天山雪蓮sikLEA基因在培育抗寒植物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikLEA基因在培育抗寒植物中的應用。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikLEA基因，并在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗低溫能力明顯增強的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒直接相關的基因，將其用于農(nóng)作物品種改良，具有巨大的經(jīng)濟價值。
【專利說明】天山雪蓮sikLEA基因在培育抗寒植物中的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到sikLEA基因，構建組成型植物表達載體，轉化植物，并對抗寒效果進行評價，增加植物的抗寒性能。
【背景技術】:
[0002]低溫是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災害之一。低溫脅迫可使植物光合作用降低，呼吸作用增強，能量產(chǎn)生和物質合成受阻，消耗增強，植物處于饑餓狀態(tài)，嚴重影響了植物的正常生長發(fā)育，甚至導致死亡(郭子武，李憲利等，植物低溫脅迫響應的生化與分子生物學機制研究進展，中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2004，12 (2):54-57)。 [0003]LEA蛋白是指胚胎發(fā)生后期植物種子中大量積累的一系列蛋白質的總稱，棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中最早發(fā)現(xiàn)了 LEA蛋白(Dure L.Crouch M.Developmentalbiochemistry of cotton seedembryogenesis and germination !changing messengerribonucleic acid populations as shown by in vitro andin vivo protein synthesis.Biochemistry, 1981,20:4162-4168.)。后來人們發(fā)現(xiàn)LEA蛋白廣泛存在于各種高等植物體內，經(jīng)研究這種蛋白表現(xiàn)出很強的熱穩(wěn)定性和親水性，而且LEA蛋白受脫水信號、發(fā)育階段和脫落酸的調控。進一步研究表明LEA蛋白是由極性氨基酸組成并且在細胞中濃度較高，但其本身很有可能不具有酶的活性(Ingram J, Bartels D.The molecular basisof dehydration tolerance in plants.Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol,1996,47:377-403.)?，F(xiàn)有的研究結果表明植物的抗逆性與LEA蛋白質的累積量呈正相關。例如Zhang L，et al.證明LEA基因轉化酵母細胞，并使LEA基因在酵母細胞中超表達，從而提高了酵母細胞對鹽脅迫和低溫脅迫的耐受性(Zhang L, Akinori O, MasamichiT, et al.Expressionofplant group 2 and group 3 LEA genes inSaccharomycescerevisiaerevealed functional divergence amongLEA proteins.J Biochem,2000,127(4):611-616.)。另外孫海丹等人通過實驗證明了植物抗旱性與LEA蛋白質有關(孫海丹，蘭英，劉昀，等.LEA蛋白質11-氨基酸基序與植物抗旱性.東北師大學報:自然科學版，2004，36(3):85-90.)。
[0004]作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar.et Kir),又名天山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫3~5°C，最低月平均溫-19~-21 °C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。
[0005]天山雪蓮經(jīng)過長期的自然選擇，形成了穩(wěn)定的特殊結構、功能和遺傳基因，產(chǎn)生了適應極端環(huán)境條件下的生理和生化機制，這種與環(huán)境相適應的機制，與一般的耐冷、抗寒應答性的適應機制不同，主要表現(xiàn)在其低溫條件下能夠正常的生長發(fā)育，而一般的抗寒性植物在相應的低溫條件下，生長發(fā)育受到抑制。近年來植物抗寒基因工程得到迅速發(fā)展，并研究出了多種轉基因抗寒植物，為培育抗寒植物開辟了新途徑。
【發(fā)明內容】
:
[0006]前期我們利用GateWay技術構建的低溫脅迫下天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫，從天山雪蓮文庫中篩選克隆到天山雪蓮胚胎晚期豐富蛋白基因sikLEA，為了研究該基因的功能，我們構建了該基因的植物表達載體，并將此基因導入煙草中，提高了植物的抗寒性。
[0007]本發(fā)明的一個目的是為植物抗寒育種提供有價值的胚胎晚期豐富蛋白基因s i kLEA，其發(fā)明的目還在于構建植物表達載體:PB 1121-S i kLEA，在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫性能得到提高，最終獲得抗(耐)低溫能力明顯增強的植物。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下過程和方法實現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆sikLEA基因，其序列為〈210>1。
[0010]本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆sikLEA基因的過程如下:
[0011]提取經(jīng)低溫處理的天山雪蓮RNA，并以RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用Primer5.0設計分別帶有Xba I和SacI的PCR引物Pl和P2進行擴增，得到目的基因；
[0012]構建sikLEA基因植物表達載體pBI121-sikLEA ；
