專利名稱：新型支鏈狀唾液糖分子與使用該糖分子的抗病毒劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請發(fā)明涉及新型支鏈狀唾液糖分子(sialo-sugar)。更詳細(xì)地講，本申請發(fā)明涉及可適應(yīng)于流感病毒宿主范圍變異或抗原性變異、可阻止所有來自人與動物的A型流感病毒與B型流感病毒的感染、及流感流行的醫(yī)藥品或作為除去病毒用過濾器等的吸附劑使用的新型支鏈狀唾液糖分子。
背景技術(shù)：
日本的流感感染者每年超過數(shù)10萬人～100萬人。1918年的流行性感冒(通過基因解析判明H1N1型流感毒病導(dǎo)致的感冒)全世界一年至少有2000萬人，日本死亡38萬人以上，位居人類史上最嚴(yán)重、最大的自然災(zāi)害。
另外，近年報道流感尤其是使高齡者中并發(fā)支氣管炎和肺炎而重癥化、小孩則引起腦炎或腦癥，因此制止冬季的疾病成為世界性當(dāng)務(wù)之急。
流感病原體是流感病毒，已知流感病毒依據(jù)內(nèi)部蛋白質(zhì)抗原性的不同有A、B、C型三類。B、C型主要由人中分離出，A型病毒除人以外也從野生水鳥、家禽類、豬、馬、海豹、鯨魚、黑足釉等自然界的許多動物中分離出，其病原性最高，引起世界性流行。
流感病毒以分節(jié)狀的單鏈RNA為基因組。已知一般讀取一根鏈RNA配列的RNA聚合酶產(chǎn)生的復(fù)制，與通常讀取2根鏈DNA的DNA聚合酶產(chǎn)生的復(fù)制相比，特別容易引起“差錯”(Steinhauer，D.A.，Holland.J.J.Annual Reviw of Microbiology，41，409-433(1987)；Gojobori，T.，Yamaguchi，Y.，Ikeo，K.，Mizokami，M.Japanese Journal ofGenetics，69，481-488(1994))。因此，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖時，同時產(chǎn)生新的變異病毒。病毒蛋白質(zhì)的抗原性因這樣的變異而一點一點地發(fā)生變化，故通常的免疫監(jiān)視機(jī)構(gòu)往往檢測不出流感病毒，因此每年流行。
對于流感病毒的變異，除了前述的抗原性連續(xù)變異(AntigenicDrift)以外，還有宿主范圍的變異(Antigenic Shift)(Suzuki，Y.Progress in Lipid Research，33，429-457(1994))。流感病毒的基因由于不只與一個有關(guān)而是分節(jié)狀，例如人與鴨的流感病毒同時感染到豬上時，在豬體內(nèi)產(chǎn)生兩種的基因產(chǎn)生再集合，有時產(chǎn)生具有全新型(抗原性)的病毒。而且，由于人完全沒有對抗這種病毒的抗體，所以人感染上新病毒時則有世界行大流行的危險。
已知流感病毒的感染是因作為病毒糖蛋白質(zhì)的血細(xì)胞凝集素(HA)與存在于宿主細(xì)胞表面的含唾液酸的糖鏈進(jìn)行結(jié)合而引起(Suzuki，Y.Progress in Lipid Research，33，429-457(1994)；Paulson，J.C.The Receptors，Vol.2，Academic Press，Orlando，pp.131-219(1985)；Wiley，D.C.and Skehel，J.J.Annual Review of Biochemistry，56，365-394(1987))。另外，這去研究了這種含唾液酸的糖鏈，作為抗流感病毒劑報道了各種的含唾液酸糖鏈(唾液糖類)化合物(Fujimoto，K.，Hayashida，O.，Aoyama，Y.，Guo.C.T.，Hidari.，K.I.P.J.，and Suzuki，Y.Chemistry Lettel，1259-1260(1999)；Suzuki，Y.，Sato.K.，Kiso，M.，and Hasegawa，A.Glycoconj.J.7，349-54(1990))。然而，這些化合物均只是對一種類型病毒呈現(xiàn)抗流感病毒性，對同時流行多種類型病毒的現(xiàn)狀來說，實際上限制了這些化合物的有效性。
但迄今還沒有開發(fā)可對付流感病毒在動物種間傳播的宿主范圍變異或宿主所具有的流感病毒抗體的抗原性變異的抗流感劑。
因此，本申請發(fā)明課題是解決如上述的問題，提供對付流感病毒的宿主范圍變異或抗原性變異，可阻止來自所有的人或動物的A型流感病毒與B型流感病毒的感染及流感流行的醫(yī)藥品，或者作為除去病毒用過濾器等的吸附劑使用的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本申請發(fā)明作為解決如以上課題的目的的發(fā)明，第1提供，一種新型支鏈狀唾液糖分子，其特征是，以下式(I)表示。
(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示乙酰己糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基)本申請發(fā)明第2提供前述新型支鏈狀唾液糖分子，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖采用天然的鄰位糖苷鍵而結(jié)合，第3提供前述新型支鏈狀唾液糖分子，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖的結(jié)合是化學(xué)性變換結(jié)合，第4提供前述新型支鏈狀唾液糖分子，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖的結(jié)合形態(tài)選自S-糖苷鍵或Se-糖苷鍵。
本申請發(fā)明第5提供下式(II)所示結(jié)構(gòu)為特征的新型支鏈狀唾液糖分子。
(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal表示半乳糖、GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基)此外，本申請發(fā)明第6提供下式(III)所示結(jié)構(gòu)為特征的新型支鏈狀唾液糖分子。

(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal表示半乳糖，GalNAc表示N-乙酰半乳糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基)本申請發(fā)明第7提供前述任何一種的新型支鏈狀唾液糖分，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖采用天然的鄰位糖苷鍵；第8提供前述任何一種的新型支鏈狀唾液糖分，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖的結(jié)合是化學(xué)性變換結(jié)合；第9提供前述的新型支鏈狀唾液糖分子，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖的結(jié)合形態(tài)是S-糖苷鍵或Se-糖苷鍵。
此外，本申請發(fā)明第10提供以至少含有前述任何一種新型支鏈狀唾液糖分子作為有效成分為特征的抗病毒劑。
附圖的簡單說明

圖1是表示本申請發(fā)明的實施例中流感A型病毒與流感B型病毒與來自孵化雞蛋漿尿膜的酸性糖脂質(zhì)的結(jié)合性試驗(二次展開)結(jié)果的照片。(a病毒(-)、b使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與A/PR/8/34的結(jié)合性、d與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、e與B/Lee/40的結(jié)合性、f與B/Gifu/2/73的結(jié)合性；S標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)＝牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷脂(bovinebrain total gangliosides)、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂(sialylparagloboside)、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂)、1st一次展開(CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)、2nd二次展開(CHCl3/Meoh/5N NH4OH(5/4/1，v/v/v)；箭頭與流感病毒共同反應(yīng)的糖脂質(zhì))圖2是表示本申請發(fā)明的實施例中采用Iatrobeads柱色譜精制的來自孵化雞蛋漿尿膜的酸性糖脂質(zhì)與流感A型病毒及流感B型病毒結(jié)合性試驗(CHCl3/MeOH/12Mm MgCl25/4/1，v/v/v)結(jié)果的照片。