專利名稱：：單純皰疹病毒和重組病毒及宿主細(xì)胞及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種病毒、以該病毒作為載體的重組病毒、包括所述病毒和/或所述重組病毒的宿主細(xì)胞，以及包括所述病毒和/或所述重組病毒的藥物組合物。具體地說，本發(fā)明是關(guān)于一種單純皰疹病毒、以該病毒作為載體的重組病毒、包括所述病毒和/或所述重組病毒的宿主細(xì)胞，以及包括所述病毒和/或所述重組病毒的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)呈球形，完整病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)和囊膜組成。病毒核心含有雙鏈DNA，纏繞成纖絲巻軸。衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右，由162個(gè)殼微粒組成。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜。包括囊膜的病毒直徑為150-200納米。囊膜表面含有病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)。單純皰疹病毒包括I型單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI，HSV-1)以及II型單純皰疹病毒。該病毒對宿主細(xì)胞的感染能力與單純皰疹病毒囊膜糖蛋白的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，即囊膜糖蛋白的立體結(jié)構(gòu)決定了病毒能否進(jìn)入宿主細(xì)胞，以及能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞的病毒滴度。由于單純皰疹病毒能以人類細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，并且能夠感染的人類細(xì)胞類型廣、發(fā)生意外增殖可以用抗皰疹藥物阻止、裂解期和潛伏期都不整合宿主細(xì)胞基因組插入突變危險(xiǎn)小，因此，單純皰疹病毒已經(jīng)用于腫瘤或神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的基因治療。例如，I型單純皰疹病毒F株HSV1716用于腦膠質(zhì)瘤的治療(參見"HSV1716injectionintothebrainadjacenttotumourfollowingsurgicalresectionofhigh-gradeglioma:safetydataandlong-termsurvival",S.Harrow等人，GeneTherapy,11,1648-1658,2004);I型單純皰疹病毒17+株感染腫瘤細(xì)胞，通過該病毒的裂解性復(fù)制溶解腫瘤細(xì)胞而治療癌癥。然而，感染不同人種的I型單純皰疹病毒基因組具有明顯不同的限制性內(nèi)切酶分解模式，即存在限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)(參見"Quantitativeanalysisofgenomicpolymorphismofherpessimplexvirustype1strainsfromsixcountries:studiesofmolecularevolutionandmolecularepidemiologyofthevirus",H.Sakaoka等人，JournalofGeneralVirology,Vol75，513-527,1994)，單純皰疹病毒17+株從白色人種中分離，因此，感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株用于對黃色人種進(jìn)行基因治療時(shí)，存在病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒用于黃色人種基因治療時(shí)病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)，提供一種單純皰疹病毒，該病毒用于黃色人種基因治療時(shí)，病毒感染率高、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度快。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供以上述病毒作為載體的重組病毒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包括上述病毒和/或上述重組病毒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種包括上述病毒和/或上述重組病毒的藥物組合物。本發(fā)明的發(fā)明人針對感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株用于對黃色人種進(jìn)行基因治療時(shí)，存在病毒感染率低、在宿主細(xì)胞中復(fù)制增殖速度慢的缺點(diǎn)，從成年中國人口角皰疹中分離出單純皰疹病毒(分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學(xué)名為//^t^^'wptec/，于2006年6月14曰保藏至位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736)，并對該病毒進(jìn)行了基因組全序列測定和分析，確定了該臨床分離株與I型單純皰疹病毒17+株在編碼囊膜蛋白的基因方面存在的差異。本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO,5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:N0.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白為本發(fā)明所述的囊膜蛋白。本發(fā)明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其中，所述作為載體的病毒為本發(fā)明所述的單純皰疹病毒。本發(fā)明還提供了一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為上述的病毒和/或上述的重組病毒。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括上述的病毒和/或上述的重組病毒。本發(fā)明提供了一種分離自黃色人種的單純皰疹病毒，該病毒對于黃色人種宿主細(xì)胞的特異性侵染率高，復(fù)制速度快，因此可以直接用于侵染并溶解黃色人種的腫瘤細(xì)胞，也可以作為載體攜帶基因藥物至黃色人種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因治療。此外與現(xiàn)有的I型單純皰疹病毒17+株相比，本發(fā)明病毒用于其他人種多發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)，對腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。本發(fā)明涉及的單純皰疹病毒的分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學(xué)名為/^^M^wp/exWn^^pe/，于2006年6月14日保藏至位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736。圖1為本發(fā)明病毒的電子顯微鏡照片(放大52000倍)；圖2為正常人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7培養(yǎng)96小時(shí)的生長情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)；圖3為培養(yǎng)MCF—7細(xì)胞48小時(shí)后，按病毒活性顆粒/細(xì)胞數(shù)的比值(MOI)為0.1轉(zhuǎn)染本發(fā)明病毒后再培養(yǎng)48小時(shí)的生長情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)；圖4為本發(fā)明病毒對人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的藥效照片；圖5為本發(fā)明病毒對結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:N0.7所示的氨基酸序列、SEQID:N0.9所示的氨基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:N0.7或SEQID:N0.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列中的一種或幾種。所述囊膜蛋白一般為糖蛋白，與病毒侵入宿主細(xì)胞有關(guān)，例如病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)和病毒糖蛋白D(gD)都與吸附/穿入宿主細(xì)胞有關(guān)，它們還都可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞融合，并都有誘生宿主細(xì)胞中和抗體的作用；病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)都能誘生細(xì)胞毒作用。由于本發(fā)明的單純皰疹病毒囊膜蛋白，例如SEQID:NO.l所示的病毒糖蛋白B、SEQID:NO.3所示的病毒糖蛋白C、SEQID:NO.5所示的病毒糖蛋白D、SEQID:N0.7所示的病毒糖蛋白G和SEQID:NO.9所示的病毒糖蛋白M中的一種或幾種，與野生型單純皰疹病毒17+相比發(fā)生了變異，囊膜蛋白的立體結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞的相應(yīng)耙標(biāo)(例如細(xì)胞表面受體)更吻合，因此能進(jìn)入宿主細(xì)胞尤其是黃色人種宿主細(xì)胞的病毒更多，因而使病毒感染率明顯提咼。組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負(fù)電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見"生物化學(xué)"(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結(jié)構(gòu)的作用)沒有改變，因此對蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)并不會產(chǎn)生影響，因此仍然可以實(shí)現(xiàn)蛋白的功能。