強工程化異丁醇生產(chǎn)途徑的性能的至少一種修飾的重組宿主細胞的方法相比,DHMB生產(chǎn)、異丁酸生產(chǎn)或兩者有所減低。在一些實施例中,異丁醇與甘油的摩爾比大于I。
[0040]用于生產(chǎn)異丁醇的方法還包括提供產(chǎn)生異丁醇的重組宿主細胞,以及在由此產(chǎn)生異丁醇的條件下,使所述宿主細胞與碳底物接觸,其中接觸的至少一部分在厭氧條件下進行,并且其中所產(chǎn)生的異丁醇與甘油的比率大于I。
[0041]用于生產(chǎn)異丁醇的方法還包括使重組酵母在由此產(chǎn)生丁醇的條件下生長,其包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,以及從所述培養(yǎng)物中移除DHMB。[0042]本文還提供了通過該方法產(chǎn)生的組合物。在一些實施例中,所述組合物包含異丁醇和上文提供的重組宿主細胞。在一些實施例中,所述組合物包含丁醇以及不超過約0.5mM的 DHMB。
[0043]本文還提供了發(fā)酵組合物。在一些實施例中,發(fā)酵組合物包含所述宿主細胞以及根據(jù)上文所述的方法產(chǎn)生的異丁醇。
[0044]還提供了包含i)能夠產(chǎn)生丁醇的重組酵母,ii)丁醇,和iii)不超過約0.5mMDHMB的組合物。
[0045]還提供了用于制備重組宿主細胞的方法。這類方法可包括(a)提供重組宿主細胞,其包含編碼具有醛脫氫酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修飾;以及(b)使用編碼異丁醇生物合成途徑的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述宿主細胞。
[0046]還提供了降低或消除異丁醇至異丁酸的轉(zhuǎn)化的方法。這類方法可包括(a)提供權利要求1-52中任一項的重組宿主細胞;以及(b)對所述宿主細胞施以條件,其中與使用并不包含降低或消除的醛脫氫酶和/或醛氧化酶活性的重組宿主細胞的方法相比,異丁醛至異丁酸的轉(zhuǎn)化是降低或消除的。
[0047]還提供了某些多肽。在一些實施例中,所述多肽與SEQ ID NO:29、31、33、35、37、
39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、624、626、628、630、632 或它們的活性片段包含至少約90%同一性,或至少約95%同一性`,或至少約99%同一性,并且具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性。在一些實施例中,所述多肽與SEQ ID N0:417、419、421、423、425或427包含至少約90%同一性或至少約95%同一性或至少約99%同一性,并且具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性。在一些實施例中,多肽包含與 SEQ ID N0:927、928、196、266、267、389、405、637、781、782、783、835、853、854、855、856、857或859具有至少約90%同一性、至少約95%同一性或至少約99%同一性的序列。
[0048]還提供了編碼這類多肽的多核苷酸和包含這類多核苷酸和多肽的宿主細胞。
[0049]還提供了將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成2,3-二羥基異戊酸的方法。例如,這類方法可包含(a)提供上文描述的多肽,以及(b)在由此產(chǎn)生2,3-二羥基異戊酸的條件下,使所述多肽與乙酰乳酸接觸。
[0050]還提供了重組酵母細胞。在一些實施例中,重組酵母細胞包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,并且所述酵母產(chǎn)生小于0.01摩爾2,3- 二羥基-2-甲基丁酸(DHMB)/摩爾消耗的糖。在一些實施例中,重組酵母包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,并且所述酵母以小于約1.0mM/小時的速率產(chǎn)生DHMB。在一些實施例中,重組酵母包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,并且所述酵母產(chǎn)生2,3- 二羥基-3-異戊酸(DHIV)的量是所述產(chǎn)生DHMB的量的至少約1.5倍。
[0051]還提供了鑒定參與DHMB產(chǎn)生的基因的方法。在一些實施例中,所述方法包括(i)提供包含至少兩個或更多個基因缺失的酵母菌株的集合;(ii)測量單個酵母菌株產(chǎn)生的DHMB的量;(iii)選擇產(chǎn)生不超過約1.0mMDHMB/小時的酵母菌株;以及(iv)在所選擇的酵母菌株中鑒定缺失的基因。在一些實施例中,所述方法包括(i)提供過表達至少兩個或更多個基因的酵母菌株的集合;(ii)測量單個酵母菌株產(chǎn)生的DHMB的量;(iii)選擇產(chǎn)生至少約1.0mMDHMB/小時的酵母菌株;以及(iv)在所選擇的酵母菌株中鑒定過表達的基因。
[0052]還提供了用于異丁醇生產(chǎn)的方法。在一些實施例中,所述方法包括(a)使重組酵母在由此產(chǎn)生丁醇的條件下生長,其包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑;以及b)測量DHIV和/或DHMB濃度。在一些實施例中,所述生長和測量可同步進行或以任何順序先后進行。在一些實施例中,所述測量包括液相色譜-質(zhì)譜法。