(a病毒(-)、b用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與A/Memphis/1/7的結(jié)合性、d與A/PR/8/34的結(jié)合性、e與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、f與A/Duck/313/4的結(jié)合性；g與A/Duck/92/1/76的結(jié)合性、h與B/Lee/40的結(jié)合性；S標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)＝牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷脂+GM3、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂；1～7餾分；箭頭目的糖脂質(zhì))圖3是表示本申請發(fā)明的實施例中來自孵化雞蛋漿尿膜的酸性糖脂質(zhì)的與流感A型病毒的結(jié)合性試驗(CHCl3/MeOH/12Mm MgCl2/15M NH4OH50/40/7/3，v/v/v)結(jié)果的照片。(a用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、b與A/Memphis/1/71的結(jié)合性、c與A/PR/8/34的結(jié)合性、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、AM來自孵化雞蛋漿尿膜的精制糖脂質(zhì))圖4是表示本申請發(fā)明實施例中來自MDCK細(xì)胞的酸性糖脂質(zhì)與流感A型病毒及流感B型病毒的結(jié)合性試驗(二次展開)結(jié)果的照片。(a病毒(-)、b用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與A/PR/8/34的結(jié)合性、d與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、e與B/Lee/40的結(jié)合性、f與B/Gifu/2/73的結(jié)合性；S標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)＝牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷脂、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂；1st一次展開(CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)、2nd二次展開(CHCl3/MeOH/5N NH4OH 5/4/1，v/v/v)；箭頭與流感病毒共同反應(yīng)的糖脂質(zhì))。
圖5是表示本申請發(fā)明的實施例中來自孵化雞蛋漿尿膜的酸性糖脂質(zhì)從Iatrobeads柱色譜流出輪廓的照片。(展開溶劑CHCl3/MeOH/12mMMgCl2(5/4/1，v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色)(箭頭表示與流感病毒的共同反應(yīng)性的糖脂質(zhì)；1～7餾分)。
圖6是表示本申請發(fā)明的實施例中采用Iatrobeads柱色譜精制的來自孵化雞蛋漿尿膜的酸性糖脂質(zhì)與流感A型病毒的結(jié)合性試驗(CHCl3/MeOH/12mM MgCl2)(5/4/1，v/v/v)結(jié)晶的照片。(a病毒(-)、b用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、d與A/Memphis/1/71的結(jié)合性、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂；1～7餾分)。
圖7是表示本申請發(fā)明的實施例中被貯存的糖脂質(zhì)從Iatrobeads柱色譜流出輪廓的照片。(展開溶劑CHCl3/MeOH/12mM MgCl25/4/1、v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色)(箭頭表示與流感病毒的反應(yīng)性的糖脂質(zhì))。
圖8是表示本申請發(fā)明的實施例中采用制備用TLC精制的糖脂質(zhì)的TLC結(jié)果的照片。(展開溶劑CHCl3/MeOH/12mM MgCl25/4/1、v/v/v)；使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色)(S牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷脂)。
圖9是表示本申請發(fā)明的實施例中，通過制備用TLC精制的來自孵化雞蛋漿尿膜的糖脂質(zhì)與流感A型病毒的結(jié)合性試驗結(jié)果的照片；(a病毒(-)、b使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、d與A/PR/8/38的結(jié)合性、e與A/Memphis/1/71的結(jié)合性、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂；1～5AM序號；箭頭與任何一種流感病毒進(jìn)行特異性反應(yīng)的糖脂質(zhì))。
圖10是表示本申請發(fā)明的實施例中通過制備用TLC精制的來自孵化雞蛋漿尿膜的糖脂質(zhì)與B/Gifu/2/73的結(jié)合性試驗結(jié)果的照片。(a病毒(-)、b使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、c與B/Gifu/2/73的結(jié)合性、S1α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、S2α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂；1～5AM序號；箭頭與B/Gifu/2/73進(jìn)行特異性反應(yīng)的糖脂質(zhì))。
圖11是表示本發(fā)申請發(fā)明的實施例中采用DEAE-Sephadex A-25柱制備的來自孵化雞蛋漿尿膜的糖脂質(zhì)(一唾液、二唾液組分)與各流感病毒的結(jié)合性試驗結(jié)果的照片。(a使用苔黑酚-H2SO4試劑顯色、b使用間苯二酚-HCl試劑的顯色、c病毒(-)(1級抗體＝anti-p-50)、d病毒(-)(1級抗體＝USA1)、e與A/PR/8/34(H1N1)的結(jié)合性、f與A/Aichi/2/68(H3N2)的結(jié)合性、g與A/Memphis/1/71(H3N2)的結(jié)合性；S1GSC273(α2-3sialyl paragloboside)、S2GSC275(α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂)；#1一唾液組分，#2二唾液組分圖12是表示對漿尿膜二唾液組分的各種流感病毒的感染阻礙作用的圖。(表示只加病毒液時的LDH活性為100％，添加各濃度的二唾液組分時的相對活性。)(a與A/PR/8/34的結(jié)合性、b與A/Aichi/2/68的結(jié)合性、c與A/Memphis/1/71的結(jié)合性、d與B/Lee/40的結(jié)合性)。
具體實施例方式
本申請發(fā)明人進(jìn)行流感病毒的基因解析及對宿主的感染為所必須的病毒受體的唾液糖鏈的研究，逐漸清楚了流感病毒由人傳給其他動物的方式。(Ito，T.，Suznki.Y.，Takada.A.，Kawamoto，A.，Otsu ki，K.，Masuda，H.，Yamada，M.，Suzuki，T.，Kida，H.，and Kawaoka，Y.，Journal of Virology，71，3357-3362(1997)；Suzuki，T.，Horiike，G.，Yamazaki，Y.，Kawabc，K.，Masuda，H.，Miyamoto，M.，Nishimura，S.I.，Yamagata，T.，Ito，T.，Kida，H.，Kawaoka.Y.，and Suzuki.Y.，F(xiàn)EBS Letters，404，192-196(1997)；Ito，T.，Suzuki，Y.，Mitnaul，L.，Vines，A.，Kida，H.，and Kawaoka，Y，Virology，227，493-499(1997)；Suznki，Y，Options for the Control ofinfluenza III.(Elsevier Science B.V.，Brown，L，E.，Hampson，A，W.，Webster，R.G.，editors)，4443-4446(1996)。而且，得知由人、豬、鳥、馬分離出的流感A型病毒與人流感B型病毒，均特異性地將含唾液酸(Sialic acid，SA)的糖鏈進(jìn)行識別結(jié)合，尤其是唾液內(nèi)酯系I型與II型糖鏈(I型糖鏈SAα2-6(3)Galβ1-3G1cNAcβ1-；II型糖鏈SAα2-6(3)Gal β1-4G1cNAc β1-)牢固地結(jié)合。(Suznki，Y.，Nakao，T.，Ito，T.，Watanabe，N.，Toda，Y.，Xu，G.，Suzuki，T.，Kobayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，et al，Virology，189，121-131(1992)；鈴木康夫；生化學(xué)，62，231-260(1990))此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)即使是有活性的唾液糖鏈作為游離低聚糖存在時對流感病毒的結(jié)合力也弱，但作為唾液糖脂質(zhì)、唾液糖蛋白質(zhì)等，作為與脂質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合的糖鏈存在時，又發(fā)現(xiàn)使上述唾液糖鏈在化學(xué)合成聚合物上形成集合簇時，表現(xiàn)出格外高的結(jié)合性。