[0013]利用上述基因構建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法遺傳轉化獲得轉基因植物并對其抗寒性進行功能研究:
[0014]植物在受到低溫脅迫處理后，細胞膜會受到凍害影響往往細胞電解質會發(fā)生外滲，從而導致電導率的升高。野生型(CK)和轉天山雪蓮LEA基因基因煙草在移栽3周后經(jīng)低溫處理后，測定煙草葉片電導率。結果表明，非低溫脅迫條件下，轉基因煙草與野生型煙草的相對電導率相差不大，但_4°C低溫處理2h后野生型煙草的相對電導率遠高于轉基因煙草。
[0015]MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以用于表示脂質過氧化的程度。野生型(CK)和轉天山雪蓮LEA基因煙草在移栽3周后經(jīng)低溫處理后，計算煙草葉片MDA含量。結果表明，隨著低溫脅迫時間的延長，野生型煙草比轉基因煙草的MDA含量增加大，表明低溫脅迫導致野生型煙草的細胞膜系統(tǒng)受損嚴重，而轉基因煙草的膜系統(tǒng)受損程度較輕，認為轉基因煙草的生物膜系統(tǒng)由于天山雪蓮LEA基因的表達而對其產(chǎn)生了一定的保護作用。
[0016]本發(fā)明不僅得到天山雪蓮抗寒相關的胚胎晚期豐富蛋白基因sikLEA，而且將其構建成植物表達載體pBI121-sikLEA，在轉基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫性能中的重要功能。這對于揭示雪蓮的抗寒機理，豐富植物抗寒分子生物學理論，提高植物的耐低溫能力，具有重要的意義。
[0017]轉天山雪蓮胚胎晚期豐富蛋白基因sikLEA煙草的抗寒功能分析表明，轉基因煙草的抗寒性得到明顯提高。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0018]圖1 是天山雪蓮 sikLEA 基因 PCR 擴增圖 Figl:sikLEAgene PCR amplified
[0019]圖 2 是 pGM-sikLEA PCR 鑒定圖Fig2:PCR identification ofpGM-sikLEA
[0020]圖 3 是 pBI121-sikLEA PCR 鑒定Fig3:PCR identification ofpBI121-sikLEA
[0021]圖 4 是 pBI121_sikLEA 酶切鑒定Fig4 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_sikLEA
[0022]圖 5 是轉化 GV3101PCR 鑒定Fig5:PCR identification ofpBI121-sikLEA-GV3101
[0023]圖6 是轉化煙草 PCR 檢測Fig6:PCR identification oftransformed tobacco
[0024]圖7 是轉基因煙草 RT-PCR分析Fig7:RT-PCR analysis on transgenictobacco
[0025]圖8是sikLEA基因轉化煙草葉片相對電導率的測定Fig8 =Relativeconductivity of tobacco leaves
[0026]圖9是不同溫度處理對煙草MDA含量的影響Fig.9:Effect oftemperature treatment on thecontent of MDA in tobacco
[0027]圖10是植物表達載體是pBI 12Ι-sikLEA的構建流程圖
[0028]圖1 中:
[0029]M:Marker ；1 陰性對照;2、3:sikLEA ；
[0030]圖2 中:
[0031]M =Marker ；1 陰性對照;2、3:pGM_sikLEA ；
[0032]圖3 中:
[0033]M =Marker ；1 陰性對照;2、3:pBI121_sikLEA ；
[0034]圖4 中:
[0035]M:Marker ;1_4:pBI121_sikLEA ；
[0036]圖5 中:
[0037]M =Marker ；1:陰性對照；2、3:pBI121-sikLEA-GV3101 ；
[0038]圖6 中:
[0039]1:陰性對照；2_7:sikLEA 轉化煙草；M:Marker ；
[0040]圖7 中:
[0041 ] M =Marker ；I:陽性對照2-8:sikLEA轉化煙草；9:陰性對照；
【具體實施方式】:
[0042]實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產(chǎn)；LA PCRTM invitro CloningKit 購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 連接酶(T4-DNA Iigase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購于TIANGEN公司；Xba I, Sal I等限制性內切酶為Fermentas公司原裝；IPTG、Χ-gal及抗生素、植物激素購自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養(yǎng)基的各種試劑均為國產(chǎn)分析純。具體實驗操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實驗指南》。
[0043]1)實施例1:從天山雪蓮中克隆到sikLEA基因
[0044]1.1天山雪蓮總mRNA的提取
[0045]1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均使用0.1 %的DEPC處理，高壓滅菌；
[0046]2)取植物幼嫩葉片約0.1g于研缽中，加液氮充分研磨至粉末狀；
[0047]3)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入1ml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。
[0048]4) 10000rpm,4°C離心5min,吸上清至一新的離心管,加入200 μ I氯仿,劇烈振蕩混勻；
[0049]5) 1000Orpm, 4°C離心5min,吸取上層液體至另一新的離心管后,加入600 μ I預冷的異丙醇，于-2011C沉淀30min ；
[0050]6) 10000rpm，4°C離心10min后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為總 RNA。