[0053]還提供了提高酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)活性的方法。在一些實施例中,所述方法包括(a)提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸還原酶的組合物,以及(b)降低DHMB水平。在一些實施例中,降低DHMB水平是通過降低乙酰乳酸還原酶的活性而實現(xiàn)的。在一些實施例中,降低DHMB水平是通過從所述組合物中移除DHMB而實現(xiàn)的。
[0054]在一些實施例中,提高宿主細胞中KARI酶產(chǎn)率可包括培養(yǎng)宿主細胞,其中所述宿主細胞包含異源KARI酶和降低、破壞或消除乙酰乳酸還原酶表達或活性的至少一個遺傳修飾,并且其中在DHMB存在下,所述KARI酶活性是降低的。在一些實施例中,所述KARI與大腸桿菌或乳酸乳球菌的KARI具有至少約90%、至少約95%或至少約99%同一性。在一些實施例中,所述降低、破壞或消除的乙酰乳酸還原酶表達或活性實質(zhì)上降低DHMB的存在。
[0055]還提供了提高二羥酸脫水酶(DHAD)活性的方法。在一些實施例中,所述方法包括Ca)提供包含二羥基異戊酸(DHIV)和DHAD酶的組合物,以及(b)降低DHMB水平。
[0056]附圖1兌明和以引用的方式并入的隨本文進行電子提交的表格
[0057]通過下面的【具體實施方式】、附圖和隨附的序列描述可以更全面地理解本發(fā)明,這些【具體實施方式】、附圖和序列 描述形成本專利申請的一部分。
[0058]圖1示出了四種不同的異丁醇生物合成途徑。標記有“&”、“13”、“?!?、“(1”、“6”、“廣’、“g”、“h”、“ i ”、“ j ”和“k”的步驟代表下述的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
[0059]圖2描述了來自熒光假單胞菌(“PF5”;SEQ ID NO: 5)的KARI與來自糞厭氧棒狀菌(“K9”;SEQ ID NO:27)的KARI的氨基酸序列比對。粗體的位點被靶定用于如本文所述的誘變。
[0060]圖3A、3B和3C描述了來自角雙歧桿菌DSM20098 (“K1”;SEQ ID N0:141)、齒雙歧桿菌 ATCC27678 (“K2” ;SEQ ID NO: 143)、拜氏梭菌 NCMB8052 (“K7”;SEQ ID NO: 275)、糞厭氧棒狀菌 DSM14662 (“K9” ;SEQ ID NO: 27)、鶉雞腸球菌 EG2 (“K25”SEQ ID NO: 376)、嗜熱鏈球菌LMD-9 (“K26”SEQ ID NO: 121 )、乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363 (“K29” ;SEQ IDN0:382)、運動發(fā)酵單胞菌(“S2” ;SEQ ID NO:277)和乳酸乳球菌(“LTS” ;SEQ ID N0:380)。粗體的位點被靶定用于如本文所述的誘變。
[0061]圖4 是 pLH556 (pHR81-PIlv5_Pf5.KARI)載體(SEQ ID NO: 138)的質(zhì)粒圖譜。
[0062]圖5示出了兩種菌株PNY1910和PNY2242的異丁醇生產(chǎn)的特異速率Qp。
[0063]圖6示出了發(fā)酵時程期間PNY1910 (三角形)和PNY2242 (菱形)的培養(yǎng)物上清中的DHIV+DHMB積累。(所使用的HPLC方法未區(qū)分DHMB和DHIV。)
[0064]圖7示出了甘油、丙酮酸、2,3-丁二醇化00)、0!11¥/1)麗8、α -酮異戊酸(aKIV)和異丁酸(iBuAc)的收率。DHIV和DHMB —同示出,因為所使用的HPLC方法未對其進行區(qū)分。
[0065]圖8示出了 K9G9變體的Vmax/KM值的概述,如實例16中所述。
[0066]圖9A、B和C示出了 K9變體的異丁醇與甘油的摩爾收率比,異丁醇的摩爾收率和異丁醇滴度,如實例19中所述。
[0067]圖10示出了異丁醇生物合成途徑。步驟“a”為丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化。步驟“b”為乙酰乳酸至DHIV的轉(zhuǎn)化。步驟“c”為DHIV至KIV的轉(zhuǎn)化。步驟“d”為KIV至異丁醛的轉(zhuǎn)化。步驟“e”為異丁醛至異丁醇的轉(zhuǎn)化。步驟“f”為乙酰乳酸至DHMB的轉(zhuǎn)化。
[0068]圖11示出了來自子囊菌酵母菌種的YMR226C同源物的系統(tǒng)發(fā)生樹。將一個絲狀真菌(粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))序列包括在內(nèi)以作為外類群(outgroup)。
[0069]圖12示出了與YMR226C具有同源性的ORF的核苷酸序列的多序列比對(MSF格式)。示出的基因名對應于表7中給出的登錄號和序列號。所述比對通過AlignX(VectorNTI)產(chǎn)生。
[0070]圖13示出了 DHMB隨時間的摩爾收率圖。
[0071]圖14描述了酵母菌株NYLA84中的異丁醇和異丁酸產(chǎn)量。