(Fujimoto，K.，Hayashida，O.，Aoyama，Y.，Guo，C.T.，Hidari，K.I.P.J.，and Suzuki，Y，Chemistry Letter，1259-1260(1999)；Akiko Tsuchida，Kazukiyo Kobayashi，Noritaka Matsubara，Jsukasa Muramatsu，TakashiSuzuki，Yasuo SuzukiGlycoconjugate J.，15，1047-1054(1998)此外，還發(fā)現(xiàn)A型、B型流感病毒血細(xì)胞凝集素的分子進(jìn)化呈現(xiàn)為受體唾液糖鏈末端的唾液酸結(jié)合方式(SA-2-3Gal，SA2-6Gal)與唾液酸分子種(Neu5Ac，Neu5Gc)識別的變化。(Suzuki，Y.，Kato，H.，Naeve，C.W.，Webster，R.G.Virology，63，4298-4302(1989)；Xu，G.，Horiike，G.，Suzuki，T.，Miyamoto，D.，Kuminashi，H.，and Suzuki，Y，Biochemical andbiophysical research communications，224，815-818(1996)，例如采用MDCK細(xì)胞從人分離出的A型(H1、H3亞型)與B型病毒識別SA2-6Gal結(jié)合(以下稱2-6)，而從鴨或馬分離出的病毒對SA2-3Gal結(jié)合(以下稱2-3)均顯示出強(qiáng)的親合性，對2-6的結(jié)合弱。另一方面，從豬分離出的病毒顯示對2-6的強(qiáng)親和性，但也可以與2-3結(jié)合。
另外，調(diào)查流感病毒接受組織(人、豬、馬的上述吸道粘膜細(xì)胞、鴨的腸道粘膜細(xì)胞)中唾液酸的結(jié)合方式與分子種，結(jié)果表明豬的上呼吸道細(xì)胞存在對人、鴨病毒兩者的受體唾液糖鏈(2，6-、2，3-的兩者)。即，在分子水平上得知在自然界中豬成為鴨與人流感病毒的中間宿主。
然而，實際上在宿主細(xì)胞表面所表達(dá)的唾液糖鏈(即，特定的受體分子)的存在或結(jié)構(gòu)迄今仍沒搞清。此外，本申請發(fā)明者通過潛心研究，從流感病毒感染組織中提取各種的唾液糖鏈，研究了對各種流感病毒的結(jié)合性，從而完成了本發(fā)明。
即，本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子是下述化學(xué)式(I)表示的結(jié)構(gòu)。
(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或酰基化學(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示乙酰己糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基)。本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子，即，特征是具有α2，6-結(jié)合的NeuAc與Hex-HexNAc和α2，3-結(jié)合的NeuAc與Hex-HexNAc兩方。
這樣的化合物中，Hex與HexNAc的種類沒有特殊限定。優(yōu)選Hex是半乳糖(Gal)、HexNAc是半乳糖胺(GalNAc)或葡糖胺(GlcNAc)。另外，NeuAc其羥基、羧基與酰胺基可以被鹵素(F，Cl，Br，I)、烷基(C2～C20)與?；?C2～C20)進(jìn)行化學(xué)性修飾。
此外，本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子中，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖(或半乳糖)的結(jié)合，不只是天然存在的鄰位糖苷鍵，也可以進(jìn)行S-糖苷、Se-糖苷鍵等化學(xué)性變換。
另外，本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子也可以是R是氫原子或可以有取代基的烴基的游離低聚糖或其衍生物，R也可以是糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或合成高分子等。如前述，作為R有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子等，當(dāng)形成新型支鏈狀唾液糖脂質(zhì)、新型支鏈狀唾液糖蛋白質(zhì)、高分子固定化新型支鏈狀唾液糖等時，對流感病毒的結(jié)合性高而優(yōu)選。另外，也可根據(jù)本發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子的用途適當(dāng)?shù)刈兏黂的結(jié)構(gòu)。
本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子可以是采用公知的多糖類的合成方法進(jìn)行合成的物質(zhì)，也可以是天然由來的物質(zhì)。尤其是列舉對來自孵化雞蛋漿尿膜的物質(zhì)進(jìn)行分離得到的唾液糖分子。
本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子，對于該分子中所有類型(A型、B型、以及A型流感病毒血細(xì)胞凝集素亞型)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合方面，由于同時有所必須的多個唾液糖鏈，尤其是同時具有α2，6-與α2，3-結(jié)合，因此，對A型流感病毒與B型流感病毒的任何一種均有效地進(jìn)行結(jié)合。
所以，本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子適用于防止流感病毒感染及防止流感病毒的流行中的各種手段。例如可列舉醫(yī)藥品(抗病毒劑)的有效成分、防護(hù)面具或空氣凈化器等的過濾器中病毒吸附劑等的用途。例如作為抗病毒劑使用的場合，可以成為任意的形態(tài)，可列舉液劑、片劑、粉末等經(jīng)口服用的抗病毒藥，或作為滴鼻藥、口腔噴霧劑等的氣溶劑等直接用與鼻腔或咽喉的藥，經(jīng)皮使用的藥等。而填充于過濾器等中的場合，可從空氣中除去病毒，防止護(hù)散。此外，如果把本申請發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子混合或涂布在窗簾、壁紙等的家庭用品上，則可賦予除去病毒、防止擴(kuò)散的效果。
本發(fā)明的新型支鏈狀唾液糖分子對流感病毒具有與過去的直鏈狀糖鏈組同等或更好的結(jié)合性，發(fā)揮高的防感染效果。另外，如前述，由于對所有的流感病毒有高的結(jié)合性，故即使是同時流行多種的流感，或發(fā)生新的流感病毒的變異體，也可維持充分的結(jié)合性，在可發(fā)揮作為抗病毒劑或病毒吸附劑的性能方面可以說適用性比過去的直鏈狀糖鏈組高。
以下，列舉實施例對本申請發(fā)明更詳細(xì)地進(jìn)行說明。當(dāng)然，不用說本申請發(fā)明并不限定于以下的實施例。
實施例實施例1流感病毒受體候補(bǔ)分子的研究為了研究、鑒定成為流感病毒受體的分子，對于從用于病毒增殖的孵化雞蛋的漿尿膜及用于病毒分離或感染實驗的狗腎小管細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)中分離與A型及B型流感病毒進(jìn)行反應(yīng)的脂質(zhì)分子進(jìn)行了試驗。
I.實驗方法(1)材料流感病毒株使用示于表1的病毒株。
表1

此外，表中對N-乙酰神經(jīng)氨酸的結(jié)合特性，是基于采用III中后述的TLC/病毒結(jié)合分析測定與作為標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)(唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂)的反應(yīng)性結(jié)果的值。而，TLC/病毒結(jié)合分析是發(fā)明人確立的方法。(Suzuki，Y.，Nakau；T.，Ito，T.，Watanabe，W.，Toda.Y.，Xu，G.Y.，Suzuki，T.，Kobayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，Sugawara，K.，Nishimura，H.，Kitame，F(xiàn).，Nakamura，K.，Deya，E.，Kiso，M.，and Hasegawa，A.(1992)Virology 189，121-131；Guo，C.-T.，Wong，C.-H.，Hajimoto，T.，Miura，T.，Ida，Y.，Juneja，L.R.，Kim，M.-J.，Masuda，H.，Suzuki.T.，and Suzuki，Y.(1998)Glycoconjugate J.15.1099-1108)作為抗流感病毒抗體，使用示于以下表2中的抗體。
表2

*1一級抗體是本發(fā)明者們制作的家兔多克隆抗體。
*2anti-rabbit IgG-HRP從Santa Cruz Biotechnology公司購入、ProteinA從Cappel公司購入。