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr禾BPhe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp禾口Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白的立體結(jié)構(gòu)和功能。所述同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在上述囊膜蛋白的任意一個(gè)氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發(fā)生取代，會使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能出現(xiàn)差異。例如與單純皰疹病毒17+比較，本發(fā)明單純皰疹病毒的囊膜糖蛋白的堿基發(fā)生了不同類別的取代(如單純皰疹病毒17+病毒糖蛋白B的第79位氨基酸殘基為賴氨酸，而本發(fā)明單純皰疹病毒的病毒糖蛋白B的第79位氨基酸殘基為蘇氨酸)，結(jié)果本發(fā)明的單純皰疹病毒更易感染黃色人種。對所述SEQID:NO.l所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.l中第79位為絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸或甘氨酸的氨基酸序列。對所述SEQID:NO.3所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列可以為SEQID:NO.3中第201位為谷氨酸的氨基酸序列和/或SEQID:NO.3中第295位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列。對所述SEQID:N0.5所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列可以為SEQID:N0.5中第369位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列。對所述SEQID:N0.7所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列可以選自SEQID:N0.7中第3位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第86位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第116位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第118位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第130位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.7中第151位為甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO,7中第153位為天冬氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第162位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第164位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.7中第208位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和第236位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列可以為SEQID:N0.9中第440位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列和/或SEQID:NO.9中第446位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列。本發(fā)明所述氨基酸序列優(yōu)選選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:NO.5所示的氨基酸序列、SEQID:N0.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO.9所示的氨基酸序列中的一種或幾種。更優(yōu)選所述氨基酸序列為SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:NO,3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:NO.9所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種單純皰疹病毒，所述病毒具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白為本發(fā)明所述的囊膜蛋白。本領(lǐng)域公知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Tip(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個(gè)密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡并性，決定一個(gè)氨基酸的密碼子大多不止一個(gè)，三聯(lián)體密碼子中第三個(gè)核苷酸的置換，往往不會改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的核苷酸序列可以不同。本領(lǐng)域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列，完全可以推導(dǎo)出能夠編碼它們的核苷酸序列，通過生物學(xué)方法(如PCR方法、突變方法)或化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，應(yīng)用到重組技術(shù)以及基因治療當(dāng)中，因此該部分核苷酸序列都應(yīng)該包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領(lǐng)域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進(jìn)行，通過修改本發(fā)明提供的核酸序列，得到與本發(fā)明所述囊膜蛋白功能一致的氨基酸序列。優(yōu)選所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:N0.6、SEQID:NO,8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:N0.2所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.2中第144位為胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第183位為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第186位為A、G或T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第210位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第219位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第237位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第865位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第867位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1161位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1410位為T、G或C的核苷酸序歹U、SEQID:NO.2中第1513位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1515位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2095位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2097位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2196位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2530位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2532位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.2中第2562位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.4所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.4中第120位為G、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.4中第177位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.4中第267位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.4中第597位為T的核苷酸序列、SEQID:N0.4中第865位為A的核苷酸序列、SEQID:N0.4中第867位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1059位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1149位為T、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.4中第1368位為T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.6所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.6中第75位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第90位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第822位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第870位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第948位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第963位