[0072]表Z-是經(jīng)實驗驗證的KARI酶的序型HMM表(隨本文進行電子提交并且以引用的方式并入),所述KARI酶在表1中列出并且如美國申請公開2010/0197519和2009/0163376中所描述,其全文以引用的方式并入本文。
[0073]表1:經(jīng)實駘駘證的KARI酶。
`[0074]
【權利要求】
1.重組宿主細胞,包含工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑以及 a.下列中的至少一個: 1.具有酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)活性的異源多肽,其選自: 1.與來源于角雙歧桿菌(Bifidobacterium angulatum)、齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)或幾厭氧棒狀菌(Anaerostipes caccae)的 KARI 酶或其活性片段具有至少約90%同一性的多肽;
2.與SEQID N0:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、或65具有至少約90%同一性或至少約95%同一性的多肽;或 ?.編碼a)的具有KARI活性的異源多肽的異源多核苷酸;和 b.至少一個宿主細胞修飾,其增強所述工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑的性能。 2.根據(jù)權利要求1所述的重組宿主細胞,其中a)和b)的組合引起異丁醇生產(chǎn)途徑性能中的協(xié)同提高。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞修飾包括降低或消除的醛脫氫酶表達或活性和降低或消除的乙酰乳酸還原酶表達或活性。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組宿主細胞,包含降低或消除的醛脫氫酶表達或活性和降低或消除的乙酰乳 酸還原酶表達或活性,并且其中所述具有KARI活性的異源多肽針對NADH具有小于300 μ M的ΚΜ。
5.根據(jù)權利要求1所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的異源多肽與SEQIDΝ0:27、29、141、143、275、或277具有至少約90%或至少約95%同一性。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的異源多肽包含對應于SEQ ID NO:27的S56和S58的氨基酸中的替換。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的異源多肽還包含對應于SEQ ID勵:27的186、呢7、1'131、或1'191的一個或多個氨基酸的替換。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞在約48小時后具有至少約3、至少約4、或至少約5克/克細胞的有效異丁醇產(chǎn)率,其中所述48小時中的至少最后約24小時處于厭氧條件下。
9.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的異源多肽在ρΗ6.8下針對NADH具有小于約350、小于約100、小于約50、或小于約10 μ M的ΚΜ。
10.根據(jù)權利要求1所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的異源多肽包含對應于 SEQ ID Ν0:27 的氨基酸 Α41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或 Q246 的一個或多個位置處的氨基酸替換。
11.根據(jù)權利要求ι-?ο中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞修飾包括編碼具有醛脫氫酶活性的多肽的內(nèi)源多核苷酸中缺失、突變、或替換中的至少一個。
12.根據(jù)權利要求11所述的重組宿主細胞,其中所述具有醛脫氫酶活性的多肽對應于酶學委員會編號ECl.21.3、ECl.2.1.4、ECl.2.1.5、或它們的組合。
13.根據(jù)權利要求11-12中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae),并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它們的同源物。
14.根據(jù)權利要求11-12中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是乳酸克魯維酵母(K.1actis),并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、或 KLLA0D09999G。
15.根據(jù)權利要求11-12中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是樹干畢赤酵母(P.stipitis),并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD7。