(2)流感病毒的精制把用PBS稀釋(A型流感病毒2-3～4；B型流感病毒2-1～0)的病毒懸浮液植入11日齡發(fā)育雞蛋漿尿腔內(nèi)0.2ml、34℃下培養(yǎng)48小時。
回收漿尿液后在4℃、4000rpm(HITACHI SCI 20B，RPRG旋轉(zhuǎn)器)下離心分離10分鐘，除去夾雜物。再在4℃、8000rpm條件下將上清液離心分離3小時，用PBS使顆粒懸浮成為粗病毒液。然后，在50％甘油(WAKO)-PBS中進(jìn)行粗病毒復(fù)層，在4℃、38000rpm(HITACHI CP65β，P40ST旋轉(zhuǎn)器)下離心分離2小時。再用PBS將得到的顆粒懸浮，在4℃、20000rpm條件下進(jìn)行90分鐘(HITACHI CP65β，P28S旋轉(zhuǎn)器)10-40％(W/V)蔗糖連續(xù)密度梯度離心分離。
回收病毒層，通過在4℃、8000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR18旋轉(zhuǎn)器)條件下離心分離3小時得到精制病毒。得到的病毒用PBS懸浮，在-80℃下進(jìn)行保存。
(3)紅細(xì)胞凝集活性(HAU)的測定在微型板(96U-bottom Wells，F(xiàn)alcon)上用0.01％明膠(nacalaitesque，Inc)-PBS50ml把稀釋210倍的精制流感病毒50μl進(jìn)行加倍稀釋。加0.5％(V/V)豚鼠紅細(xì)胞-PBS 50μl，在4℃靜置2小時后，觀察紅細(xì)胞的凝集。由于豚鼠紅細(xì)胞凝集，HAU采用所需的病毒的最高稀釋倍數(shù)表示。
(4)漿尿膜由來的反應(yīng)性脂質(zhì)的研究回收40個11日齡發(fā)育雞蛋的漿尿膜，用PBS洗滌后，進(jìn)行冷凍干燥(EYELA FDU-830)。在干燥重量1.81g的漿尿膜上加MilliQ水15ml，進(jìn)行均勻化。再加CHCl3/MeOH 60ml、提取1小時后，過濾提取液，用蒸發(fā)器餾去溶劑。加MeOH 60ml，使用バス式超聲波處理器(SILENTSONIC，SHARP)進(jìn)行超聲波處理后，用0.1N NaOH在37℃下進(jìn)行一夜水解。餾去溶劑后，加MilliQ水20ml，進(jìn)行超聲波處理，進(jìn)行透析(透析膜VLSKASESALES CORP)。
透析后，使冷凍干燥的樣品溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)20ml中，進(jìn)行超聲波處理，制成DEAE-Sephadex A-25柱色譜的樣品。DEAE-Sephadex A-25(Pharmacia Biotech)使用利用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)預(yù)活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)平衡化的譜柱。把樣品導(dǎo)入床容積(Bed volume)10ml的DEAE-Sephadex A-25中，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml使中性脂質(zhì)組分溶出后，用CHCl3/MeOH/0.8MNaOAc(30/60/8，v/v/v)100ml使酸性脂質(zhì)組分溶出。從溶劑中除去這些組分，進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行透析。
透析后，再把冷凍干燥的樣品中酸性脂質(zhì)組分的一半溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)0.75ml中，首先用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)平衡化，導(dǎo)入Iatrobeads(床容積3ml)(Iatron Laboratories，Inc)中。
首先，邊通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)15ml、邊每1ml地收集組分。然后通入CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)15ml、MeOH 15ml。收集這些組分中含目的糖脂質(zhì)的組分，溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)1ml中，通過后述的II(a)與III的TLC板的二次展開進(jìn)行分析。
首先在用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/5/1，v/v/v)平衡化的Iatrobeads(床容積25ml)中投入用CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)溶解的樣品2.5ml。采用對從125ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(5∶4∶1，v/v/v)形成125mlCHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)梯度的溶劑溶出，按每2.5ml餾分收集器(ADVAMTEC、SF-3120)進(jìn)行分取。對這些餾分采用后述的II(b)與III的分析方法測定A型(人、鳥)與B型病毒的反應(yīng)性。
對確認(rèn)結(jié)果的餾分，為了再進(jìn)行精制，把全部量投到HPTLC(MERCK、HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60)板上，用CHCl3/MeOH/12mmMgCl2/15M NH4OH(50/40/7/3，v/v/v/v)展開。用外科用小刀(KEISEIMEDICAL INDUSTRIAL CO.，LTD)刮取得到的4條帶。把刮取的帶分別加到CHCl3/MeOH/Milli Q水(5/4/1，v/v/v)1ml中進(jìn)行5分鐘超聲波處理后，采用過濾器進(jìn)行棉栓過濾。再向棉栓中通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)2ml與原來的濾液合并。餾去該溶劑后，加入CHCl3/MeOH(1/1，v/v)100μl，采用后述的II(c)與III的方法用TLC板進(jìn)行分析。
(5)來自MDCK細(xì)胞的反應(yīng)性脂質(zhì)的研究把MDCK細(xì)胞(10cm盤25張)培養(yǎng)匯合，進(jìn)行收集。把得到的細(xì)胞顆粒進(jìn)行冷凍干燥(干燥重量0.06g)，加MilliQ水600μl。再加CHCl3/MeOH(1/1，v/v)6ml，采用1500rpm(TOMY，LC-100)離心分離5分鐘，餾去所得上清液的溶劑。加MeOH 3ml，進(jìn)行超聲波處理后，用0.1N NaOH在37℃下進(jìn)行一夜水解。餾去溶劑后，加MilliQ水2.5ml，進(jìn)行超聲波處理，進(jìn)行透析。
透析后，使冷凍干燥的樣品溶解在CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)20ml中，進(jìn)行超聲波處理，制成DEAE-Sephadex A-25柱色譜的樣品。DEAE-Sephadex A-25使用利用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)預(yù)活化后，在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)中進(jìn)行置換的譜柱。向床容積10ml的DEAE-Sepbadex A-25中投入樣品，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml溶出中性脂質(zhì)組分。
然后用CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)100ml溶出酸性脂質(zhì)組分。餾去這些組分的溶劑，加MilliQ水2.5ml進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行透析。透析后，將冷凍干燥的酸性脂質(zhì)組分溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)100μl中，采用II(a)與III的TLC板的二次展開進(jìn)行分析。
II.TLC采用化學(xué)顯色試劑的檢測(a)二次展開塑料TLC板(MERCHEREY-NAGEL，Polygram Sil G)用丙酮展開后，投與得到的酸性脂質(zhì)組分和標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)(牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷脂)。將該TLC板用CHCl3/MeOH/88％HCOOH(65/25/10，v/v/v)一次展開后充分風(fēng)干，用CHCl3/MeOH/5N NH4OH進(jìn)行二次展開。將板風(fēng)干后，進(jìn)行苔黑酚-H2SO4試劑(1％(w/v)苔黑酚/2N H2SO4)噴霧，加熱到110℃、進(jìn)行糖的檢測。
二次展開的結(jié)果，對已確認(rèn)與病毒的反應(yīng)性的餾分，為了再進(jìn)行精制，將上述Iatrobeads柱色譜得到的組分與酸性脂質(zhì)組分其余的一半量合并再進(jìn)行Iatrobeads柱色譜精制。