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1095位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1099位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1101位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.6中第1105位為A的核苷酸序列和SEQID:NO.6中第1107位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.8所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.8中第9位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第108位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第228位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第258位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第261位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第270位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第327位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第336位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第345位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第348位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第351位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第354位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第390位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第396位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第430位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第432位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第453位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第459位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第472位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第474位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第486位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第492位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第501位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第624位為A、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.8中第708位為A、T或G的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.10中第27位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第136位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第138位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第315位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第489位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第609位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第618位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第643位為A的核苷酸序歹U、SEQID:NO.IO中第645位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第728位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第762位為T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第784位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第786位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第954位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第966位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第1320位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第1338位為T的核苷酸序列和SEQID:NO.IO中第1344位為A的核苷酸序列中的一種或幾種。單純皰疹病毒的立即早期基因(immediateearlyphase,IE)指病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞就立即利用宿主細(xì)胞表達(dá)(一般在1小時(shí)內(nèi))的基因，由于單純皰疹病毒對宿主細(xì)胞的感染能力還與該病毒的立即早期基因編碼的感染細(xì)胞多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)豐度有關(guān)，即編碼感染細(xì)胞多肽的立即早期基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的豐度越高，則病毒在宿主細(xì)胞中的增殖速度越快。因此更優(yōu)選所述病毒還包括一種具有促進(jìn)病毒增殖功能的氨基酸序列，即一種立即早期基因編碼的感染細(xì)胞多肽表達(dá)豐度更高的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.ll所示的氨基酸序列、SEQID:N0.13所示的氨基酸序列，以及對所述SEQID:NO.ll或SEQID:N0.13所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的促進(jìn)病毒增殖功能不變的氨基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.ll進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒增殖功能不變的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.ll中第34位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第102位為絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第281位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.ll中第351位為精氨酸或組氨酸的氨基酸序列和SEQID:NO.ll中第360位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.13進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代而得到的促進(jìn)病毒增殖功能不變的氨基酸序列可以選自SEQID:NO.13中第36位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.13中第178位為賴氨酸或精氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第179位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.13中第180位為賴氨酸或組氨酸的氨基酸序列，SEQID:N0.3中第181位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第206位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列，SEQID:NO.13中第383位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的氨基酸序列中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述病毒還包括一種具有促進(jìn)病毒增殖功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列為SEQID:NO.ll所示的氨基酸序列禾卩/或SEQID:NO.13所示的氨基酸序列。所述編碼囊膜蛋白的基因中，所述囊膜蛋白更優(yōu)選選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:N0.7所示的氨基酸序列和SEQID:N0.9所示的氨基酸序列的囊膜蛋白中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。更進(jìn)一步優(yōu)選所述核苷酸序列為SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.S所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列。