16.根據(jù)權利要求11-12中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),并且所述具有醒脫氫酶活性的多肽是AldH。
17.根據(jù)權利要求11-12中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是大腸桿菌(E.coli),并且所述具有醛脫氫酶活性的多肽是aldA、aldB、或aldH。
18.根據(jù)權利要求1-17中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞包含編碼具有醛氧化酶活性的多肽的內(nèi)源多核苷酸中缺失、突變、或替換中的至少一個或多個。
19.根據(jù)權利要求18所述的重組宿主細胞,其中所述具有醛氧化酶活性的多肽對應于酶學委員會編號ECl.2.3.1。
20.根據(jù)權利要求19所述的重組宿主細胞,其中所述具有醛氧化酶活性的多肽是A0X1、A0X2、或它們的組合。
21.根據(jù)權利要求1-20中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞包含編碼具有乙酰乳酸還原酶活性的多肽的內(nèi)源多核苷酸中至少一個或多個缺失、突變、或替換。
22.根據(jù)權利要求21所述的重組宿主細胞,其中所述內(nèi)源多核苷酸選自:SEQIDNO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ ID NO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:688, SEQ ID NO:690,` SEQ ID NO:692, SEQ ID NO:694, SEQ ID NO:696, SEQ IDNO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ ID NO:722、SEQ IDNO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728 和 SEQ ID NO:730。
23.根據(jù)權利要求21所述的重組宿主細胞,其中所述具有乙酰乳酸還原酶活性的多肽是 YMR226C。
24.根據(jù)權利要求21-23中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是酵母宿主細胞。
25.根據(jù)權利要求24所述的重組宿主細胞,其中所述酵母是糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母(Hansenula)、假絲酵母(Candida)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、伊薩酵母(Issatchenkia)、或畢赤酵母(Pichia)0
26.根據(jù)權利要求1或25所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是啤酒糖酵母。
27.根據(jù)權利要求1-26中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑包括下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化: a.丙酮酸至乙酰乳酸; b.乙酰乳酸至2,3-二羥基異戊酸; c.2,3- 二羥基異戊酸至2-酮異戊酸; d.2-酮異戊酸至異丁醛;以及e.異丁醛至異丁醇, 其中每個底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過由所述宿主細胞重組表達的酶催化。
28.根據(jù)權利要求27所述的重組宿主細胞,其中所有底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過對于所述宿主細胞異源的酶催化。
29.根據(jù)權利要求28所述的重組宿主細胞,其中至少一個異源多核苷酸經(jīng)染色體整合到所述宿主細胞中,所述異源多核苷酸編碼對于所述宿主細胞異源的酶中的至少一個。
30.根據(jù)權利要求27-29中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過基本上定位于細胞溶膠的酶催化。
31.根據(jù)權利要求27-30中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述異丁醛至異丁醇的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過利用NADH作為輔因子的醇脫氫酶催化。
32.根據(jù)權利要求1-31中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞還包含降低、破壞或消除的將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成2,3- 二羥基-2-甲基丁酸的能力。
33.根據(jù)權利要求1-32中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞是酵母,并且具有降低、破壞或消除的丙酮酸脫羧酶表達或活性。
