專利名稱：天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到sikRbcS2基因，構(gòu)建組成型植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，并對抗寒效果進(jìn)行 評價(jià)，增加植物的抗寒性能。
背景技術(shù)：
低溫是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一。低溫脅迫可使植物光合作用降低，呼 吸作用增強(qiáng)，能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，消耗增強(qiáng)，植物處于饑餓狀態(tài)，嚴(yán)重影響了植物的 正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡(郭子武，李憲利等，植物低溫脅迫響應(yīng)的生化與分子生物學(xué) 機(jī)制研究進(jìn)展，中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，12 (2) 54-57)。提高植物的抗寒性是科技工作者亟待解決的問題。從18世紀(jì)末開始，許多科學(xué) 工作者對植物抗寒凍害機(jī)理進(jìn)行了研究，相繼提出了 “生理干旱”、“饑餓”、“代謝失調(diào)”、“毒 物積累”和“膜脂相變”等假說(馬建忠.膜脂與植物的抗寒性[J].生物技術(shù)通報(bào).1997， (2) 6-9)，至20世紀(jì)下葉，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，對植物寒凍害及抗寒凍機(jī)理的研究 進(jìn)一步深入，并分離和鑒定了植物抗寒凍相關(guān)基因(馬建忠.植物的冷誘導(dǎo)基因[J].農(nóng)業(yè) 生物技術(shù)學(xué)報(bào).1996，4(1) :8-14)。低溫對植物細(xì)胞中多種酶活性有著明顯的影響。至于共影響的機(jī)制， Guy (Guy GL.Cold acclimationand freezing stress tolerance :role of protein metabolism[J]. Ann Rev Plant Physiol. 1990，41 :187-223)認(rèn)為可能是由于其三級或四 級結(jié)構(gòu)的破壞，明顯地改變了 PH值和離子強(qiáng)度，類囊體膜的蛋白質(zhì)釋放出來造成膜酶復(fù)合 物的解離或者通過分子間的聚集(如形成二硫鏈)而導(dǎo)致酶與蛋白鈍化。當(dāng)組織結(jié)冰脫水 時，巰基(-SH)減少，而二硫鍵(-S-S-)增加。二硫鍵是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部失水或相鄰蛋 白質(zhì)分子的巰基失水而形成的。當(dāng)解凍再度失水時，肽鏈松散，氫鍵斷裂，但-S-S-鍵還保 存，肽鏈的空間位置發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象改變，因而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而 弓I起細(xì)胞的傷害禾口死亡(Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stress [M]. New York =Academic Press. 1972，697)。例如，C4植物光合過程中的關(guān)鍵酶丙酮酸磷酸雙 激酶在低溫條件下由四聚體變?yōu)槎垠w，導(dǎo)致活性喪失；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，在低 溫下發(fā)生構(gòu)像的可逆變化，使其內(nèi)部疏水基外露，導(dǎo)致功能喪失。另外，有許多研究表明，低 溫也可通過影響酶的數(shù)量以及同功酶譜等來影響其活性(沈曼，王明麻，董敏仁.植物抗寒 機(jī)理研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào).1997，14(2) :1-8)。這些冷感酶類經(jīng)冷馴化后，其敏感性 降低，活性增加，抗寒凍性也不同程度提高(Schaffer MA,Fischer RL. Analysis of mRNAs thataccumulate in response to low temperature identifies a thiolprotease gene in Tomato [J], Plant Physiol. 1988，87 :431_436)。還有一些酶類在寒凍過程中，可以通過 變構(gòu)調(diào)節(jié)正向調(diào)控其動力學(xué)行為，以達(dá)到克服低溫的鈍化作用。Rubisco (1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶，ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是光合碳代謝中的關(guān)鍵酶，催化1，5_ 二磷酸核酮糖和CO2生成二分子3-磷酸甘油酸反應(yīng)的酶，亦稱羧基歧化酶，可由Mg離子的存在被激活。1，5- 二磷酸核 酮糖羧化酶/加氧酶是光合作用中固定CO2的酶，是催化卡爾文循環(huán)中的CO2固定的第一步 反應(yīng)Rubp和CO2反應(yīng)生成3-磷酸甘油酸；該酶也同時催化光呼吸作用的第一步，使Rubp 和O2反應(yīng)生成3-磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。處于光合碳還原和光合碳氧化這兩個方向相 反但又相互連鎖的循環(huán)的交叉點(diǎn)上，調(diào)節(jié)著光合作用和光呼吸的代謝比例，它對凈光合速 率起者決定性的影響，是光合碳同化的關(guān)鍵酶。其活性大小對光合速率起著決定性作用。在 所有自養(yǎng)性生物中都有所發(fā)現(xiàn)。作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)，又名天 山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長于海拔2400 4100m的高山草甸、高山冰磧 石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫 3 5°C，最低月平均溫-19 -21 °C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。天山雪蓮經(jīng)過長期的自然選擇，形成了穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、功能和遺傳基因，產(chǎn)生了 適應(yīng)極端環(huán)境條件下的生理和生化機(jī)制，這種與環(huán)境相適應(yīng)的機(jī)制，與一般的耐冷、抗寒應(yīng) 答性的適應(yīng)機(jī)制不同，主要表現(xiàn)在其低溫條件下能夠正常的生長發(fā)育，而一般的抗寒性植 物在相應(yīng)的低溫條件下，生長發(fā)育受到抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是為植物抗寒育種提供有價(jià)值的Rubisco基因sikRbcS2，其發(fā) 明的目還在于構(gòu)建植物表達(dá)載體PCAMBIA2301-SikRbcS2，在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高 轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲 得抗(耐)低溫能力明顯增強(qiáng)的植物。本發(fā)明的目的是通過以下過程和方法實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，其序列為<210>1。