[0051]7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30 μ IddH20 (DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。
[0052]1.2cDNA第一鏈的合成
[0053]在DEPC 處理的 0.2ml 離心管中加入 RNA 5 μ 1，Oligo dT 2 μ 1，ddH20 5 μ I 后，在75°C水浴IOmin后迅速置于冰上2min。然后在離心管中加入dNTP(2.5mmol/L) 2ul,Rnase Inhibitor I μ 1，M-MLV-RT 反轉錄酶 I μ 1，DEPC ddH20 5ul,42°C lhr,70°C 15min后，-20°C保存。 [0054]1.3cDNA第二鏈的合成及擴增
[0055]以天山雪蓮cDNA為模板，用Pl和P2為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照。
[0056]CP1Sd, TCTAGA ATGGCCGGAATAATGGATAA ’V
[0057]Xba I
[0058]CP2 為:5' GAGCTC GGCTCATTCGGATTTACCC 3'
[0059]Sal I
[0060]PCR 反應體系(20 μ I)為:
[0061]
IOXPCR Buffer2.0μ1
dNTPs (各2.5mM)0.5μ1
MgC12 (25mM)Ι.ΟμΙ
上游引物(25μΜ)0.5μ1
下游引物(25μΜ)0.5μ1
模板DNA (ddH20)0.5μ1
Taq DNA Polymerase (2.5υ/μ1) 0.3μ1
ddH2014.7μ1
Total20.0μ1
[0062]PCR 反應程序為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，59°C復性 30s，72°C延伸 30s，30cycles ;72°C延伸 7min ;4°C保溫。如圖 1、2。[0063]PCR反應結束后，產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用上海生工的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為sikLEA。然后將目的片段和克隆載體pGM-T連接并轉化，經(jīng)鑒定正確的命名為pGM-sikLEA。
[0064]實施例2:構建sikLEA基因植物表達載體
[0065]構建植物表達載體:pBI121_sikLEA。用Xba ISac I分別雙酶切植物表達載體PBI121和克隆載體pGM-sikLEA，回收目的基因片段和載體片段。將目的基因片段與載體片段進行體外連接，經(jīng)鑒定正確的重組質粒分別命名為pBI121-sikLEA，如圖3、4。
[0066]在本實施方案中，sikLEA基因和pBI121構成一個植物表達載體，用于植物的轉化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了 PBI121之外，還可以選用其他植物表達載體。
[0067]實施例3:農(nóng)桿菌的轉化:
[0068]3.1農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
[0069]1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個單菌落于LB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif (50ug/ml) +Gen (50ug/ml)中，于 28℃、200rpm 振蕩培養(yǎng) 48hr ；
[0070]2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至OD6tltl = 0.5-0.8收集菌液，冰浴30min ；
[0071]3)分裝菌液于1.5ml離心管，于4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農(nóng)桿菌細胞；
[0072]4)將沉淀的農(nóng)桿菌用750ul預冷的0.05mol/LCaCl2重懸，4℃，8000rpm離心5min ；
[0073]5)棄上清用75ul 0.05mol/LCaCl2(10%甘油)重懸細胞，保存于-70℃。
[0074]3.2植物表達載體轉化根癌農(nóng)桿菌GV3101 (凍融法)
[0075]1)吸取10 μ I上述重組載體質粒(約0.5 μ g/ μ I)，與75 μ I GV3101感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30min,然后液氮凍存5min ；
[0076]2)迅速置于37°C水浴2min ；
[0077]3)加入 600 μl 液體 LB 培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 5hr ；
[0078]4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，收集農(nóng)桿菌細胞，棄去500 μ l液體培養(yǎng)基，剩余100 μ I重懸細胞；
[0079]5)將菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24-48hr。
[0080]3.3陽性克隆篩選
[0081]挑取若干單菌落，進行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為:pBI121-sikLEA-GV3101。
[0082]在本實施方案中，植物表達載體導入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領域技術人員非常熟悉的技術操作，不是本發(fā)明的關鍵。通過PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉化植物。如圖5。
[0083]實施例4:煙草遺傳轉化及再生
[0084]本發(fā)明中對于靶植物的轉化方法不是關鍵，可以使用本領域技術人員所熟悉的各種不同的轉化技術將重組DNA序列導入待轉化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。
[0085]本方案中用于將轉化細胞再生成植株的方法，可以使用適合于其他靶植物。最好使被轉化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。