更優(yōu)選所述病毒還包括一種編碼具有促進(jìn)病毒增殖功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.12所示的核苷酸序列、SEQID:N0.14所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:NO,12或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:N0.12所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.12中第102位為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鳥嘌呤(G)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第306位為A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第570位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第612位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第652位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第654位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第729位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第843位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第1053位為G的核苷酸序列和SEQID:NO.12中第1080位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.14中第108位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第465位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第519位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第534位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第535位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第537位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第540位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO,14中第588位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第618位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.14中第1149位為A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選所述病毒還包括一種編碼具有促進(jìn)病毒增殖功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列為SEQID:NO.12所示的核苷酸序列和/或SEQID:N0.14所示的核苷酸序列。最優(yōu)選所述病毒的核苷酸序列與NCBI中ID:NC—001806的I型單純皰疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5%的同源性，二者的差別如表l所示。表1中的"變異位置"為ID:NC_001806的I型單純皰疹病毒17+的全序列核苷酸的堿基編號。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>續(xù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>是本領(lǐng)域慣用的催化劑及操作條件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述加氫精制反應(yīng)區(qū)ii或加氫精制反應(yīng)區(qū)in中所采用的加氫精制催化劑舍有栽體和負(fù)栽在該栽體上的至少一種選自第vni族的鎳、鉑和/或鈀金屬組分。所述載體可選自氧化鋁、氧化硅、氧化鈦、氧化鎂、氧化硅-氧化鋁、氧化鋁-氧化鎂、氧化硅-氧化鎂、氧化硅-氧化鋯、氧化硅-氧化釷、氧化硅-氧化鈹、氧化硅-氧化鈦、氧化硅-氧化鋯、氧化鈦-氧化鋯、氧化硅-氧化鋁-氧化釷、氧化硅-氧化鋁-氧化鈦、氧化硅-氧化鋁-氧化鎂、氧化硅-氧化鋁-氧化鋯、天然沸石、粘土中的一種或幾種。以金屬計(jì)并以催化劑為基準(zhǔn)，所述第vni族金屬的含量優(yōu)選為0.1-10重量％,更為優(yōu)選為0.1-5重量％。例如，CN1510112A公開一種金屬型加氫催化劑，CN1171429A公開一種芳烴加氫催化劑，CN1245204公開一種雙金屬加氫催化劑等，都具有很好的加氫精制性能，均可作為加氫精制反應(yīng)區(qū)n中所采用的加氬精制催化劑用于本發(fā)明。尤其是CN1510112A公開的一種金屬型加氫催化劑在用于本發(fā)明時(shí)，具有更好的加氫精制性能，因此特別適合用于本發(fā)明。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述加氫精制反應(yīng)區(qū)II或加氫精制反應(yīng)區(qū)III的反應(yīng)條件為氫分壓1-20MPa，進(jìn)一步優(yōu)選4-18MPa,反應(yīng)溫度為150-380。C,進(jìn)一步優(yōu)選180-35(TC，體積空速0.3-3h—'，進(jìn)一步優(yōu)選0.5-1.5h一1，氬油比為100-3000(v/v),進(jìn)一步優(yōu)選200-1000(v/v)。所述用于加氬精制反應(yīng)區(qū)II或加氫精制反應(yīng)區(qū)III的加氫精制催化劑在使用之前，優(yōu)選在氫氣存在下于150-50(TC下還原，將其轉(zhuǎn)化為還原態(tài)。這種還原方法為常規(guī)方法，還原可在反應(yīng)器外進(jìn)行，也可在反應(yīng)器內(nèi)原位進(jìn)行。按照本發(fā)明提供的方法，所述蒸餾區(qū)I、蒸餾區(qū)II的蒸餾方法為本領(lǐng)域所公知，通常視需要可包括一個(gè)或多個(gè)閃蒸、常壓蒸餾和減壓蒸餾的操作單元，以完成所希望的分離。采用本發(fā)明提供方法加工費(fèi)托合成蠟，可以獲得具有較高附加值的優(yōu)質(zhì)溶劑油、潤滑油基礎(chǔ)油和食品級蠟。所述費(fèi)托合成蠟可以是源自以天然氣為原料經(jīng)費(fèi)托合成得到的蠟，也可以是以煤為原料經(jīng)費(fèi)托合成得到的蠟。下面的實(shí)施例將對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的加氫處理催化劑、脫蠟催化劑和加氫催化劑及<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>續(xù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表1documentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>續(xù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本發(fā)明單純皰疹病毒不僅在侵染黃色人種宿主細(xì)胞的能力方面增強(qiáng)，而且用于其他人種多發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)，對腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。本發(fā)明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其中，所述作為載體的病毒選自本發(fā)明的單純皰疹病毒。本發(fā)明的單純皰疹病毒不僅可以單獨(dú)作用裂解殺傷腫瘤細(xì)胞，而且還可以作為載體通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細(xì)胞。單純皰疹病毒可以插入40-50千堿基(kb)的外源片段("基因治療進(jìn)展及其在心血管疾病中的應(yīng)用"，華軍益等人，心血管病學(xué)進(jìn)展，2000年，第21巻，第4期，第211-214頁)，因此作為載體的本發(fā)明單純皰疹病毒可以攜帶0.1-50kb的目的基因，優(yōu)選攜帶10-40kb的目的基因。所述目的基因可以為抗腫瘤活性的基因，例如編碼前體藥物激活蛋白的基因、編碼腫瘤抑制蛋白的基因、編碼細(xì)胞凋亡因子(pro-apoptoticfactors)前體的基因和編碼免疫刺激蛋白的基因中的一種或幾種。所述免疫刺激蛋白可以為自身具有細(xì)胞毒性的蛋白、能夠刺激/增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的蛋白。當(dāng)然本發(fā)明的病毒也可以用來將一種或幾種目的基因傳遞至需要其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞可以是非腫瘤細(xì)胞例如神經(jīng)細(xì)胞，所述-種或幾種目的基因可以為編碼改變對疼痛刺激應(yīng)答或緩解慢性疼痛的多肽的基因，所述多肽例如能夠隔絕例如神經(jīng)生長因子、其它疼痛調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子樣分子的蛋白，物質(zhì)P以及其它神經(jīng)肽。所述一種或幾種目的基因也可以為編碼能夠刺激變性性疾病中損傷神經(jīng)再生長或防止神經(jīng)進(jìn)一步變性的多肽的基因。所述目的基因還可以包括調(diào)控序列，例如所述一種或幾種目的基因表達(dá)的啟動子、終止子和增強(qiáng)子。所述目的基因也可以包括標(biāo)記基因(例如，編碼P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白或其它熒光蛋白的基因)或其產(chǎn)物調(diào)節(jié)其它基因表達(dá)的基因。所述目的基因除可以是DNA夕卜，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號、聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。本發(fā)明還提供了一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為本發(fā)明的單純皰疹病毒和/或本發(fā)明的重組病毒。本領(lǐng)域人員公知，單純皰疹病毒需要在宿主細(xì)胞內(nèi)完成其生活史，因此病毒的傳代增殖以及活化需要在宿主細(xì)胞中進(jìn)行。而在體外感染有本發(fā)明單純皰疹病毒和/或本發(fā)明重組病毒的宿主細(xì)胞，也可以作為基因治療的藥物導(dǎo)入體內(nèi)。所述宿主細(xì)胞可以是各種能夠培養(yǎng)本發(fā)明病毒和/或本發(fā)明重組病毒的宿主細(xì)胞，例如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、原代兔腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)以及人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(WI-38細(xì)胞)。