一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體蛋白、t淋巴細(xì)胞及nk細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體蛋 白、T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞。
【背景技術(shù)】 [0002] 腫瘤的免疫細(xì)胞治療是腫瘤研究領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)，從利用抗體為導(dǎo) 向的革G向治療到以活化免疫細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)繼免疫治療，在腫瘤的免疫治療上都取得 了一定的理論和實(shí)踐的積累。但從總體上看，迄今為止，免疫治療效果仍不能達(dá)到徹底清除 體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的目的。導(dǎo)致免疫治療效果欠佳主要的原因之一就是免疫效應(yīng)細(xì)胞缺乏特異 識(shí)別腫瘤細(xì)胞的靶向性。因此，將抗體的導(dǎo)向作用與免疫細(xì)胞的殺傷作用相結(jié)合，是腫瘤過(guò) 繼免疫治療的一個(gè)重要研究方向。
[0003] 近年來(lái)，一種稱(chēng)為CAR-T(chimericantigenreceptorTcell,CAR-T)和 CAR-NK(chimericantigenreceptorNKcell,CAR-NK)的免疫治療正是這種研究所取得的 重要成果。以CAR-T為例，其機(jī)理就是從患者自身血液收集T細(xì)胞，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因工程 處理，使T細(xì)胞表面表達(dá)出能夠識(shí)別特異性腫瘤抗原的特殊受體，這種受體被稱(chēng)為嵌合抗 原受體（chimericantigenreceptor,CAR)，同時(shí)在受體的胞內(nèi)段加上引起T細(xì)胞活化的 信號(hào)傳遞區(qū)域。CAR是一種蛋白質(zhì)受體，可使T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特定蛋白質(zhì)（抗 原），表達(dá)CAR的T細(xì)胞可識(shí)別并結(jié)合腫瘤抗原，進(jìn)而攻擊腫瘤細(xì)胞。這種表達(dá)CAR的T細(xì) 胞被稱(chēng)為CAR-T。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)生長(zhǎng)，達(dá)到數(shù)十億之多將擴(kuò)增后的 CAR-T細(xì)胞注入到患者體內(nèi)，注入之后的T細(xì)胞也會(huì)在患者體內(nèi)增殖，并殺死具有相應(yīng)特異 性抗原的腫瘤細(xì)胞。
[0004] 以識(shí)別⑶19抗原受體為靶向的CAR-T治療在B淋巴細(xì)胞瘤治療中取得了顯著療 效，并且正在嘗試用于實(shí)體瘤。雖然CAR-T的這些初步結(jié)果令人鼓舞，但是CAR-T細(xì)胞的關(guān) 鍵在于其識(shí)別腫瘤的特異性受體。在實(shí)體瘤的CAR-T治療上能否取得突破性的進(jìn)展將主要 取決于受體的特異性。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量的前期驗(yàn)證和比較，篩選到了一種具有特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體 蛋白，該受體蛋白的發(fā)現(xiàn)有望可以為進(jìn)一步拓寬CAR-T以及CAR-NK在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用打 下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種可提高CAR-T和 CAR-NK在實(shí)體瘤中的殺瘤活性的受體蛋白、T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] -種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體蛋白，編碼所述受體蛋白的核苷酸序列為：SEDID N0:l〇
[0009] 進(jìn)一步，所述受體蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明還公開(kāi)了一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞，其表達(dá)氨基酸序 列為SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞，其由氨基酸序列為 SEDIDN0:2的受體蛋白基因構(gòu)建在CAR-T的表達(dá)載體上，通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病 毒顆粒，進(jìn)行轉(zhuǎn)染即可。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明還公開(kāi)一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的NK細(xì)胞，其表達(dá)氨基酸序列為 SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的NK細(xì)胞，其由氨基酸序列為SED IDN0:2的受體蛋白基因構(gòu)建在CAR-NK的表達(dá)載體上，通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒 顆粒，進(jìn)行轉(zhuǎn)染即可。
[0014] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體蛋白的制備方法，所述制備方法包 括：
[0015] 先提取抗肝癌的單克隆雜交瘤細(xì)胞的RNA，然后用單克隆抗體的特異性引物進(jìn)行 RT-PCR，將抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)DNA片段克隆到T載體上，測(cè)序，獲得特異性識(shí)別腫瘤 細(xì)胞的受體蛋白。
[0016] 更進(jìn)一步，本發(fā)明還公開(kāi)一種抗肝癌的單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，所述制備 方法包括以下步驟：
