一種紫花苜?？购騇sCAMTA1及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAI 及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)是我國重要的栽培飼用牧草資源，其蛋白質(zhì)含量 高、營養(yǎng)價(jià)值豐富，適口性好，產(chǎn)草量高，抗逆性強(qiáng)，被譽(yù)為"牧草之王"。紫花苜蓿是理想的 飼用植物，同時(shí)也是良好的綠肥植物，具有很強(qiáng)的固氮、蓄水和保護(hù)生態(tài)平衡的能力，在農(nóng) 牧業(yè)發(fā)展中占重要地位。我國北方地區(qū)，由于冬季氣候干燥寒冷，許多引進(jìn)的紫花苜蓿品種 普遍存在越冬率低、容易發(fā)生凍害和死亡的現(xiàn)象。低溫已成為限制北方紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展 的重要影響因素。紫花苜蓿越冬問題，即紫花苜蓿的抗寒性問題，一直是紫花苜蓿研究人員 亟待解決的難題。
[0003] 低溫是植物在生長發(fā)育過程中常見的一種非生物逆境脅迫。低溫能夠引起植物膜 損傷、光合降低、呼吸增強(qiáng)、有害化學(xué)物質(zhì)積累、生長抑制以及代謝失調(diào)等現(xiàn)象。低溫環(huán)境不 僅影響植物的生長、發(fā)育、代謝，還影響植物的產(chǎn)量，質(zhì)量，同時(shí)還決定植物的地域分布。大 多數(shù)源于溫帶地區(qū)的植物可以通過低溫馴化提高植物的抗寒能力，如小麥、大麥、油菜等。 Thomashow將冰點(diǎn)以上的低溫激活了轉(zhuǎn)錄和新陳代謝的重編，進(jìn)而增加了植物對冰凍的耐 性過程定義為"冷適應(yīng)"。該過程涉及植物生理生化的多個(gè)過程，如：細(xì)胞滲透性的增強(qiáng)、質(zhì) 膜合成物的改變、抗氧化物增強(qiáng)、初級(jí)代謝產(chǎn)物的活躍等，也是植物為了安全度過冬季所要 經(jīng)歷的必須階段。
[0004] 近年來，植物冷馴化和抗寒分子機(jī)理的研究取得了顯著進(jìn)展，紫花苜?？购?工程也取得了較大進(jìn)步。低溫脅迫下，植物細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、 膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷，而植物體內(nèi)的各種酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)可有 效清除活性氧。因此，通過將編碼抗氧化酶的基因?qū)胱匣ㄜ俎?，可能?huì)為提高紫花苜蓿 抗逆性開辟一條新的途徑。Ca2+信號(hào)途徑在植物抵抗冷脅迫中起到重要作用，大量研究表 明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時(shí)升高是觸發(fā)植物防御反應(yīng)的早期信號(hào)，這種濃度變化需要通 過Ca2+受體傳遞給相應(yīng)的革巴蛋白而起作用。CAMTA(calmodulin-bindingtranscription activator)基因，又稱SR(singaling_responsiveprotein)基因是一類能與f丐調(diào)素結(jié)合 并具有轉(zhuǎn)錄激活作用的蛋白。Doherty等發(fā)現(xiàn)AtSRl/CAMTA3和AtSR2/CAMTAl在植物耐低 溫中起著重要作用。突變體camtal中冷誘導(dǎo)的CBF1、CBF2、ZAT12和G0LS3的表達(dá)水平遠(yuǎn) 低于野生型；雙突變體camtal/camta3對低溫的耐受性顯著低于野生型。CAMTA基因在植 物響應(yīng)低溫脅迫的鈣信號(hào)通過中起著重要作用，雖然擬南芥、小麥、番茄都有報(bào)道，但是紫 花苜蓿中CAMTA基因及相關(guān)應(yīng)用至今尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種紫花苜?？购騇sCAMTAI及其編碼蛋白和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl，該紫花苜?？购騇sCAMTAl 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，序列長度為3123bp，核苷酸序列的堿基組成為916A 869T748G590C。
[0008] 本發(fā)明還公開了由上述的紫花苜?？购騇sCAMTAl編碼的蛋白，該蛋白的氨 基酸序列如SEQ.ID.N0. 2所示，序列長度為1040個(gè)氨基酸殘基。
[0009] 本發(fā)明還公開了含有上述的紫花苜?？购騇sCAMTAl的表達(dá)載體，所述表達(dá) 載體為PCBM-35S-CATMTA1，含有草甘膦篩選標(biāo)記基因PPT和組成型啟動(dòng)子35S。