34.根據(jù)權利要求33所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞具有降低、破壞或消除的H)C1、PDC5、或PDC6活性、或它們的組合。
35.根據(jù)權利要求1-34中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞具有降低或消除的NAD-依賴型甘油-3-磷酸脫氫酶表達或活性?!?br> 36.根據(jù)權利要求35所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞具有降低的GPD2表達或活性。
37.根據(jù)權利要求1-36中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞具有降低或消除的FRA2表達或活性。
38.根據(jù)權利要求1-37中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞在厭氧條件下產(chǎn)生異丁醇,并且其中異丁醇與甘油的摩爾比大于I。
39.根據(jù)權利要求1-38中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述具有KARI活性的多肽以〈10-3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
40.根據(jù)權利要求1-39中任一項所述的重組宿主細胞,其中所述宿主細胞以大于理論收率約25%、約50%、約75%、或約90%的收率生產(chǎn)異丁醇。
41.根據(jù)權利要求1-40中任一項所述的重組宿主細胞,其中產(chǎn)生異丁醇,并且其中也產(chǎn)生乙醇。
42.生產(chǎn)異丁醇的方法,包括: a.提供權利要求1-41中任一項的重組宿主細胞,以及 b.在由此產(chǎn)生異丁醇的條件下,使a)的宿主細胞與碳底物接觸。
43.根據(jù)權利要求42所述的方法,其中所述接觸的至少一部分在厭氧條件下進行。
44.根據(jù)權利要求42或43所述的方法,其中所述接觸在提取劑存在下進行。
45.根據(jù)權利要求44所述的方法,其中所述接觸在足量的有機提取劑存在下進行以形成包含水相和有機相的兩相體系。
46.根據(jù)權利要求42-45中任一項所述的方法,其中與并不包含(i)具有KARI活性的異源多肽或編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸中的至少一個和(ii)增強所述工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑性能的至少一個修飾的重組宿主細胞相比,異丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一個或多個是提高的。
47.根據(jù)權利要求42-46中任一項所述的方法,其中與并不包含(i)具有KARI活性的異源多肽或編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸中的至少一個和(ii)增強所述工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑性能的至少一個修飾的重組宿主細胞相比,DHMB產(chǎn)量、異丁酸產(chǎn)量、或兩者均是降低的。
48.根據(jù)權利要求42-47中任一項所述的方法,其中所述異丁醇與甘油的摩爾比大于1
49.發(fā)酵組合物,包含所述宿主細胞和根據(jù)權利要求42-28中任一項所述的方法產(chǎn)生的異丁醇。
50.生產(chǎn)異丁醇的方法,包括: a.提供產(chǎn)生異丁醇的重組宿主細胞; b.在由此產(chǎn)生異丁醇的條件下,使a)的宿主細胞與碳底物接觸; 其中所述接觸的至少一部分在厭氧條件下進行;并且 其中所述產(chǎn)生的異丁醇與甘油的比率大于I。
51.生產(chǎn)丁醇的方法,包括: a.使重組酵母在由此產(chǎn)生丁醇的條件下生長,所述重組酵母包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑;以及 b.從所述培養(yǎng)物中移除DHMB。
52.組合物,其通過權利要求51的方法產(chǎn)生,其中所述組合物包含丁醇和不超過約0.5mM 的 DHMB。
53.組合物,包含i)能夠產(chǎn)生丁醇的重組酵母,ii)丁醇,和iii)不超過約0.5mM的DHMB0
54.制備重組宿主細胞的方法,包括: a.提供重組宿主細胞,`其包含編碼具有醛脫氫酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修飾;以及 b.用編碼異丁醇生物合成途徑的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述宿主細胞。
55.降低或消除異丁醛至異丁酸的轉(zhuǎn)化的方法,包括: a.提供權利要求1-41中任一項的重組宿主細胞;以及 b.對所述宿主細胞施以條件,其中與并不包含降低或消除的醛脫氫酶和/或醛氧化酶活性的重組宿主細胞相比,所述異丁醛至異丁酸的轉(zhuǎn)化是降低或消除的。
56.組合物,包含異丁醇和權利要求1-41中任一項的重組宿主細胞。