本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因的過程如下以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒為模板，用RPl其序列為<210>2和RP2其序列 為<210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；sikRbcS2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2301_sikRbcS2 ；利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植 物轉(zhuǎn)sikRbcS2基因煙草進(jìn)行低溫處理后光化學(xué)效率分析，可分成三個等級(高，中， 低)，這與sikRbcS2基因插入煙草基因組中不同位置有關(guān)，導(dǎo)致基因的表達(dá)量有所不同，引 起低溫處理后光化學(xué)效率有所不同。其光化學(xué)效率并不是和溫度直接相關(guān)。轉(zhuǎn)sikRbcS2基因煙草從室溫降至0°C的過程中，轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草的電導(dǎo)率 差異較小(1%左右)；當(dāng)溫度降至0°c，轉(zhuǎn)sikRbcS2煙草電導(dǎo)率低于對照煙草7%;在-2°c 時，轉(zhuǎn)sikRbcS2煙草電導(dǎo)率則低于對照煙草92%。轉(zhuǎn)sikRbcS2基因煙草在低溫下表現(xiàn)出 極強(qiáng)的抗性，提高植物的光合作用，提高植物的抗寒性。本發(fā)明不僅得到天山雪蓮Rubisco基因sikRbcS2，而且將其構(gòu)建成的植物表達(dá)載 體，在轉(zhuǎn)基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫性能中的重要功能。這對于揭示雪蓮 的抗寒機(jī)理，豐富植物抗寒分子生物學(xué)理論，提高植物的耐低溫能力，具有重要的意義。


圖 1 是天山雪蓮 sikRbcS2 基因 PCR 擴(kuò)增圖 Figl :sikRbcS2gene PCR amplified圖 2 是 pUCm-sikRbcS2 酶切鑒定圖 Fig2 =Restriction enzyme digestion identification of pUCm_sikRbcS2圖 3 是 pCAMBIA1301-sikRbcS2 PCR 鑒定 Fig3 :PCR identification of pCAMBIA1301-sikRbcS2圖 4 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 PCR 鑒定 Fig4 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS圖 5 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 酶切鑒定 Fig5 =Restriction enzyme digestion identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2圖 6 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉(zhuǎn)化 AGL1PCR 鑒定 Fig6 :PCR identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl圖 7 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉(zhuǎn)化煙草 PCR 檢測 Fig7 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS2transformed tobacco圖 8 是轉(zhuǎn)基因煙草 RT-PCR 分析 Fig8 :RT-PCR analysis on transgenic tobacco圖9是溫度處理對不同煙草Fv/Fm的影響，圖中數(shù)據(jù)為三個重復(fù)的平均值 + S. EFig 9 :Effect of temperature treatment on the Fv/Fm in different tobacco, Resultasmeans士S. Ε. (η = 3)圖10 是sikRbcS2基因轉(zhuǎn)化煙草葉片相對電導(dǎo)率的測定FiglO =Relative conductivity of tobaccoleaves圖11是天山雪蓮sikRbcS2植物表達(dá)載體pCAMBIA2301_sikRbcS2的構(gòu)建流程 1 中1,2 :sikRbcS2 ；3 陰性對照；M =Marker圖2 中1,2 :pUCm-sikRbcS2 ；3 :plasmid ；M =Marker III ；圖 3 中1 陰性對照；2-4 :pCAMBIA1301-sikRbcS2 ；M =Marker III圖 4 中1 陰性對照；2-4 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker III圖 5 中1 jplasmid ；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker圖 6 中1 陰性對照；2-6 :pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl ；M =Marker圖7 中1 :Negetive control ；2 :positive control ；3-12 :Transgenic tobacco ；M MarkerIII圖 8 中1 陰性對照；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 轉(zhuǎn)化煙草；M =Marker
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產(chǎn)；LA PCRTM in vitro CloningKit 購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、 Marker,TRNzol總RNA提取試劑購于TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司原裝； 抗生素購自上海Sangon公司。實(shí)施例1 天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管于IOmlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。蘸取菌液于LB固體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培 養(yǎng)，37°C暗培養(yǎng)12-16hr。挑取單克隆于20mlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振蕩培養(yǎng)14hr，提取質(zhì)粒，具體方法如下1)將菌液分裝于1. 5ml Ep管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400ml STE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；3)沉淀用150 μ L堿裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配制的300 μ L堿裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L堿裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ；離心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850 μ L，-20°C放置 IOmin ；離心(12000rpm, 5min)；8)棄去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。實(shí)施例2 從天山雪蓮中克隆到sikRbcS2基因以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質(zhì)粒為模板，用RPl其序列為<210>2和RP2其序列為 <210>3為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；同時以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對照。RPl 為<210>2