[0010] 本發(fā)明還公開了上述紫花苜?？购騇sCAMTAl在提高紫花苜蓿對環(huán)境抗寒性 能中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步地，構(gòu)建含有上述基因MsCAMTAl的植物表達(dá)載體，再將所構(gòu)建的植物表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化到煙草（Nicotianatabacumcv.SR-1)中，篩選獲得抗寒性增強(qiáng)的煙草。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0013] 本發(fā)明首次公開了一種紫花苜?？购騇sCAMTAl，并獲得了該基因編碼的蛋白 氨基酸序列，同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)證實(shí)了紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl可 以提高植物抗寒性。通過Real-timePCR方法對MsCAMTAl在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá) 量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株中MsCAMTAl的表達(dá)量顯著提高。對獲得的 轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗寒性分析，經(jīng)分析表明，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比較，存活率升高，膜透 性增加緩慢，抗零下低溫能力提高。本發(fā)明獲得的MsCAMTAl是一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因 子，不僅在提高植物抗寒性方面起到重要作用，對改良牧草品質(zhì)具有重要的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià) 值。基于此研究結(jié)果，為通過基因工程或分子育種提高作物抗寒性和改良牧草品質(zhì)提供必 要的理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有較大應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為MsCAMTAl氨基酸序列同源性比對分析結(jié)果；
[0015] 圖2為MsCAMTAl系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果；
[0016] 圖3為MsCAMTAl蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果示意圖；
[0017] 圖4為MsCAMTAl基因表達(dá)模式結(jié)果；
[0018] 其中，（a)為室外自然降溫處理MsCAMTAl表達(dá)模式結(jié)果；(b)為人工降溫處理 MsCAMTAl表達(dá)模式結(jié)果；
[0019] 圖5為MsCAMTAl載體構(gòu)建圖；
[0020] 圖6為MsCAMTAl載體構(gòu)建電泳結(jié)果圖；
[0021] 其中，a為pMD18T-CAMTAlSal I和Kpn I雙酶切膠回收MsCAMTAl ;
[0022] b為pMD18T-CAMTAl和pBlu載體Sal I和Kpn I雙酶切；
[0023] c為pCBMSmaI和SacI雙酶切；
[0024] d為pBlu-CAMTAl_17KpnI(平滑）和SacI酶切；
[0025] e為pCBM-CAMTAl_25Sma I和Sac I雙酶切鑒定；
[0026] f為pCBM-CAMTAl-25轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌落PCR鑒定；
[0027] g為pCBM-CAMTAl-25轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105陽性克隆SmaI和SacI雙酶切鑒定。
[0028] 圖7為轉(zhuǎn)MsCAMTAl基因抗性苗的PCR鑒定；
[0029] 圖8為qRT-PCR分析過表達(dá)株系的MsCAMTAl表達(dá)量結(jié)果；
[0030] 圖9為轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草低溫脅迫下的表型結(jié)果分析；
[0031] 圖9-1為轉(zhuǎn)基因植株電導(dǎo)率；
[0032] 圖9-2為轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量；
[0033] 其中，WT，煙草野生型，TR2,過表達(dá)株系2。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0035] 1、紫花苜?？购騇sCAMTAl全長cDNA克隆
[0036] 從NCBI數(shù)據(jù)庫中（(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索漠藜苜蓿的蛋白質(zhì)序 列和CDS序列并保存，用數(shù)據(jù)庫中已知的擬南芥AtCAMTAl序列在BioEdit軟件中對保存的 蛋白質(zhì)序列和⑶S序列文本文件進(jìn)行LocalBlast，這樣就獲得了蒺藜苜蓿中CAMTA1基因 ⑶S序列。利用該序列設(shè)計(jì)引物，引物為：
[0037]MsCAMTAl-F:5'-AGAAGACGAAGAACATTTCG-3'；
[0038]MsCAMTAl-R:5' -GACATATATTAACAGCGGGG-3'。
[0039] 具體流程如下：