[0017] 采用肝癌組織作為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，然后取免疫處理后的小鼠脾臟，獲得B 淋巴細(xì)胞，再選取骨髓瘤細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)促溶劑實(shí)現(xiàn)融合，通過(guò)HAT培 養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選完成融合的異核體雜交瘤，并通過(guò)ELISA抗體分析篩選獲得單克隆雜交 瘤細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選到一種特異性識(shí)別腫瘤 細(xì)胞的受體蛋白，該受體蛋白構(gòu)建在CAR-T或CAR-NK的表達(dá)載體上，得到T淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞。在CAR-T和CAR-NK的細(xì)胞免疫治療中，可以顯著提高T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤活性（~ 40% )以及NK細(xì)胞殺傷腫瘤活性（~50% )。
【具體實(shí)施方式】 [0019] 下面結(jié)合對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本 發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此 外，在以下說(shuō)明中，省略了對(duì)公知技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0021] 本發(fā)明提供一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體蛋白，編碼所述受體蛋白的核苷酸序列 為：SEDIDN0:1。
[0022] 進(jìn)一步，所述受體蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明還公開(kāi)了一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞，其表達(dá)氨基酸序 列為SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 本發(fā)明所述的一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞，其由氨基酸序列為SEDID N0:2的受體蛋白基因構(gòu)建在CAR-T的表達(dá)載體上，通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒顆粒， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染即可。
[0026] 本實(shí)施例構(gòu)建在CAR-T的表達(dá)載體上的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的體外實(shí) 驗(yàn)如下：
[0027] 利用常規(guī)的慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝出含CAR_MH(氨基酸序列為SEDIDN0:2的受 體蛋白基因）-T的假病毒顆粒。
[0028] 通過(guò)流式細(xì)胞分選，獲得健康人⑶8+T細(xì)胞。
[0029] 將包裝好的CAR-MH-T假病毒顆粒對(duì)⑶8+T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得表達(dá)CAR-MH-T的T 淋巴細(xì)胞（識(shí)別腫瘤的靶向T細(xì)胞）。
[0030] 取96孔培養(yǎng)板，設(shè)置2組，分別為CAR-MH-T細(xì)胞孔和CD8+T細(xì)胞孔，每組12孔。 每孔分別加入20萬(wàn)個(gè)表達(dá)CAR-MH-T的T淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）或⑶8+T細(xì)胞（效應(yīng)細(xì) 胞）后，再分別加入2萬(wàn)個(gè)肝癌細(xì)胞HEPG2 (靶細(xì)胞），并控制每孔終體積為200yL。同時(shí)設(shè) 置三個(gè)對(duì)照孔，分別為只含有20萬(wàn)個(gè)效應(yīng)細(xì)胞和2萬(wàn)個(gè)靶細(xì)胞的對(duì)照孔，每孔體積同樣為 200yL。37°CC02培養(yǎng)箱4h，每孔加入20yLMTT細(xì)胞活性檢測(cè)試劑，37°CC0 2培養(yǎng)箱2h， 550nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，計(jì)算殺傷率。殺傷率（％ ) =〔1一（0De+t-0De)/0Dt〕X100%;其 中，0隊(duì)為：?jiǎn)渭冃?yīng)細(xì)胞孔的0D值；0Dt:單純靶細(xì)胞孔孔的0D值；0D 效應(yīng)細(xì)胞加靶細(xì) 胞孔的0D值；0D值為opticaldensity(光密度）的縮寫(xiě)，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度， 又稱(chēng)吸光度。
[0031] 采用類(lèi)似上述的方法分別檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、胃癌細(xì)胞MGC-803的殺傷 率。檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
[0032] 表1表達(dá)CAR-MH-T的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷活性
[0033]
[0034] 根據(jù)表1的檢測(cè)數(shù)據(jù)，通過(guò)顯著性分析可以看出，表達(dá)CAR-MH-T的T淋巴細(xì)胞對(duì) 三種腫瘤細(xì)胞的殺傷活性均明顯高于對(duì)照組⑶8+T的殺傷活性，且均提高30%以上。
[0035] 本實(shí)施例構(gòu)建在CAR-T的表達(dá)載體上的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的小鼠實(shí) 驗(yàn)如下：