57.多肽,所述多肽與SEQ ID N0:29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、`59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、`441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、`460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、`479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、`498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、`517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、.536、537、624、626、628、630、632、或它們的活性片段包含至少約90%同一性或至少約95%同一性或至少約99%同一性,其中所述多肽具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性。
58.多肽,所述多肽與SEQID NO:417、419、421、423、425、或427、或它們的活性片段包含至少約90%同一性或至少約95%同一性或至少約99%同一性,其中所述多肽具有酮醇酸還原異構(gòu)酶活性。
59.多核苷酸,其編碼權利要求57或58的多肽。
60.將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成2,3-二羥基異戊酸的方法,包括: a.提供權利要求57或58的多肽; b.在由此產(chǎn)生2,3-二羥基異戊酸的條件下,使a)的多肽與乙酰乳酸接觸。
61.重組宿主細胞,包含權利要求57、權利要求58的異源多肽或權利要求59的多核苷酸。
62.重組酵母,包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,其中所述酵母產(chǎn)生小于0.01摩爾2,3- 二羥基-2-甲基丁酸(DHMB) /摩爾消耗的糖。
63.重組酵母,包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,其中所述酵母以小于約1.0mM/小時的速 率產(chǎn)生DHMB。
64.重組酵母,包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑,其中所述酵母產(chǎn)生.2,3- 二羥基-3-異戊酸(DHIV)的量是所述產(chǎn)生DHMB的量的至少約1.5倍。
65.生產(chǎn)丁醇的方法,包括: a)使重組酵母在由此產(chǎn)生丁醇的條件下生長,所述重組酵母包含能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化成乙酰乳酸的生物合成途徑;以及 b)測量DHIV和/或DHMB的濃度; 其中步驟a)和b)可同時進行或以任何順序先后進行。
66.根據(jù)權利要求65所述的方法,其中所述測量包括液相色譜-質(zhì)譜法。
67.提高酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)活性的方法,包括:a)提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸還原酶的組合物,以及b)降低DHMB水平。
68.根據(jù)權利要求67所述的方法,其中所述降低DHMB水平是通過降低乙酰乳酸還原酶的酶活性而實現(xiàn)的。
69.根據(jù)權利要求67所述的方法,其中所述降低DHMB水平是通過從所述組合物中移除DHMB而實現(xiàn)的。
70.提高二羥酸脫水酶(DHAD)活性的方法,包括:a)提供包含二羥基異戊酸(DHIV)和DHAD酶的組合物,以及b)降低DHMB水平。
71.提高宿主細胞中KARI酶產(chǎn)率的方法,其中所述宿主細胞包含工程化的異丁醇生產(chǎn)途徑,所述途徑包含異源KARI酶和降低、破壞或消除乙酰乳酸還原酶表達或活性的至少一個遺傳修飾,并且其中在DHMB存在下,所述KARI酶活性是降低的。
72.根據(jù)權利要求71所述的方法,其中所述KARI與大腸桿菌或乳酸乳球菌(L.1actis)的KARI具有至少約90%、至少約95%或至少約99%同一性。
73.根據(jù)權利要求71或72所述的方法,其中所述降低、破壞或消除的乙酰乳酸還原酶表達或活性實質(zhì)上降低所述DHMB的存在。
74.根據(jù)權利要求1所述的重組宿主細胞,包含編碼具有KARI活性的多肽的異源多核苷酸,所述多肽包含SEQ ID N0:33、或35、或它 們的活性片段。
【文檔編號】C12N15/61GK103827304SQ201280024903
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年3月23日 優(yōu)先權日:2011年3月24日
【發(fā)明者】L.C.安東尼, K.J.吉布森, H.何, L.L.黃, D.P.奧基弗, A.L.克魯科伯格, Y.李, L.A.馬格基奧-哈爾, J.麥塞瓦恩, M.J.內(nèi)爾森, R.帕特奈克, S.C.羅斯曼 申請人:布特馬斯先進生物燃料有限責任公司
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