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明的單純皰疹病毒和/或本發(fā)明的重組病毒。本發(fā)明的單純皰疹病毒可以單獨(dú)使用裂解殺傷腫瘤細(xì)胞；還可以作為載體制備重組病毒，所述重組病毒單獨(dú)使用通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的單純皰疹病毒和本發(fā)明的重組病毒也可以同時(shí)使用。本發(fā)明的單純皰疹病毒、本發(fā)明的重組病毒以及它們的混合物都還可以包括藥物可接受的載體或賦形劑，以藥物組合物的形式使用。所述藥物接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料，例如，包括但不限于鹽水、緩沖鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適于胃腸外、舌下、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、頰內(nèi)、腫瘤內(nèi)或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。適于胃腸外給藥的藥物組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、內(nèi)二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑、保護(hù)劑和分散劑佐劑，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。優(yōu)選加入滲透壓調(diào)節(jié)劑如糖類、氯化鈉、氯化鉀。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上以及在肺和眼表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過將本發(fā)明的載體與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸或陰道腔內(nèi)熔化并釋放出活性化合物。優(yōu)選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明所述的病毒和/或重組病毒，每毫升所述注射液中含有102-101()空斑形成數(shù)。所述藥學(xué)上可接受的載體為pH值為4.0-9.0的磷酸緩沖液。所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以所述注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01-30重量％，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。使用所述注射液進(jìn)行時(shí)，給予的病毒量范圍為10、1(T空斑形成數(shù)(pftj)、優(yōu)選105-108pfb、更優(yōu)選106-108pfo。當(dāng)注射本發(fā)明所述藥用組合物時(shí)，注射用量可以為本領(lǐng)域常用的劑量，至多500微升、一般1-200微升、優(yōu)選1-10微升；但是根據(jù)所述腫瘤和接種部位，也可以使用至多10毫升的劑量。因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量僅作為參考。所述劑量可以根據(jù)各種參數(shù)、尤其根據(jù)待治療患者的年齡、體重和病癥、疾病或病癥的嚴(yán)重程度以及給藥途徑來確定。此外，對于癌癥患者優(yōu)選的給藥途徑是直接注射到腫瘤內(nèi)。本發(fā)明所述藥物組合物注射液也可以系統(tǒng)給藥，也可以將本發(fā)明的藥物組合物注射液注射到為腫瘤供血的血管內(nèi)給藥。最優(yōu)選給藥途徑取決于所述腫瘤的位置和大小。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，除非特別說明本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。實(shí)施例1本實(shí)施例說明本發(fā)明單純皰疹病毒的分離。(1)病毒的采集成年中國男性，37歲，漢族，多次口角皰疹反復(fù)發(fā)作病史，無其他疾病，呈典型I型單純皰疹病毒復(fù)發(fā)感染臨床表現(xiàn)——口角周圍出現(xiàn)皰疹樣水泡兩天后取樣。取15毫升的無菌離心管，盛有3毫升無菌的含100微克/毫升卡那霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)，所述緩沖液中含有9克/升的NaCl、0.21克/升的KH2P04以及0.97克/升的Na2HP04.12H20;用無菌棉簽擠壓皰疹樣水皰至淡黃色分泌物流出，然后用棉簽蘸取該分泌物，將所得棉簽帶有分泌物的一端在上述PBS緩沖液中涮洗10秒鐘。取出棉簽，用滅菌微量加樣器將所得含有分泌物的緩沖液吹吸均勻。(2)病毒的接種、培養(yǎng)和純化用含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以5X1()S個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，37"C下在5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，至每孔Vero細(xì)胞長滿80X。然后在無菌環(huán)境下，向上述六孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入200微升的(1)得到含有分泌物的PBS緩沖液(采樣后l小時(shí)完成接種)。繼續(xù)在5XCCb培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)24小時(shí)后，在無菌環(huán)境下，在光學(xué)顯微鏡下以100倍的放大倍數(shù)觀察Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒噬斑；用滅菌微量加樣器吸取單個(gè)的病毒噬斑10微升，將10微升吸取的液體混入IOO微升的DMEM培養(yǎng)基中，并用微量加樣器將所得含有病毒的DMEM培養(yǎng)基吹吸均勻。在無菌環(huán)境下，向另外一個(gè)長滿80XVero細(xì)胞的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入上述得到含有純化病毒的DMEM培養(yǎng)基，感染該Vero細(xì)胞。在5%0)2培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)獲得純化的本發(fā)明單純皰疹病毒。(3)病毒的生物學(xué)特性分析如圖1所示，52000倍電鏡下觀察到(2)純化的病毒具有典型的單純皰疹病毒形態(tài)衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜，包括囊膜的病毒直徑為150至200納米。此外發(fā)明人委托杭州華大基因公司還對(2)純化的病毒進(jìn)行了全基因組測序，測序結(jié)果如上述表l所示，所得病毒與NCBI中編號為ID:NC_001806的1型單純皰疹病毒17+的序列同源性為99.5%。本發(fā)明的發(fā)明人對得到的全基因組序列進(jìn)行了分析，得到如SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:NO,6、SEQID:N0.8，以及SEQID:NO.10所示的編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.l(病毒糖蛋白B)、SEQID:NO.3(病毒糖蛋白C)、SEQID:NO.5(病毒糖蛋白D)、SEQID:NO.7(病毒糖蛋白G)，以及SEQID:NO.9(病毒糖蛋白M)所示的囊膜蛋白的氨基酸序列。通過與ID:NCJ)01806的相應(yīng)基因比對，發(fā)現(xiàn)(2)得到的純化病毒編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列存在變異。此外還得到了如SEQID:N0.12以及SEQID:N0.14所示的編碼感染細(xì)胞多肽的立即早期基因的核苷酸序列，并由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.ll(感染細(xì)胞多肽a22)以及SEQID:N0.13(感染細(xì)胞多肽a27)。實(shí)施例2本實(shí)施例說明本發(fā)明的單純皰疹病毒對黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)的溶解能力。(1)單純皰疹病毒滴度的測定用含100%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以5X105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)(美國ATCC)，37°C下在5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，至每孔Vero細(xì)胞長滿80%備用。無菌條件下，收集實(shí)施例1培養(yǎng)有本發(fā)明單純皰疹病毒的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物的上清培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基分別梯度稀釋成1X102倍液、1X103倍液、1X104倍液、1X105倍液、1X1()6倍液以及1X1()7倍液，每種稀釋液各100微升。無菌條件下，棄去上述六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后每孔加入上述稀釋用的不含血清的DMEM培養(yǎng)基1毫升，接著將上述制得的六種濃度的病毒稀釋液分別加入6個(gè)孔中，每孔100微升。轉(zhuǎn)染有病毒的Vero細(xì)胞六孔培養(yǎng)板置于5XC02培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)1小時(shí)，無菌條件下棄去孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入2毫升羧甲基纖維素培養(yǎng)基(將羧甲基纖維素粉末與PBS溶液按照重量體積比2:125混合后，在4。C冰箱保存12小時(shí)，溶解完全后121.3r滅菌30分鐘，無菌條件下，將所得無菌1.6重量體積％的羧甲基纖維素PBS溶液與含10%FBS的DMEM按體積1:2混合制得)。置于5%<202培養(yǎng)箱中37。C下培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液將細(xì)胞潤洗2次，棄去PBS溶液，加入2毫升含有0.1體積％的戊二醛(美國Sigma)的PBS溶液，25"C下放置10分鐘。