5 ‘ ttatcagtcgaaggtacgg3'
RP2 為<210>3
5' gctttctagaccattcgttggcgcg 3'
PCR反應(yīng)體系(20 μ 1)為:
10XPCR Buffer2. 0μ 1
dNTPs(各 2. 5mM)0. 5μ 1
MgC12(25mM)1. 0μ 1
上游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase (2. 5U,/μ 1) 0. 3ul
ddH2014. 7μ 1
Total20. 0μ 1PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，68°C復(fù)性 120s，30cycles ；72°C 延伸IOmin ；4°C保溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)濃度為1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用上海生工 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為 sikRbcS2。如圖1所示。實(shí)施例3 構(gòu)建sikRbcS2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-sikRbcS2和 pCAMBIA2301_sikRbcS2。將 PCAMBIA1301 和 pCAMBIA2301 的 E. coli DH5 α 用 Nco I/BstE II 分別雙酶切植物表達(dá)載 體，獲得載體片段?；厥漳康幕蚱魏洼d體片段。將目的基因片段與載體片段進(jìn)行體外連 接，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pCAMBIA1301-sikRbcS2和pCAMBIA2301_sikRbcS2。 在本實(shí)施方案中，我們選用煙草作為轉(zhuǎn)基因植物材料，也可選用其它植物作為轉(zhuǎn)基因材料。在本實(shí)施方案中，sikRbcS2基因和pCAMBIA2301構(gòu)成植物表達(dá)載體，用于植物的 轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，構(gòu)建所選用的植物表達(dá)載體除了 PCAMBIA2301之外，還 可以選用其他植物表達(dá)載體。如圖3、4、5所示。實(shí)施例4 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化4. 1農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1)從新鮮的AGLl平板上挑取一個單菌落于LB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 48hr ；2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液體培養(yǎng)基中 活化培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分裝菌液于1.5ml離心管，于4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農(nóng)桿菌細(xì) 胞；4)將沉淀的農(nóng)桿菌用750ul預(yù)冷的0. 05mol/LCaCl2重懸，4 °C，8000rpm離心 5min ；5)棄上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細(xì)胞，保存于_70°C。4. 2植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGLl (凍融法)1)吸取10 μ 1上述重組載體質(zhì)粒(約0. 5 μ g/ μ 1)，與75 μ 1 AGLl感受態(tài)細(xì)胞輕 輕混勻，冰浴30min，然后液氮凍存5min ；2)迅速置于37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液體 LB 培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 5hr ；4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，棄去500 μ 1液體培養(yǎng) 基，剩余100 μ 1重懸細(xì)胞；5)將菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培 養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24-48hr。4. 3陽性克隆篩選挑取若干單菌落，進(jìn)行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為 pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl。在本實(shí)施方案中，植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn) 化植物。如圖6所示。實(shí)施例5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生本發(fā)明中對于靶植物的轉(zhuǎn)化方法不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各 種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng) 桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用于轉(zhuǎn)化的方法，可以使用適合于其他靶植物。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn) 定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶 植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。5. 1農(nóng)桿菌浸染液的制備1)從_70°C保存的含有PCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl農(nóng)桿菌甘油管中挑取菌塊， 接種于 5ml 附加有 Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml 的 LB 液體培養(yǎng)基中，28 °C， 200rpm振蕩培養(yǎng)約30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液體培養(yǎng)基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)約 4hr ；3)活化的菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 4-0. 6時，即為轉(zhuǎn)化用的浸染液。5. 2 浸染1)超凈工作臺上將浸染液倒入無菌培養(yǎng)皿中，將無菌煙草葉片剪成Icm2大小的方 塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；2)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤上附著的菌液；3)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉 盤均勻地?cái)[放在濾紙上；在26°C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。5. 3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導(dǎo)將共培養(yǎng)過的煙草葉盤轉(zhuǎn)移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的煙草誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上，葉盤傷口充分接觸培養(yǎng)基。每15-20天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接