(b)一次展開在塑料TLC板上投與制得的酸性脂組分與標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)(GSC-275、GSC-273、牛腦全部神經(jīng)節(jié)苷酯)用丙酮將該TLC板展開后，用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)進(jìn)行展開。將板風(fēng)干后，進(jìn)行苔黑酚-H2SO4試劑噴霧，加熱到110℃、進(jìn)行糖的檢測。
此外，GSC-275是以下[1]所示合成品的α2，6-唾液酰擬紅細(xì)胞苷脂、GSC-273是[2]所示的合成品的α2，3-唾液酰擬紅細(xì)胞苷脂。
Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4G1cβ1-OCH(C14H29)2····〔1〕Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-OCH(C14H29)2····〔2〕(c)一次展開在塑料TLC板上投與制得的糖脂質(zhì)組分與標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)(前述苔黑酚-H2SO試劑)。用丙酮將該TLC展開后，用CHCl3/MeOH/12mMMgCl2/15M NH4OH(50/40/7/3，v/v/v)進(jìn)行展開。將板風(fēng)干后，噴霧苔黑酚-H2SO4試劑，加熱到110℃，進(jìn)行糖的檢測。
III.TLC/病毒結(jié)合分析(virus-binding assay)使用1％卵清蛋白、1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)(東京化成)-PBS溶液(以下稱A液)在室溫下將與II(a)～(c)同樣地展開的TLC板振蕩1小時。用PBS在4℃、5分鐘、洗滌3次后，加入用PBS稀釋成HAU＝27的流感病毒懸浮液3ml，在4℃振蕩1夜。此外在Virus(-)中加入PBS代替病毒懸浮液。
將該溶液用PBS在4℃、5分鐘洗滌3次，加入用3％PVP-PBS溶液(以下稱B液)稀釋的一級抗體溶液3ml，在4℃振蕩2小時。用PBS將該板在4℃、5分鐘洗滌3次后，加用B液稀釋的二級抗體溶液3ml，在4℃振蕩2小時。然后，用PBS在4℃、5分鐘洗滌3次，加顯色基質(zhì)溶液(0.1M檸檬酸鹽緩沖劑pH6.0、0.5ml；在CH3CN中的0.11mM4-氯萘酚、100μl；在CH3CN中的0.06M DEPDA 100μl；100μl；30％H2O2，5μl)在室溫下進(jìn)行振蕩。顯色后，用精制水洗滌，進(jìn)行風(fēng)干。
IV.結(jié)果從孵化雞蛋的漿尿膜中提取脂質(zhì)，用TLC將酸性脂質(zhì)組分二次展開后，用作糖檢測試劑的苔黑酚-H2SO4試劑使之顯色(圖1c)。使同樣展開的板與A/PR/8/34(圖1d)、A/Aichi/2/68(圖1e)、B/Lee/40(圖1f)、B/Gifu/2/73(圖1g)反應(yīng)，確認(rèn)與病毒共同進(jìn)行反應(yīng)的地方。(圖中用箭頭表示)由移動度暗示出這種共同反應(yīng)的組分是與唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂不同的分子，是具有更長糖鏈結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。
此外，為了進(jìn)一步精制該餾分，進(jìn)行Iatrobeads柱色譜精制。把得到圖形示于圖2a。
對1～7組分，A型使用A/Memphis/1/71(圖2c)、A/PR/8/34(圖2d)、A/Aichi/2/68(圖2e)、A/Duck/313/4(圖2f)、A/Duck/92/1/76(圖2g)研究了反應(yīng)性，B型用B/Lee/40(圖2h)研究了反應(yīng)性。
與Neu5Acα2-6Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈進(jìn)行反應(yīng)的A/Memphis/1/71(圖2c)與組分2～6反應(yīng)，與用組分2的箭頭表示的帶非常窄。與Neu5Acα2-6Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)同程度地進(jìn)行結(jié)合的A/Aichi/2/68(圖2e)也與A/Memphis/1/71同樣，用組分2的箭頭所示的帶強(qiáng)烈進(jìn)行反應(yīng)。表明該帶也對A/Duck/313/4(圖2f)、A/Duck/92/1/76(圖2g)、B/Lee/40(圖2h)進(jìn)行反應(yīng)，不僅與人A型與B型流感病毒進(jìn)行反應(yīng)，而且也與H5、H9的鳥病毒進(jìn)行反應(yīng)。
此外，為了進(jìn)一步精制該反應(yīng)性脂質(zhì)，用HPTLC對組分2進(jìn)行刮取，結(jié)果得到如圖3a所示的圖。確認(rèn)該帶與A/Memphis/1/71(圖3b)、A/PR/8/34(圖3c)進(jìn)行反應(yīng)。
另一方面，同樣地也從MDCK細(xì)胞中提出脂質(zhì)，用TLC將酸性脂質(zhì)組分進(jìn)行二次展開后，用苔黑酚-H2SO4試劑使之顯色，結(jié)果得到如圖4a的圖。同樣地使展開的板與A/PR/8/34(圖4c)、A/Aichi/2/68(圖4d)、B/Lee/40(圖4e)、B/Gifu/2/73(圖4f)進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果看出箭頭表示的部分與全部的病毒共同地進(jìn)行反應(yīng)。
表明該反應(yīng)性脂質(zhì)是與漿尿膜上反應(yīng)的組分(圖1)同樣的移動度。
實施例2由實施例1確認(rèn)含在孵化雞蛋漿尿膜、MDCK細(xì)胞中的特定脂質(zhì)性分子與A型及B型流感病毒進(jìn)行反應(yīng)。為了研究該脂質(zhì)性分子的結(jié)構(gòu)或結(jié)合特異性，又大規(guī)模地進(jìn)行單獨分離、精制。最后將分離的脂質(zhì)性分子與流感病毒的結(jié)合特異性與作為過去所報道與病毒的結(jié)合性的標(biāo)準(zhǔn)糖酯質(zhì)的唾液酰擬紅細(xì)胞苷脂進(jìn)行了對比研究。
I.實驗方法(1)材料流感病毒株使用示于表3的病毒種。
表3

此外，表中對N-乙酰神經(jīng)氨酸的結(jié)合特性，是基于與采用實施例1所示的TLC/病毒結(jié)合分析測定的作為標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)的唾液基帕拉紅細(xì)胞糖苷酯反應(yīng)性結(jié)果的值。
此外，作為抗流感病毒抗體，使用示于以下表4所示的抗體。
表4

(2)從漿尿膜中精制目的脂質(zhì)從1150個11日齡發(fā)育雞蛋中采集漿尿膜，用PBS洗滌后進(jìn)行冷凍干燥。在干燥重量67.7g的漿尿膜上加丙酮800ml，進(jìn)行10分鐘超聲波處理。用均化器粉碎后在室溫下攪拌3小時。過濾提取液，在干燥的殘渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/5/1，v/v/v)2750ml，進(jìn)行10分鐘超聲波處理。攪拌一夜后，在過濾的殘渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)1200ml，攪拌2小時。
進(jìn)一步把濾液與先前的濾液合并，用蒸發(fā)器餾去溶劑。加MeOH300ml，進(jìn)行超聲波處理后，使最終濃度為0.1N NaOH地調(diào)制，在37℃進(jìn)行3.5小時水解，再在室溫下進(jìn)行一夜水解。采用制成最終濃度為0.1N的AcOH進(jìn)行中和后，餾去溶劑。加MilliQ水80ml，進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行透析。透析后，把冷凍干燥的樣品溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml中進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行過濾。再在殘渣中加入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)100ml，進(jìn)行2次同樣的操作。把3次的濾液合并作為DEAE-Sephadex A-25柱色譜的樣品。DEAE-Sephadex A-25使用通過CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)預(yù)活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)進(jìn)行平衡化的柱。
在床容積440ml的DEAE-Sephadex A-25中投入樣品，CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)201溶出中性脂質(zhì)組分。然后通入CHCl3/MeOH/0.05M NaOAc(30/60/8，v/v/v)91，制成一唾液酸性脂質(zhì)組分(Suzuki，Y.，Nakao，T.，Ito，T.，Watanabe，N.，Toda，Y，Xu，G.，Suzuki，T.，Kabayashi，T.，Kimura，Y.，Yamada，A.，etal，Virology，189，121-131(1992))。