[0086]4.1農(nóng)桿菌浸染液的制備
[0087]I)從-70°C保存的含有:pBI121_sikLEA的GV3101農(nóng)桿菌甘油管中挑取菌塊，接種于 5ml 附加有 Kan50y g/ml, Rif50y g/ml, Gen 50 μ g/ml 的 LB 液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)約30hr ；
[0088]2)吸取 200 μ I 菌液，再用 20ml LB 液體培養(yǎng)基(Kan 50 μ g/ml，Rif 50 μ g/ml，Gen50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)約 4hr ；
[0089]3)活化的菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4-0.6時，即為轉化用的浸染液。
[0090]4.2 浸染
[0091]I)超凈工作臺上將浸染液倒入無菌培養(yǎng)皿中，將無菌煙草葉片剪成Icm2大小的方塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；
[0092]2)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤上附著的菌液； [0093]3)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉盤均勻地擺放在濾紙上；在26°C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。
[0094]4.3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導
[0095]將共培養(yǎng)過的煙草葉盤轉移至MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb500mg/L的煙草誘導選擇培養(yǎng)基上，葉盤傷口充分接觸培養(yǎng)基。每15-20天轉接一次，轉接1-2次以后，葉盤邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)直至誘導出叢生芽。
[0096]4.4轉化植株的生根培養(yǎng)和移栽
[0097]待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉接到MS+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。
[0098]轉基因煙草15天左右開始有根生成，待根系發(fā)達時，將根系生長良好的轉化植株，去除封口膜，室溫環(huán)境中進行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉入基質(蛭石:腐質土 =2: I)中，26°C，16hr 40 μ mol.πm2.s—1光照，70%相對濕度條件下培養(yǎng)，前2~3天需遮陰、避光、保濕。
[0099]實施例5:轉基因煙草的分子檢測
[0100]5.1轉基因煙草的PCR鑒定
[0101]5.1.1 煙草 DNA 的提取(SDS 法)
[0102]I)取0.1g新鮮葉片，用玻棒在1.5ml離心管內充分研磨；
[0103]2)加入400 μ I提取緩沖液，充分混勻，12000rpm離心5min ；
[0104]3)小心吸取300 μ I上清液,加入300 μ I異丙醇,室溫沉淀20min, 12000rpm離心IOmin,收集沉淀；
[0105]4)將沉淀充分風干，加400 μ I TE溶解沉淀；
[0106]5)加入400 μ I氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置20min，12000rpm離心IOmin ；
[0107]6)小心吸取上清，加入40 μ I 3Μ NaAC (pH5.2), 800 μ I無水乙醇，_20°C沉淀過夜；
[0108]7) 4°C, 12000rpm 離心 15min,棄上清；
[0109]8) 70%酒精洗滌兩次，吹干后用30 μ I ddH20溶解。
[0110]5.1.2轉基因煙草的PCR鑒定
[0111]以提取的轉化基因的煙草DNA為模板，用Pl和P2為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照，擴增體系如實施例1。如圖6。
[0112]5.2轉基因煙草的RT-PCR檢測
[0113]5.2.1待檢測植株總RNA的提取
[0114]TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑒定的轉基因煙草和未轉化的煙草總RNA，方法同實施例1。
[0115]5.2.2cDNA 第一鏈的合成 [0116]方法同實施例1。
[0117]7.2.3cDNA第二鏈的合成及擴增
[0118]在PCR反應管中加入cDNA第一鏈反應產(chǎn)物1μ l，5XTaq buffer 4μ I,MgCl2 (25mM) 1.0 μ 1，dNTP (2.5mM) 0.5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 補足至20 μ 1，反應條件同實施例1。如圖7。
[0119]實施例6轉基因植株的模擬寒害處理及葉片質膜透性測定
[0120]轉基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。植株成活后選取生長一致的苗(5-7葉期)，進行模擬寒害處理。分別用打孔器從葉片中打取小圓片測定葉片質膜透性。如圖8所示。
[0121]實施例7:轉基因植株的模擬寒害處理葉片的MDA含量測定
[0122]轉基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量可以表示脂質過氧化的程度。煙草經(jīng)不同低溫溫度處理，MDA的含量均有所提高。從結果中分析得出，不管是0°C，_4°C低溫處理Shr，野生型煙草比轉基因煙草的MDA含量增加大，說明野生型植株膜質的過氧化程度相對較高。原因可能在于轉基因煙草降低了脂質過氧化的程度。如圖9所示。
[0123]序列表
[0124]〈110〉石河子大學
[0125]〈120〉天山雪蓮sikLEA基因在培育抗寒植物中的應用
[0126]<160>1
[0127]<210>1
[0128]<211>471
[0129]<212>DNA
[0130]〈213〉天山雪蓮(Saurrea.1nvolucrata Kar.et Kir.)