1-2次以后，葉盤邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)直至誘導(dǎo)出叢生芽。5. 4轉(zhuǎn)化植株的生根培養(yǎng)和移栽待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉(zhuǎn)接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因煙草15天左右開始有根生成，待根系發(fā)達(dá)時，將根系生長良好的轉(zhuǎn)化植 株，去除封口膜，室溫環(huán)境中進(jìn)行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉(zhuǎn)入基質(zhì)(蛭 石腐質(zhì)土 = 2 1)中，26 ，16^40μπιΟ1 · πΓ2 · s—1光照，70 %相對濕度條件下培養(yǎng)，前
2-3天需遮陰、避光、保濕。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測6. 1轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定6. 1. 1 煙草 DNA 的提取(SDS 法)1)取0. Ig新鮮葉片，用玻棒在1. 5ml離心管內(nèi)充分研磨；2)加入400 μ 1提取緩沖液，充分混勻，12000rpm離心5min ；
3)小心吸取300 μ 1上清液，加入300 μ 1異丙醇，室溫沉淀20min, 12000rpm離心 lOmin，收集沉淀；4)將沉淀充分風(fēng)干，加400 μ 1 TE溶解沉淀；5)加入400 μ 1氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置20min，12000rpm離心 IOmin ；6)小心吸取上清，加入40 μ 1 3麗aAC(pH5. 2), 800 μ 1無水乙醇，_20°C沉淀過夜；7)4°C，12000rpm 離心 15min，棄上清；8) 70%酒精洗滌兩次，吹干后用30 μ 1 ddH20溶解。6. 1.2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定以提取的轉(zhuǎn)化基因的煙草DNA為模板，用RP3其序列為<210>4和RP4其序列為 <210>5為引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時以去離子水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對照，擴(kuò)增體系如實(shí)施 例2。如圖7所示。6. 2轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測6. 2. 1待檢測植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的煙草 總 RNA 1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均 使用0. 1 %的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0. Ig于研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混 勻，室溫放置3-5min。4) 10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩 混勻；5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600 μ 1預(yù)冷 的異丙醇，于_20°C沉淀30min ；6) IOOOOrpm,4°C離心IOmin后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為 總 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30 μ 1 ddH20 (DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。6. 2. 2cDNA 第一鏈的合成在DEPC 處理的 0. 2ml 離心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1μ l,ddH20 5μ 1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在離心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1，42°C lhr,95°C 5min 后，冷卻至 4°C。7. 2. 3cDNA第二鏈的合成及擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入cDNA第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)足至 20 μ 1，反應(yīng)條件同實(shí)施例2。如圖8所示。實(shí)施例7 光化學(xué)效率的測定Fv/Fm是重要的熒光參數(shù)之一，習(xí)慣上稱其為PS II最大光化學(xué)效率，它是暗適應(yīng)下PSII反應(yīng)中心完全開放時的最大光化學(xué)效率，反映了 PS II反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效 率。在非脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm的值很穩(wěn)定，但在逆境條件下，F(xiàn)v/Fm顯著降低。因此，F(xiàn)v/Fm 的降低常作為發(fā)生光抑制或PSII遭受傷害的指標(biāo)。本試驗(yàn)采用Dual-pamlOO儀器測定，如 圖9所示。
0138]實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因植株的模擬寒害處理及葉片質(zhì)膜透性測定
0139]轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。植株成 舌后選取生長一致的苗(5-7葉期)，進(jìn)行模擬寒害處理。分別用打孔器從葉片中打取小圓 片測定葉片質(zhì)膜透性。如圖10所示。
0140]序列表
0141]<110>石河子大學(xué)
0142]<120>天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用
0143]<160>3
0144]<210>1
0145]<211>965
0146]<212>DNA
0147]<213> 天山雪蓮(Saurrea. involucrata Kar. et Kir.)