一唾液、二唾液以上的組分加MilliQ水150ml進(jìn)行透析。透析后，將冷凍干燥的二唾液以上的組分溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)10ml中。為了進(jìn)一步精制二唾液以上的組分，采用Iatroheads柱色譜進(jìn)行分離。Iatrobeads使用通過CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)預(yù)活化的譜柱。把樣品投入床容積120ml的Iatrobeads中，通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(65/25/4，v/v/v)250ml。此時，使用餾分收集器收集100個各2.5ml的餾分，用HPTLC板進(jìn)行溶出組分的確認(rèn)。HPTLC板的展開溶劑使用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)進(jìn)行展開確認(rèn)。另外，采用與前述實施例1同樣的方法考察與病毒的反應(yīng)性，只收集有反應(yīng)性的組分。
把這些組分溶解在CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)1ml中，為了進(jìn)一步精制進(jìn)行再次Iatrobeads柱色譜分離。Iatrobeads使用通過CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)預(yù)活化的譜柱。
在床容積25ml的Iatrobeads中投入樣品，通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)75ml。此時用餾分收集器收集300個各0.25ml的組分。把這些組分投給HPTLC板，用CHCl3/MeOH/12Mm MgCl12(5/4/1，v/v/v)進(jìn)行展開映象(mapping)。
結(jié)果，由于CHCl3/MeOH/MilliQ水(5/4/1，v/v/v)不溶出目的脂質(zhì)性分子，故繼續(xù)通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(40/50/9，v/v/v)25ml，收集100個各0.25ml的組分。
把這些組分投給HPTLC板，用CHCl3/MeOH/12mM MgCl12(5/4/1，v/v/v)展開20cm，用外科用小刀刮取出現(xiàn)的5個譜帶。把各個譜帶分別用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)40ml進(jìn)行提取，進(jìn)行5分鐘超聲波處理。然后為了除去硅膠，進(jìn)行棉栓過濾，餾去溶劑。溶解在CHCl3/MeOH(8/2，v/v)1ml中，進(jìn)行Iatrodesds柱色譜分離。Iatrobeads使用CHCl3/MeOH(8/2，v/v)進(jìn)行活化，形成床容積1ml。投入樣品后，通入CHCl3/MeOH(8/2，v/v)15ml、繼續(xù)通入CHCl3/MeOH/Milli Q水(30/60/8，v/v/v)20ml。餾去用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)溶出的餾分的溶劑，溶解在CHCl3/MeOH(1/1，v/v)200μl中。把得到的餾分投給HPTLC板，使用展開溶劑CHCl3/MeOH/12mM MgCl12(5/4/1，v/v/v)展開，用苔黑酚-H2SO4試劑使之顯色。
把這些組分命名為AM1～5作為最終精制樣品。對AM1～5，把與A型及B型流感病毒的結(jié)合特異性、和作為標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)的唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂進(jìn)行比較。
II.結(jié)果把對二唾液以上的餾分進(jìn)行第1次Iatrobeads柱色譜分離的結(jié)果示于圖5。
在TLC板上將溶出組分展開，使用作為檢測糖試劑的苔黑酚-H2SO4試劑使之顯色。對得到的1～7餾分，考察與病毒的反應(yīng)性，把結(jié)果示于圖6。A/Aichi/2/68(圖6c)與餾分4與5強(qiáng)烈進(jìn)行反應(yīng)，A/Memphis/1/71(圖6d)與餾分4、5、6反應(yīng)最強(qiáng)。由于圖5的箭頭表示的部分表明反應(yīng)特別強(qiáng)烈，故將大量含有該部分的餾分4～6貯存，進(jìn)行第2次的Iatrobeads柱色譜分離。
把得到的圖示于圖7。由于箭頭表示的部分含有目的糖脂質(zhì)特別多，故收集餾分5和6再進(jìn)行精制。
此外，餾分5和6分別進(jìn)行精制，以下只對餾分6用HPTLC板展開20cm。結(jié)果擴(kuò)展面上出現(xiàn)的譜帶表示是至少5種糖脂質(zhì)的混合物。此外，刮取這5種譜帶，除去硅膠后，考察糖的顯色。把得到的圖示于圖8。把這5種餾分命名為AM1～5，作為最終精制樣品，將與A型及B型流感病毒的結(jié)合特異性，和作為標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)的唾液?；鶖M紅細(xì)胞糖苷脂進(jìn)行比較。
對于AM1～5，A型使用A/Aichi/2/68，A/PR/8/34，A/Memphis/1/71進(jìn)行了研究。與Neu5Acα2-3Gal和Neu5Acα2-6Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)同程度結(jié)合的A/Aichi2/6，與AM1～5所有的脂質(zhì)性分子反應(yīng)，與AM1的箭頭移動度中所觀察的譜帶、及AM3、4強(qiáng)烈地反應(yīng)(圖9c)。
此外，圖9可以采用實施例3中后述的方法進(jìn)行質(zhì)量分析。對于AM1、3、4，與投入作為標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)的α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂、α2-6唾液帕拉細(xì)胞糖苷脂的量相同。若與標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)進(jìn)行比較，則AM1箭頭的譜帶比α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂反應(yīng)稍強(qiáng)。AM3、4大致與α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂同等強(qiáng)度地進(jìn)行結(jié)合。
另一方面，只與Neu5Acα2-3Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合的A/PR/8/34(圖9d)與A/Aichi/2/68(圖9c)同樣地與AM1的箭頭的譜帶強(qiáng)烈地進(jìn)行反應(yīng)。因此，這顯示出比α2-3唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂具有非常強(qiáng)的流感病毒結(jié)合性。另外，與A/Aichi/2/68(圖9c)不同，與自AM1到5的上方的移動度所觀察的譜帶不進(jìn)行反應(yīng)。此外，只與Neu5Acα2-6Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合的A/Memphis/1/71(圖9e)顯示出與A/Aichi/2/68(圖9c)相似的圖。
AM1類似與Aichi/2/68、A/PR/8/34相同地反應(yīng)，該反應(yīng)性比α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂稍弱。AM3、4與α2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂同程度地、或更強(qiáng)地進(jìn)行反應(yīng)。這些結(jié)果說明AM1的箭頭譜帶共同地與3種病毒強(qiáng)烈地進(jìn)行反應(yīng)，該反應(yīng)性與標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)同程度或比該程度強(qiáng)。
另外，對于AM1～5，把測定與B型流感病毒反應(yīng)性的結(jié)果示于圖10。與Neu5Ac2～3Gal及Neu5Acα2-6Gal結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)同程度地進(jìn)行結(jié)合的B/Gifu/2/23(圖10c)與1～5所有的餾分進(jìn)行反應(yīng)。并看出AM1的箭頭的譜帶也與A型的3種病毒同樣地進(jìn)行反應(yīng)。AM1比標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)的α2-3Rα2-6唾液酰擬紅細(xì)胞糖苷脂反應(yīng)強(qiáng)。另外，與AM1～3上方的移動度中觀察的譜帶不反應(yīng)。