[0040] 1)RNA的提?。豪肨RIZ0L試劑盒提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此cDNA為模板 RT-PCR擴(kuò)增MsCAMTAl全長序列；
[0041] 利用RNApreppurePlantKit試劑盒（TianGen)提取經(jīng)低溫4°C處理5小時(shí)的紫 花苜蓿（MedicagosativaL.)葉片RNA，應(yīng)用RevertraAce隨機(jī)引物（Toyobo)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA〇
[0042] 以合成的紫花苜蓿cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增MsCAMTAl全長序列。
[0043] 2)用TaKaRaExTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min;94°C 變性 30sec;54°C退火 30sec;72°C延伸 3min25sec;30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min。PCR反應(yīng)結(jié) 束后，將反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，得到約3310bp的片段，采用Takara 公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractKit回收目的片段。
[0044] 將回收的PCR產(chǎn)物片段連接到克隆載體pMD?18_T(Takara)中的EcoRV位點(diǎn)。重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10中，然后對插入的核苷酸序列進(jìn)行測序。
[0045] 連接反應(yīng)體系：在10yl反應(yīng)體系中，SolutionI5yl，PCR回收產(chǎn)物4yl， pMD?18-Tlyl?；靹蚝?6°C反應(yīng)16h。重組載體的轉(zhuǎn)化：參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》；
[0046] 4)最終鑒定得到MsCAMTAl基因0RF的全長序列。MsCAMTAl基因開放讀碼框全長 為3123bp，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有1040個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為116. 9kDa， 理論等電點(diǎn)（PI)為5. 61。將其氨基酸序列在GeneBank中檢索，結(jié)果顯示MsCAMTAl基因 和MtCAMTAl基因（蒺藜苜蓿，AES63449. 2)相比，氨基酸同源性為96% ;與AtCAMTAl基因 (擬南芥，NP_196503. 1)相比，氨基酸同源性為52%。
[0047] 2、MsCAMTAl基因生物信息學(xué)分析
[0048] 1)MsCAMTAl基因生物信息學(xué)分析
[0049]MsCAMTAl及其他CAMTA蛋白家族成員包括Medicagotruncatula中的 MtCAMTAl(AES63449. 2)，Glycinemax中的GmCAMTA2 (XP_003547081. 1)和Glycinesoja 中的68〇厶10^2〇(圓39228.1)，厶抑1^(1(^818也&11&仙中的厶比厶10^1(即_196503.3)和 AtCAMTA2(XP_201227. 3)，Cicerarietinum中的CaCAMTA2(XP_004485582. 1)，Nicotiana tomentosiformis中的NtCAMTA2(XP_009600618. 1)的氨基酸序列通過Protein-Protein BLAST分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，顯示出較高的同源性，其中 GmCAMTA2 (-致性 76 %，相似性 82 % )，CaCAMTA2 (-致性 86 %，相似性 90 %)，AtCAMTAl( - 致性52%，相似性66%)，MtCAMTAl(-致性96%，相似性97% )同源度最高，參見圖1。
[0050] 2)進(jìn)化樹分析
[0051]從NCBI獲取擬南芥（At)、野大豆（Gs)、鷹嘴豆（Ca)和蒺藜苜蓿（Mt)CAMTA蛋白 質(zhì)家族的氨基酸序列，應(yīng)用MEGA4軟件比對并構(gòu)成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2)。進(jìn)化關(guān)系上看， MsCAMTAl蛋白序列與MtCAMTAl和GsCAMTA2蛋白親緣關(guān)系最近。
[0052] 3)二級(jí)結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測
[0053] 根據(jù)ProtParamtool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)的預(yù)測 分析，MsCAMTAl蛋白的分子量為116. 9kDa，等電點(diǎn)為5. 61，具有較高的Ser(10. 2M% )和 Asp(7. 7M% )含量，不含有Pyl和Sec殘基。
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