再次將細(xì)胞用PBS溶液潤洗兩次，棄去PBS溶液，加入1毫升0.1重量體積％的結(jié)晶紫溶液(用20體積％乙醇作為溶劑配制)，25。C下放置10分鐘。用純凈水潤洗細(xì)胞兩次，用吸水紙擦干六孔板背面的水，將六孔板置于IOO倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)空斑。計(jì)算得出每毫升病毒原液形成的空斑數(shù)為5X107，即病毒原液的滴度為5乂107病毒空斑形成單位/毫升(pfo/ml)。(2)人鼻咽癌細(xì)胞的培養(yǎng)37。C下在5XCO2培養(yǎng)箱中用6毫升含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在25平方厘米的培養(yǎng)瓶中的CNE-1細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞研究所)48小時(shí)，用放大100倍的倒置顯微鏡CNE-1細(xì)胞處于對數(shù)生長期。無菌條件下，加入0.25%的胰蛋白酶1毫升，在37t:下消化所述處于對數(shù)生長期的CNE-1細(xì)胞5分鐘。用倒置顯微鏡觀察CNE-1細(xì)胞在培養(yǎng)基溶液中游離后，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋成lX10"個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，微量進(jìn)樣器吹打均勻后加入96孔板中，每孔加IOO微升細(xì)胞懸液，在37。C、5%<:02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(3)病毒的轉(zhuǎn)染以及人鼻咽癌細(xì)胞存活率的測定用己知滴度的步驟(1)的單純皰疹病毒原液，按照步驟(1)的方法以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)為0.1轉(zhuǎn)染上述培養(yǎng)的CNE-1細(xì)胞。其中對照孔加入與病毒原液等體積的含1。/。小牛血清DMEM培養(yǎng)基。對照孔CNE-1細(xì)胞和被轉(zhuǎn)染的CNE-1細(xì)胞都在37"C下5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)用MTT法(具體方法記載在"測定細(xì)胞存活和增殖的MTT方法的建立"，鄭永唐等人，免疫學(xué)雜志，1992年，第8巻，第4期，第266-269頁)測定細(xì)胞存活率。用型號為DG-3022的酶聯(lián)免疫儀(華東電子管廠制造)在570納米下測定OD值，細(xì)胞存活率由下式計(jì)算細(xì)胞存活率=(轉(zhuǎn)染孔光吸收值/對照孔光吸收值)xioo%。細(xì)胞存活率的測試結(jié)果見表2。對比例1本對比例說明現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒對黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)的溶解能力。按照實(shí)施例2的方法，以相同病毒滴度的單純皰疹病毒17+轉(zhuǎn)染黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)(購自中科院上海細(xì)胞研究所)，在同樣的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的CNE-1細(xì)胞，并按照實(shí)施例2的方法測定CNE-1細(xì)胞的存活率，測定結(jié)果見表2。2病毒對比例1實(shí)施例224小時(shí)存活率(％)694548小時(shí)存活率(％)21672小時(shí)存活率(％)70從表2可以看出，轉(zhuǎn)染本發(fā)明單純皰疹病毒的CNE-1細(xì)胞的存活率大大低于轉(zhuǎn)染現(xiàn)有技術(shù)單純皰疹病毒17+的CNE-1細(xì)胞的存活率，而CNE-1細(xì)胞為典型的黃色人種多發(fā)人鼻咽癌的腫瘤細(xì)胞，說明本發(fā)明的病毒，相對于現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+而言，特異性對黃色人種的腫瘤細(xì)胞的溶解能力更強(qiáng)。實(shí)施例3本實(shí)施例說明本發(fā)明的單純皰疹病毒對一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力。按照實(shí)施例2的方法，用本發(fā)明的單純皰疹病毒分別在兩種不同的感染復(fù)數(shù)(MOtO.l和MO》l)下轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和人肺腺癌細(xì)胞A549(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第二研究所)，并測試轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的存活數(shù)，結(jié)果如表3所示。對比例2本對比例說明現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+對一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力。按照實(shí)施例2的方法，用單純皰疹病毒17+分別在兩種不同的感染復(fù)數(shù)(MOM).l和MO阿)下轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，并測試轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的存活數(shù)，結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>從表3可以看出，無論在低感染復(fù)數(shù)(MOI=0.1)還是高感染復(fù)數(shù)(MOI=l)的情況下，轉(zhuǎn)染本發(fā)明單純皰疹病毒24小時(shí)的三種腫瘤細(xì)胞系的存活率都大大低于轉(zhuǎn)染現(xiàn)有技術(shù)單純皰疹病毒17+的三種腫瘤細(xì)胞系的存活率，說明本發(fā)明的病毒對一般腫瘤細(xì)胞的溶解能力也好于現(xiàn)有技術(shù)的單純皰疹病毒17+。此外，圖2展示了正常人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7培養(yǎng)96小時(shí)的生長情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，密集生長排列；圖3展示了培養(yǎng)MCF—7細(xì)胞48小時(shí)后，按病毒活性顆粒/細(xì)胞數(shù)的比值(MOI)為0.1轉(zhuǎn)染本發(fā)明病毒后再培養(yǎng)48小時(shí)的生長情況光學(xué)顯微鏡照片(放大400倍)，多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞數(shù)目大大減少。從兩張照片對比可以看出，本發(fā)明的單純皰疹病毒對一般腫瘤細(xì)胞都具有很強(qiáng)的溶解能力。實(shí)施例4本實(shí)施例說明含有本發(fā)明病毒的藥物組合物具有溶瘤作用。(1)注射液的配制將按照表4所示的劑量分別配制一組磷酸鹽緩沖液，121'C下滅菌60分鐘。在無菌條件下，以0.45微米的微孔濾膜過濾實(shí)施例2的步驟(1)已知滴度的單純皰疹病毒原液，去除細(xì)胞碎片，收集濾液至無菌離心管中，8000轉(zhuǎn)/分離心1小時(shí)，棄去上清，按照表4所示的病毒滴度，將所得病毒沉淀分散在上述高溫滅菌后的磷酸緩沖液中，即得本發(fā)明注射液。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>本實(shí)施例中，陰性對照藥物為不含病毒的滅菌磷酸緩沖液；陽性對照藥物為注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，批號050202，規(guī)格200亳克/支，上海華聯(lián)200710062939.0說明書第32/52頁制藥有限公司生產(chǎn)。(2)細(xì)胞水平藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2的方法，以感染復(fù)數(shù)MOI=l的病毒注射液感染黃色人種多發(fā)的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1)。結(jié)果如表5所示。表5病毒注射液陰性對照陽性對照配方l配方2配方3配方4配方5配方6配方724小時(shí)存活率(％)10007050708080707048小時(shí)存活率(％)10001510152015101072小時(shí)存活率(％)10002000500從表5可以看出，本發(fā)明的注射液對黃色人種多發(fā)的CNE-1細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，陽性對照藥能在24小時(shí)內(nèi)殺死腫瘤細(xì)胞，但是陽性對照藥對正常細(xì)胞的毒性也很大。(3)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長的抑制作用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，Balb/c裸鼠，4-6周齡，16-20克，雌性，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。傳代荷瘤鼠皮下腫瘤生長至直徑約2-3厘米時(shí)，無菌條件下取出瘤塊，按照每克腫瘤組織3-4毫升生理鹽水的比例，制成腫瘤細(xì)胞勻衆(zhòng)，給予每只小鼠右前肢腋部皮下接種0.2毫升；或者將瘤塊切割成1立方厘米的小瘤塊，用套管針接種到裸鼠右側(cè)腋部皮下。待各組動物接種的腫瘤生長到動物體表能觀察到約0.6厘米X0.6厘米的腫塊時(shí)，隨機(jī)分9組(本發(fā)明配方7組、陽性對照組、陰性對照組)，每組7只開始用步驟(1)的本發(fā)明病毒注射液以及陽性對照藥物、陰性對照藥物給藥。于第1天、第4天和第7天瘤內(nèi)注射，注射容積為100微升。本發(fā)明病毒的給藥劑量為2.5X107pfb/kg，陽性對照藥為環(huán)磷酰胺，陽性對照藥的給藥劑量為100mg/kg，陰性對照藥為與本發(fā)明病毒注射液等體積的磷酸緩沖液。最后一次給藥后，每周稱體重，測定動物體表能觀察到的腫瘤體積，繼續(xù)觀察2周左右，腫瘤體積變化曲線見圖5，然后頸部脫臼處死動物，剝離取出瘤塊稱重，可得出腫瘤抑制率-100n/。X本發(fā)明病毒注射液組或陽性對照藥組平均瘤塊重量/陰性對照藥平均瘤塊重量，結(jié)果見表6。圖4為陰性對照藥(第一行)、陽性對照藥(第二行)，本發(fā)明病毒配方2注射液(第三行)所取出的瘤塊照片，空白位置的小鼠死亡。