實施例3 采用質(zhì)量分析法解析AM1、3、4的結(jié)構(gòu)為了解析AM1～5中可質(zhì)量分析的AM1、3、4的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行ESI(eletrospray ionization)-FTMS(Fourier transform ion resonancemass spectrometer)測定與SIMS(Secondary ion mass spectroscopy)-FTMS測定(均用BioAPEX(Bruker instruments)。
I.實驗(1)ESI-FIMS把AM1、3、4的各樣品溶解于甲醇(3pmol/μl)中，使用微量注射泵、按1μl/分的流速進(jìn)行噴霧。調(diào)制圓筒、內(nèi)板、毛細(xì)管等的ESI高電壓控制器或噴嘴后，采用陰離子型進(jìn)行測定。
(2)SIMS-FTMS把樣品溶解在CHCl3/MeOH(2/1，v/v)中，取出其中一定的量(300pmol)與基質(zhì)(三乙醇胺)混合后，采用加速電壓10kv、陰離子型進(jìn)行測定。
II.結(jié)果確認(rèn)可認(rèn)為與分子量相關(guān)離子峰的m/z 2195[M+Na-2H]-和從中脫掉1個唾液酸[-NeuAc-Na]的m/z 1882[M-NeuAc-H]-。此外，確認(rèn)作為與唾液酸相關(guān)峰的m/z 290[NeuAc]-、m/z 308[NeuAc]-在低分子域。另外，確認(rèn)m/z 1086[M-2H]2-在2價離子域，由于由此計算的分子量與先前所述的與分子量相關(guān)離子峰的質(zhì)量數(shù)一致，故暗示可含二個唾液酸。
有關(guān)這2個唾液酸的結(jié)合，解析GD1a與GD1b的譜圖作為參考，結(jié)果在具有GD1b的NeuAc-NeuAc中所確認(rèn)的m/z 581、m/z 603在AM1中沒有，因此可認(rèn)為這些唾液酸分別單獨地與中性糖進(jìn)行結(jié)合。另外，與分子量相關(guān)的離子峰m/z2195表明是神經(jīng)酰胺(LCB181-FA160)、中性糖6個(己糖4個、己糖胺2個)、唾液酸2個、1個Na的付加組合。
此外，由SIMS-FTMS測定也確認(rèn)出相當(dāng)于神經(jīng)酰胺的m/z 536(LCB181-FA160)。另外，還確認(rèn)出相當(dāng)于對該神經(jīng)酰胺一個一個地付加1個己糖的峰m/z 698、m/z 860，又確認(rèn)出相當(dāng)于付加己糖胺的峰m/z1063，相當(dāng)于付加己糖的峰m/z 1225。因此表明AM1有乳糖胺骨架。
由以上，從成為流感病毒宿主的孵化雞蛋漿尿膜中成功地分離成為受體候補(bǔ)的分子。另外，由結(jié)構(gòu)解析確認(rèn)該受體分子是下式(1)表示的結(jié)構(gòu)。
(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Hex表示己<p>

<p>*3括號內(nèi)表示實驗使用的稀釋倍率(2)流感病毒的精制把用滅菌PBS稀釋的病毒懸浮液(A型流感病毒稀釋成紅細(xì)胞凝集活性(HAU)＝2-3～-4，B型流感病毒稀釋成紅細(xì)胞凝集活性(HAV)＝2-1～0)0.2ml植入11日齡發(fā)育雞蛋漿尿腔內(nèi)、在34℃下培養(yǎng)48小時。
回收漿尿液后，在40℃、4000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR9旋轉(zhuǎn)器)下離心分離10分鐘，除去夾雜物。再將上清液在4℃、8000rpm下離心分離3小時，用PBS將顆粒懸浮成為粗病毒液。然后，把粗病毒液復(fù)層在50％甘油-PBS溶液中，在4℃、38000rpm(HITACHI CP65β，p40ST旋轉(zhuǎn)器)下離心分離2小時。
用PBS將得到的顆粒懸浮，在4℃、15000rpm條件下進(jìn)行離心分離1小時，再用PBS將得到顆粒懸浮后，在4℃、20000rpm下進(jìn)行90分鐘(HITACHI CP65β，p28S旋轉(zhuǎn)器)10-40％(W/V)蔗糖連續(xù)密度梯度離心分離?；厥詹《咀V帶，在4℃、8000rpm(HITACHI SCR 20B，RPR18旋轉(zhuǎn)器)離心分離3小時制得精制病毒。
得到的病毒用PBS懸浮，在-80℃下保存。
(3)HAU測定用0.01％明膠(nacalai tesque，Inc)-PBS50μl把稀釋210倍的精制流感病毒50μl在微型板(96U-bottom wells，F(xiàn)alcon)上加倍稀釋，加0.5％(V/V)豚鼠紅細(xì)胞-PBS 50μl，在4℃靜置2小時后，觀察紅細(xì)胞的凝集。HAU用為了豚鼠紅細(xì)胞凝集所需要的病毒的最高稀釋倍數(shù)表示。
(4)從孵化雞蛋漿尿膜中制備二唾液糖脂質(zhì)組分從120個11日齡孵化雞蛋中采集漿尿膜，用PBS洗滌后，進(jìn)行冷凍干燥。在干燥漿尿膜中加入丙酮100ml，進(jìn)行超聲波處理10分鐘。用均化器粉碎后，在室溫下攪拌3小時，過濾得到的提取液使殘渣干燥后，向該殘渣中加660ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(5∶5∶1，v/v/v)，進(jìn)行10分鐘超聲波處理。
攪拌一夜后過濾，向殘渣中加CHCl3/MeOH/MilliQ水(30∶60∶8，v/v/v)300ml攪拌2小時。把濾液與先前的濾液合并，用蒸發(fā)器餾去溶劑。向干燥物中加MeOH50ml進(jìn)行超聲波處理充分懸浮后，加NaOH溶液使最終濃度為0.1N，在37℃水解3.5小時，再在室溫下水解一夜。加AcOH使最終濃度為0.1N后，餾去溶劑。向干固物中加MilliQ水25ml進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行透析。透析后，把冷凍干燥的樣品溶解在50ml CHCl3/MeOH/MilliQ水(30∶60∶8，v/v/v)中進(jìn)行超聲波處理后，進(jìn)行過濾。
再向殘渣中加CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)20ml進(jìn)行同樣的操作，把2次的濾液合并，作為DEAE-Sephadex A-25柱色譜用的樣品。DEAE-Sephadex A-25使用通過CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)預(yù)活化后，用CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)平衡化的譜柱。把樣品供給床容積100ml的DEAE-Sephadex A-25柱。然后向柱中通入CHCl3/MeOH/MilliQ水(30/60/8，v/v/v)3L溶出中性脂質(zhì)組分。
然后，向柱中通入CHCl3/MeOH/0.05M NaOAc(30/60/8，v/v/v)3.5L，溶出一唾液酸性脂質(zhì)組分。再向柱中通入CHCl3/MeOH/0.8M NaOAc(30/60/8，v/v/v)2L，溶出二唾液以上的酸性脂質(zhì)組分。一唾液與二唾液以上的組分分別用蒸發(fā)器餾去溶劑。分別在一唾液成分中加MilliQ水20ml、在二唾液以上的組分中加MilliQ水20ml，進(jìn)行透析。透析后，把冷凍干燥的各組分溶解于CHCl3/MeOH(1∶1，v/v)1000μl中。對兩組分采用TLC/病毒結(jié)合分析研究與流感病毒的結(jié)合性。
(5)TLC/病毒結(jié)合分析(virus binding assay)在塑料TLC板上，涂布從孵化雞蛋漿尿膜中采用DEAE-Sephadex A-25柱色譜制備的一唾液、二唾液組分與標(biāo)準(zhǔn)糖脂質(zhì)后，將該板用丙酮展開，風(fēng)干，沿相同方向用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(5/4/1，v/v/v)連續(xù)地展開。風(fēng)干。將該板在含有1％卵清蛋白、1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)(東京化成)的PBS溶液(以下，稱溶液A)中在室溫下振蕩1小時，用冷PBS在4℃、5分鐘條件下洗滌3次。然后添加用PBS稀釋的流感病毒懸浮液4ml使HAU＝27，在4℃下振蕩一夜。此外，對virus(-)加PBS代替病毒懸浮液。在4℃、5分鐘下用冷PBS洗滌3次后，加入用含有3％PVP的PBS溶液(以下稱溶液(B)稀釋的一級抗體溶液4ml，在4℃振蕩2小時，用冷PBS在4℃、5分鐘洗滌3次后，加入用溶液B稀釋的二級抗體溶液4ml，在4℃振蕩2小時。反應(yīng)后，用冷PBS在4℃、5分鐘，洗滌3次，加顯色基質(zhì)溶液(0.1M檸檬酸鹽緩沖劑pH6.0、5mL；CH3CN中0.11M4-氯萘酚、100μl；CH3CN中0.06M DEPDA 100μl；30％H2O2，5μl)，在室溫下進(jìn)行振蕩。顯色后，用精制水洗滌板，進(jìn)行風(fēng)干。
在另外展開、風(fēng)干的板上噴霧苔黑酚-H2SO4試劑，加熱到110℃，進(jìn)行糖的檢測。同樣地，在另外的板上噴霧間苯二酚-HCl試劑進(jìn)行加熱，進(jìn)行唾液酸的檢測，用密度計(SHIMADZU)定量各譜帶成分的含量。