0148]<220>
0149]<221>5， UTP
0150]<222>(1). . . (142)
0151]<220>
0152]<221>CDS
0153]<222>(143). . . (563)
0154]<220>
0155]<221>3， UTP
0156]<222>(564). . . (965)
0157]<400>1
0158]Translation of DNAMAN2(143-563)
0159]Universal code
0160]Total amino acid number :140, MW = 35075
0161]Max ORF starts at AA pos 47(may be DNA pos 143)for 140 AA(420bases), MW = 15631
0162]1 gagcgaagaa agcggccgca taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcagtcga
0163]61 cggtacggga catatgcccg ggaattcggc cattacggcc ggggggattt gcaaaggcta
0164]130140 150 160170179
0165]120 ccctttaaag caaaattacc aaa atg gcc tcc ate tcc tcc tcc gcg gta gcc acc gtc
0166]40MET Ala Ser lie Ser Ser Ser Ala Val Ala Thr Val
0167]190200 210220230239
0168]180 aac egg tcc gcc tcc get caa gcc aac atg gtg get cca ttt acc ggc ctc aag tcc aac
0169]60 Asn Arg Ser Ala Ser Ala Gln Ala Asn MET Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn
0170]250260 270 280 290 299
100171]240gtcgccttc ccagttacc aagaaggcc aacgacttttcctcc cttCCCage aac0172]80ValAlaPhe RroValThr LysLysAla AsnAspPheSerSer LeuRroSer Asn0173]3103203303403503590174]300agagttcag tgcatgaag gtgtggcca ccaCttggattgaag aagtacgag act0175]100ArgValGln CysMETLys ValTrpRro RroLeuGlyLeuLys LysTyrGlu Hir0176]3703803904004104190177]360tacctaccc ccattaagt gaagcatcg ttggccaaggaagtg gactactta ttc0178]120TyrLeuRro RroLeuSer GluAlaSer LeuAlaLysGluVal AspTyrLeu Phe0179]4304404504604704790180]420aaatgggtt CCttgcttg gaattcgag ttggagcacggtttc gtgtaccgt gag0181]140LysTrpVal RroCysLeu GluPheGlu LeuGluHisGlyPhe ValTyr Arg Glu0182]4905005105205305390183]480teatccctg gatattatg acggaagat actggacaatgtgga agttgccta tgt0184]160SerSerLeu AsplieMET IhrGluAsp ThrGlyGlnCys Gly SerCysLeu Cys0185]550560570580590600
ggt gga Gly Gly
ctt tcg Leu Ser
cgc aac Arg Asn
cac aac His Asn
tcg ggt Ser Gly
0186]540 gca ctg att ccg ccc agg tgt tgaaggagct tgaagagtgc aagaaggagt acccgaacgc
0187]180 Ala Leu lie Pro Pro Arg Cys * * *
0188]610620630640650 6600189]601cttcgtccgtattatcggattggacaacgttcgtcaagtccagtgtgtgagtttcatcgc0190]661tgccaagccaccaggttattaagcaatttatcaacaattttgttttaatcCCgggtCggg0191]721tcgggtttgtttgaatctttagggtttttcatcaatttttttttttttatattgggattt0192]781cgtcaatttaatttcatgtccatttccttgttcattcctgaatttttatgagggggataa0193]841aaagatatca ￡Ι ￡Ι ￡1￡1￡1￡Ι aataatttgtCSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL0194]901acagtcggccgcctcggccctcgagaagctttctagaccattcgttggcgcgcgacccag0195]961agagg
0196]<210>2
0197]<211>20
0198]<212>DNA
0199]<213>人工序列
0200]<400>2
0201]gttatcagtcgaaggtacgg
0202]<210>3
0203]<211>25
0204]<212>DNA
0205]<213>人工序列
0206]<400>3
0207]gctttctagaccattcgttggcgcg
0208]<210>4
0209]<211>22
<212>DNA<213>人工序列<400>4ggcctccatctcctcctccgcg<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5actgattccgcccaggtgttga
權(quán)利要求
一種從天山雪蓮中克隆sik RbcS2基因，其特征在于該基因全長965bp，其序列為<210>1，編碼區(qū)420bp，編碼139個氨基酸，5’非編碼區(qū)142bp，3’非編碼區(qū)402bp。
2.一種利用上述基因sik RbcS2基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
3.一種從天山雪蓮中克隆序列為<210>1的sik RbcS2基因的用途，其特征在于利用上 述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要
本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的應(yīng)用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-sikRbcS2，遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗寒逆轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikRbcS2基因，并在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達(dá)，使植物抗低溫脅迫的性能得到提高，最終獲得抗寒逆能力明顯增強(qiáng)的植物。
文檔編號C12N15/82GK101899459SQ20091011359
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者孫建富, 張煜星, 王愛英, 祝建波 申請人:石河子大學(xué)