[0036] 小鼠實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合免疫缺陷的小鼠一"SCID小鼠"作為動(dòng)物模型。SCID小鼠分為 3個(gè)組（肝癌細(xì)胞+CAR-MH-T細(xì)胞組、肝癌細(xì)胞+⑶8+T細(xì)胞組以及空白對(duì)照組），每組4只。 每只小鼠左大腿背側(cè)皮下分別接種3X106個(gè)HEPG2細(xì)胞。HEPG2細(xì)胞接種后第3天，每只 小鼠尾靜脈注射1X107的MH-T細(xì)胞或⑶8 +T細(xì)胞，空白對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。每 間隔4天，每只小鼠尾部靜脈注射對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞1X107。20天后測(cè)量瘤體體積，比較各 組瘤體體積的差別。
[0037] 在SCID小鼠模型中測(cè)定免疫細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、胃癌細(xì)胞MGC-803的殺傷 活性與上述方法相同。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0038] 表2表達(dá)CAR-MH-T的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的在小鼠體內(nèi)殺傷活性（n= 4,x±s,mm3)
[0039]
[0040] 從表2可以看出，表達(dá)CAR-MH的T淋巴細(xì)胞抑制小鼠體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)的活性明顯高 于普通的⑶8+T淋巴細(xì)胞。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 本實(shí)施例公開(kāi)一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的NK細(xì)胞，其表達(dá)氨基酸序列為SEDID NO:2的受體蛋白基因。
[0043] 具體的，所述一種特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的NK細(xì)胞，其由氨基酸序列為SEDIDN0:2 的受體蛋白基因構(gòu)建在CAR-NK的表達(dá)載體上，通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒顆粒，進(jìn) 行轉(zhuǎn)染即可。
[0044] 其中，所述慢病毒轉(zhuǎn)染包括以下步驟：
[0045] 1)、取1. 5mL滅菌EP管，加入混合質(zhì)粒以及250yL的無(wú)血清培養(yǎng)基；輕柔混勻，室 溫孵育5min。
[0046] 2)、取1. 5mL滅菌EP管，取9yL脂質(zhì)體溶于250yL無(wú)血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻， 室溫孵育5min。
[0047] 3)、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勾，室溫孵育20min。
[0048] 4)、DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入293T細(xì)胞中，細(xì)胞數(shù)量為1X106個(gè)，37°CC0J?箱中 孵育過(guò)夜。
[0049] 5)、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以2mL慢病毒培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，觀 察細(xì)胞融合狀況。
[0050] 6)、48-72h收獲含病毒的上清。3000rpm離心20min，去除沉淀，用0. 45ym的微孔 濾膜過(guò)濾。
[0051] 7)、將待轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞培養(yǎng)于不含抗生素的培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度約為30% ;
[0052] 8)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞：在2X105/mLNK細(xì)胞中加入終濃度為6yg/mL的聚凝胺和適量病 毒，充分混勻。
[0053] 9、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。
[0054] 本實(shí)施例構(gòu)建在CAR-NK的表達(dá)載體上的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的體外實(shí)驗(yàn) 如下：
[0055] 利用常規(guī)的慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝出含CAR-MH(氨基酸序列為SEDIDN0:2的受 體蛋白基因）-NK的假病毒顆粒。
[0056] 通過(guò)流式細(xì)胞分選，獲得健康人⑶56+NK細(xì)胞。
[0057] 將包裝好的CAR-MH-NK假病毒顆粒對(duì)CD56+NK細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得表達(dá)CAR-MH-NK 的NK細(xì)胞（識(shí)別腫瘤的靶向NK細(xì)胞）。
[0058] 取96孔培養(yǎng)板，設(shè)置2組，分別為CAR-MH-T細(xì)胞孔和CD8+T細(xì)胞孔，每組12孔。 每孔分別加入20萬(wàn)個(gè)表達(dá)CAR-MH-NK的NK淋巴細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）或⑶56+T細(xì)胞（效應(yīng) 細(xì)胞）后，再分別加入2萬(wàn)個(gè)肝癌細(xì)胞HEPG2 (靶細(xì)胞），并控制每孔終體積為200y L。同 時(shí)設(shè)置三個(gè)對(duì)照孔，分別為只含有20萬(wàn)個(gè)效應(yīng)細(xì)胞和2萬(wàn)個(gè)靶細(xì)胞的對(duì)照孔，每孔體積同 樣為200y L。37°CC02培養(yǎng)箱4h，每孔加入20y L MTT細(xì)胞活性檢測(cè)試劑，37°CCO2培養(yǎng)箱 2h，550nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，計(jì)算殺傷率。殺傷率（％ ) =〔1一（ODe+t - 0De)/0Dt〕X100%; 其中，0隊(duì):單純效應(yīng)細(xì)胞孔的OD值；ODt:單純靶細(xì)胞孔孔的OD值；OD