II.實驗結(jié)果把由孵化雞蛋的漿尿膜得到的酸性糖脂質(zhì)組分(一唾液與二唾液組分)涂在TLC上展開，用間苯二酚-HCl試劑使之顯色，測定含在各種組分中的成分存在量。觀察示于圖11a與圖11b中的TLC圖形。利用密度計定量，算出各成分的存在比(示于圖11b板的兩側(cè))。同樣地，使點樣展開各組分的板分別與A/PR/8/34(HIN1)、A/Aichi/2/68(H3N2)、A/Memphis/1/71(H3N2)的病毒株進(jìn)行反應(yīng)(圖11e～g)。
結(jié)果說明圖中箭頭所示部分存在的高極性糖脂質(zhì)與全部的病毒進(jìn)行反應(yīng)。
本發(fā)明人已從二唾液組分中分離出受體候補(bǔ)分子，通過以上，箭頭所表示的物質(zhì)由于其移動度極接近候補(bǔ)分子，因此暗示是受體候補(bǔ)分子成分。
此外，由采用間苯二酚-HCl試劑的板經(jīng)密度計定量看出，這次制備的二唾液組分中所含的受體候補(bǔ)分子是1％以下(唾液酸量比)。
實施例5對各種流感病毒的感染阻礙活性I.實驗方法采用LDH試驗法測定流感病毒感染阻礙活性在96孔培養(yǎng)用微型板(Nunc)上加入MDCK細(xì)胞使之為2×104cells/孔，在含有10％FCS的MEM培養(yǎng)基100μl中，37℃、5％CO2存在下培養(yǎng)20～24小時。
然后，把孵化雞蛋的漿尿膜制得的二唾液組分分別用無血清MEM培養(yǎng)基稀釋成50μl，使最終濃度的總唾液酸量分別為0.1，0.3，1，3，10μM，同樣地加無血清MEM培養(yǎng)基稀釋的流感病毒液和作為對照物加不含病毒液的無血清MEM培養(yǎng)基50μl，在4℃進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1小時。
確認(rèn)細(xì)胞變成匯合的單層后，用無血清培養(yǎng)基100μl將細(xì)胞洗滌3次，加預(yù)培養(yǎng)的病毒液與無血清培養(yǎng)基100μl，在34.5℃、5％CO2存在下靜置4小時感染病毒。
感染后，除去上清液，用無血清MEM培養(yǎng)基100μl洗滌1次后加入含5％FCS MEM培養(yǎng)基100μl，在34.5℃、5％CO2存在下培養(yǎng)20～24小時。在新的微型板上(96Flat-Bottom Maxisorp，Nunc)加入(5X)PBS10μl，加20～24小時培養(yǎng)的細(xì)胞上清液40μl進(jìn)行混合，在37℃培養(yǎng)5分鐘后，加LDH測定試劑(シノテスト公司制)50μl混合在37℃反應(yīng)10分鐘。
加0.5N HCl 100μl使反應(yīng)停止，通過微量反應(yīng)板讀數(shù)器(MTP-32，corona公司)按測定波長550nm、對照波長415nm測定各孔的吸光度。由于病毒感染產(chǎn)生細(xì)胞障礙性，結(jié)果，培養(yǎng)上清液中放出細(xì)胞內(nèi)酶LDH。通過對LDH進(jìn)行測定可評價病毒的感染性。
把對照樣品(只是不含任何試驗樣品的病毒)的上清液中的LHD活性為100％時，各濃度的含二唾液組分樣品上清液中LDH活性的相對值作為阻礙活性的指標(biāo)。
II.實驗結(jié)果把由漿尿膜得到的二唾液組分預(yù)培養(yǎng)成病毒液，通過LDH活性測定研究對MDCK細(xì)胞的病毒感染性的影響。只加病毒液時的LDH活性為100％，把添加各濃度的二唾液組分時的相對活性示于圖12。
二唾液組分對A/PR/8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)的TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量的50％、50％阻礙濃度)是1μM(唾液酸濃度)，A/Memphis/1/71(H3N2)、B/Lee/40的TCID50是3μM(唾液酸濃度)。
這里，如果與前述的TLC/病毒結(jié)合分析的結(jié)果(圖11)進(jìn)行比較來看，可認(rèn)為是對各病毒一樣有結(jié)合性的糖脂質(zhì)，即受體物質(zhì)為實際的二唾液組分中的阻礙活性物質(zhì)，該量表明是二唾液組分中總唾液酸量的1～10％以下。
由以上暗示，支鏈狀唾液糖鏈?zhǔn)荏w糖脂質(zhì)實際上是0.1～0.3μM以下的微量，表明可以發(fā)揮阻礙病毒對MDCK細(xì)胞感染的效果。
迄今報道的有病毒結(jié)合活性的化合物的流感病毒感染阻礙效果(TCID50)是10μM數(shù)量級，相比之下，說明含在孵化雞蛋漿尿膜中二唾液組分的支鏈狀唾液糖鏈?zhǔn)荏w糖脂質(zhì)顯示出相當(dāng)高的抗流感病毒活性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如以上詳細(xì)地說明，本申請發(fā)明提供新型支鏈狀唾液糖分子。該化合物由于可以與來自所有的人與動物的A型流感病毒與B型流感病毒結(jié)合，因此可以對付流感病毒宿主范圍的變異或抗原性的變異，作為可阻止所有流感病毒感染的醫(yī)藥品或除去病毒用過濾器等的吸附劑的使用性高。
權(quán)利要求
1.新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，其是下式(I)所示的結(jié)構(gòu)， 式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Hex表示己糖，HexNAc表示N-乙酰己糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基。
2.權(quán)利要求1的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖通過天然的鄰位糖苷鍵進(jìn)行結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖的結(jié)合是化學(xué)性變換的結(jié)合。
4.權(quán)利要求3的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與己糖的結(jié)合形態(tài)是S-糖苷鍵或Se-糖苷鍵。
5.新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，其是下述(II)所示的結(jié)構(gòu)， 式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或酰基化學(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示乙酰葡糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基。
6.新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，其是下式(III)所示的結(jié)構(gòu)， 式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或?；瘜W(xué)性修飾的N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal表示半乳糖，GalNAc表示N-乙酰半乳糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基。
7.權(quán)利要求5或6的任何一項的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖通過天然的鄰位糖苷鍵進(jìn)行結(jié)合。
8.權(quán)利要求5或6的任何一項的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖的結(jié)合是化學(xué)性變換的結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的新型支鏈狀唾液糖分子，其特征在于，N-乙酰神經(jīng)氨酸與半乳糖的結(jié)合形態(tài)是S-糖苷鍵或Se-糖苷鍵。
10.抗病毒劑，其特征在于，至少含有權(quán)利要求1～9的任何一項的新型支鏈狀唾液糖分子作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供下式(I)表示的新型支鏈狀唾液糖分子，所述唾液糖分子是作為對付流感病毒的宿主范圍的變異或抗原性的變異、可阻止來自所有的人與動物的A型流感病毒與B型流感病毒感染的醫(yī)藥品或除去病毒用過濾器等的吸附劑使用的物質(zhì)。(式中，NeuAc表示該NeuAc的羥基、羧基與酰胺基可以相同或分別不同地被鹵素、烷基或酰基化學(xué)性修飾的N－乙酰神經(jīng)氨酸，Hex表示己糖、HexNAc表示乙酰己糖胺，R是選自氫原子、烴鏈、糖鏈、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、合成高分子的基質(zhì)，R也可以有取代基。另外，N－乙酰神經(jīng)氨酸與己糖的結(jié)合可以是天然存在的鄰位糖苷鍵，也可以是S－糖苷、Se－糖苷鍵等的化學(xué)性變換的結(jié)合。)
文檔編號C07H3/06GK1639199SQ0380515
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月4日
發(fā)明者鈴木康夫, 左一八 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)