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>從表6和圖4、圖5可以看出，本發(fā)明對人結(jié)腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用，本發(fā)明組的抑制率范圍為28.0%-77.0%，雖然陽性對照藥的抑制率對腫瘤的抑制作用也很明顯，但是陽性對照藥的死亡率很高，因而本發(fā)明的病毒注射液更安全。SEQUENCELISTING<110>北京奧源和力生物技術(shù)有限公司<120>單純皰疹病毒和重組病毒及宿主細(xì)胞及其藥物組合物<130>I66270YH<160>14<170>PatentInversion3.4<210〉1<211>904<212>PRT<213>單純皰疹病毒I型(HerpesSimplexVirusTypeI)<400>1MetArgGinGlyAlaProAlaArgGlyArgArgTrpPheValValT卬151015AlaLeuLeuGlyLeuThrLeuGlyValLeuValAlaSerAlaAlaPro202530SerSerProGlyThrProGlyValAlaA]aAlaThrGinAlaAlaAsn354045GlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaProGlyProAlaProThr505560GlyAspProLysProArgLysAsnLysLysProLysProProThrPro65707580ProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThr859095LeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsn100105110PheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGlu115120125GinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGlu130135140GlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLys145150155160AlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGly165170175HisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProVal180185190ProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArg195200205SerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHis210215220ArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAla225230235240ThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnPro245250255SerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslie260265270ValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheVal275280285LeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArg290295300GluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLys305310315320GinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAla325330335ThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThr"Val340345350AlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLys355360365T卬GinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPhe370375380ArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThr385390395400GluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAsp405410415AlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThr420425430HislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPhe435440445LeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyr450455柳ValArgGluHisLeuArgGluGinSerArgLysProProAsnProThr465470475480ProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLys485490495ThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHis500505510lieGinArgHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaT卬515520525CysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLys530535540LeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSer545550555560AlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProVal565570575AlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArg580585590ProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuVaiSerPheArgTyrGluAsp595600605GinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArg610615620LeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyr625630635640PheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluTyrAlaTyrSer645650655HisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAsp660665670LeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluVal675680685TyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGlu690695700ValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAsp705710715720ThrVallieHisAlaAspAlaAsnAlaAlaMetPheAlaGlyLeuGly725730735AlaPhePheGluGlyMetGlyAspLeuGlyArgAlaValGlyLysVal740745750ValMetGlylieValGlyGlyValValSerAlaValSerGlyValSer755760765SerPheMetSerAsnProPheGlyAlaLeuAlaValGlyLeuLeuVal770775780LeuAlaGlyLeuAlaAlaAlaPhePheAlaPheArgTyrValMetArg785790795800LeuGinSerAsnProMetLysAlaLeuTyrProLeuThrThrLysGlu805810815LeuLysAsnProThrAsnProAspAlaSerGlyGluGlyGluGluGly820825830GlyAspPheAspGluAlaLysLeuAlaGluAlaArgGluMetlieArg835840845TyrMetA)aLeuValSerAlaMetGluArgThrGluHisLysAlaLys850艦860LysLysGlyThrSerAlaLeuLeuSerAlaLysValThrAspMetVal865870875880MetArgLysArgArgAsnThrAsnTyrThrGinValProAsnLysAsp885GlyAspAlaAspGluAspAspLeu900<210>2<211>2715<212>DNA<213>單純皰疹病毒I型890895(HerpesSimplexVirusTypeI)<400>2atgcgccagggcgcccccgcgcgggggcgccggtggUcgtcgUtgggcgctcttgggg60ttgacgctgggggtcctggtggcgtcggcggctccgagttcccccggcacgcctggggtc120gcggccgcgacccaggcggcgaatgggggccctgccactccggcgccgcccgcccctggc180cccgccccaacgggggacccgaaaccgaggaagaacaaaaaaccgaaacccccaacgccg240ccgcgccccgccggcgacaacgcgaccgtcgccgcgggccacgccaccctgcgcgagcac300ctgcgggacatcaaggcggagaacaccgatgcaaacttttacgtgtgcccaccccccacg360ggcgccacggtggtgcagttcgagcagccgcgccgctgcccgacccggcccgagggtcag420aactacacgg鄉(xiāng)gcatcgcggtggtcttca郷agaacatcgccccgtacaagttcaag480gccaccatgtcagtttatggatcaacgccaaccgcgtttcacccgcacgagcgttccaccgtgtacccgttacggctacccaggtcgacgacccggaaccccgtcggtctggcggctcctgagtacccgcatggaccgcatactacctgggcggagctgtcccccgccgcatcgagttcgttgggccgcggaggcccgcagcgcggatgcgtgatcgtccctggtcagctaacgagctgcttcaccttcgcgcgccgacacacgagtttggactacacggacggtcatcc鵬atgggcggtatcggccgggtctgttggctgcagagcaaccaacccgggccgaggccacacaaggccaatgcgcaagcgaggacgaccactacaaagaggatctttga鄉(xiāng)gggtctgaccgggacgagccggggctgggtacgggacacgacgagttgggaggggtcgcttctacgctgctcacgacgcaccatgactccgattctctctcgcgcgttcttcgcccgccaatgggggacgtgcgggaccggggccagcccggctgcattgccatcgcagctgaaccctcggcgacgtaaaactcgatttcggtacgaggctgacgcggtg鵬gctatcaccaccgttccccctggaaggtccagcgacgccgacgcacctggggcgtgtcgggcgttcctggccggaccccatgaaacgcgtccggggg卿tgatagaagaaggggccgcaacactgtgacgtcaccgttggaccgcgcctcggtccacgccacgagaccgcacaccaccgacggtaaactgtgctggcggcacaccgaagcgcgacctcccccaagttccaagtggcagctccgacgcc卿cctggggcaggtacaacctttctgatcacacctccgacgccaacgcggtttacgtacgtggtgcgagcaacgccatcgatggccgt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ProAlaAspProArgAlaProAlaProGluArgLysAlaPro225230235240AlaAlaAspThrlieAspAlaThrThrArgLeuValLeuArgSerlie245250255SerGluArgAlaAlaValAspArglieSerGluSerPheGlyArgSer260265270AlaGinValMetHisAspProPheGlyGlyGinProPheProAlaAla275280285AsnSerProT卬AlaProValLeuAlaGlyGinGlyGlyProPheAsp290295300AlaGluThrArgArgValSerTrpGluThrLeuValAlaHisGlyPro305310315320SerLeuTyrArgThrPheAlaGlyAsnProArgAlaAlaSerThrAla325330335LysLeuAlaAlaMetSer355Arg340AlaAspAspCysGluValThrLeuLeu360Arg345AlaGinTrpGluCysAsnLysPheMet365lie350CysGlulieAlaHisHisAsnLeuProLeuArgProGinAspProlielieGlyThrAlaAla370375380AlaValLeuAspAsnLeuAlaThrArgLeuArgProPheLeuGinCys385390395400TyrLeuLysAlaArgGlyLeuCysGlyLeuAspGluLeuCysSerArg405410415ArgArgLeuAlaAsplieLysAsplieAlaSerPheValPheVallie420425430LeuAlaArgLeuAlaAsnArgValGluArgGlyValAlaGlulieAsp435440445TyrAlaThrLeuGlyValGlyValGlyGluLysMetHisPheTyrLeu450455460ProGlyAlaCysMetAlaGlyLeulieGlulieLeuAspThrHisArg465470475480GinGluCysSerSerArgValCysGluLeuThrAlaSerHislieVal485490495AlaProProTyrValHisGlyLysTyrPheTyrCysAsnSerLeuPhe500505510<210>14<211>1539<212>DNA<213>單純皰疹病毒I型(HerpesSimpl.exVirusTypeI)<400>14atggcgactgacattgatatgctaattgacctcggcctggacctctccgacagcgatctg60gacg郷acccccccgagccggcggagagccgccgcgacgacctggcatcggacagcagc120ggggagtgttcctcgtcggacg鄉(xiāng)acatggaagacccccacgg柳ggacggaccggag180ccgatactcgacgccgctcgcccggcggtccgcccgtctcgtccagaagaccccggcgta240CCC郷3CCCagacgcctcgtccgacggagcggcagggccccaacgatcctcaaccagcg300ccccacagtgtgtggtcgcgcctcggggcccggcgaccgtcttgctcccccgagcagcac360gggggcaaggtggcccgcctCC33CCCCC3ccgaccaaagcccagcctgcccgcggcgga420cgccgtgggcgtcgcaggggtcggggtcgcggtggtcccggggccgccgatggtttgtcg480gacccccgccggcgtgcccccagaaccaatcgcaacccggggggaccccgccaccggggc540gggtggacggacggccccggcgccccccatggcg鄉(xiāng)cgtggcgcggaagtgagcagccc600gacccacccgg鄉(xiāng)cccgcggacacggggcgtgcgccaagC3CCCCCCCCgctaatgacg660ctggcgattgcccccccgcccgcggacccccgcgccccggccccggagcgaaaggcgccc720gccgccgacaccatcgacgccaccacgcggttggtcctgcgctccatctccgagcgcgcg780gcggtcgaccgcatcagcgagagctttggccgcagcgcac郷tcatgcacgacccctU840ggggggc柳cgtttcccgcCgCg33t3gCccctgggccccggtgctggcgggcca鄉(xiāng)a900gggccctttgacgccg柳cc柳cgggtctcctgggaaaccttggtcgcccacggcccg960agcctctatcgcacttttgccggcaatcctcgggccgcatcgaccgccaaggccatgcgc1020<image>imageseeoriginaldocumentpage56</image>權(quán)利要求1.一種單純皰疹病毒，所述病毒具有囊膜蛋白，其特征在于，所述囊膜蛋白包括一種具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQIDNO.1所示的氨基酸序列、SEQIDNO.3所示的氨基酸序列、SEQIDNO.5所示的氨基酸序列、SEQIDNO.7所示的氨基酸序列、SEQIDNO.9所示的氨基酸序列，以及對所述SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、添加或缺失而得到的促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能不變的氨基酸序列中的一種或幾種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒，其中，所述氨基酸序列選自SEQID:NO.l所示的氨基酸序列、SEQID:N0.3所示的氨基酸序列、SEQID:N0.5所示的氨基酸序列、SEQID:NO.7所示的氨基酸序列和SEQID:N0.9所示的氨基酸序列中的一種或幾種。3、一種單純皰疹病毒，所述病毒具有編碼囊膜蛋白的基因，其特征在于，所述囊膜蛋白為權(quán)利要求l所述的囊膜蛋白。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:NO.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO，6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:NO,6、SEQID:NO.8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒，其中，所述囊膜蛋白為權(quán)利要求2所述的囊膜蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的病毒，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進(jìn)病毒侵染宿主細(xì)胞功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:NO.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒，其中，所述病毒的核苷酸序列與NCBI中ID:NC一001806的I型單純皰疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5%的同源性。8、一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其特征在于，所述作為載體的病毒為權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的病毒。9、一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述病毒為權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的病毒和/或權(quán)利要求8所述的重組病毒。10、一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的病毒和/或權(quán)利要求8所述的重組病毒。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的病毒和/或權(quán)利要求8所述的重組病毒，每毫升所述注射液中含有102-101Q空斑形成數(shù)的所述病毒和/或重組病毒。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為pH值為4.0-9.0的磷酸緩沖液。13、根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以所述注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01-30重量％，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。全文摘要本發(fā)明提供了一種分離自黃色人種的單純皰疹病毒，該病毒對于黃色人種宿主細(xì)胞的特異性侵染率高，復(fù)制速度快，因此可以直接用于侵染并溶解黃色人種的腫瘤細(xì)胞，也可以作為載體攜帶基因藥物至黃色人種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因治療。文檔編號A61K39/245GK101230334SQ200710062939公開日2008年7月30日申請日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日發(fā)明者李小鵬申請人:北京奧源和力生物技術(shù)有限公司