[0131]〈220〉
[0132]〈221>5’ UTR
[0133]〈222〉(O)[0134]〈220〉
[0135]<221>CDS
[0136]<222>(1)...(468)
[0137]〈220〉
[0138]〈221>3’ UTR
[0139]<222>(469)...(471)
[0140]〈400〉I
[0141]Translation of sikLEA (1-468)
[0142]Universal code
[0143]Total amino acid number: 155, MW = 16490
[0144]Max ORF starts at AA pos I(may be DNA pos I)for 155 AA (465bases), Mw = 16490
[0145]IAIG GOC GGA ATA AIG GAT MG GOS MG Q\A TIT GTT ICT GAT AM GTT GGA AGC AIG MG
[0146]IMET Ala Gly He MET Asp Lys Ala Lys Gln Fhe Val Ser Asp Lys Val Gly Ser MET Lys
[0147]61MG (IE GAG Gffi GAA GTG AQV GAT GTC GAT CIG AM GGC GTC GAT AOS AGT IGT GTC AOC
[0148]21Lys Pro Glu Ala Glu Val Ihr Asp Val Asp Leu Lys Gly Val Asp Ihr Ser Cys Val Ihr
[0149]121 TAC MC GCT GOC GTC MC GTTAQV MT 00S TAC GAT GQV MT Απ 00S ATC GGC GAG ATC
[0150]41Tyr Asn Ala Ala Val Asn Val Ihr Asn Pro Tyr Asp Ala Asn lie Pro lie Gly Glu lie
[0151]181 03T TAC ATA CTC AM AGT TOC GGC AGC GTG CIT GQV TOS GGG AOS GTT OCT GAC OOV GGT
[0152]61Arg Tyr lie Leu Lys Ser Ser Gly Ser Val Leu Ala Ser Gly Ihr Val Pro Asp Pro Gly
[0153]241 TOS CIT MC GGA MC ?Ο: GAC AOC TIG CTA MT GTC GGG Απ MG GTG OOV QVC MC GTG[0154.]81Ser Leu Asn Gly Asn Cys Asp Ihr Leu Leu Asn Val Gly lie Lys Val Pro His Asn Val
[0155]301 TIG GOC TGC TIG GTG MG GAC AIT GCT AOS GAT TGG GAC CTC GAC TAC GAG CIT GAA GTC
[0156]101Leu Ala Cys Leu Val Lys Asp lie Ala Ihr Asp Trp Asp Leu Asp Tyr Glu Leu Glu Val
[0157]361 ATC CTC GTT GTT GAT CIT OOV GTC ITC GGA MC AIT AGC ATA OCT GTG GCT AGC MG GGT
[0158]121lie Leu Val Val Asp Leu Pro Val Fhe Gly Asn lie Ser lie Pro Val Ala Ser Lys Gly
[0159]421GAG ATC MG CTC CCA TOG CTC TCA GAT TAC TGG GGT AM TCC GAA TGA GCC
[0160]141Glu lie Lys Leu Pro Ser Leu Ser Asp Tyr Trp Gly Lys Ser Glu ***
【權利要求】
1.一種從天山雪蓮中克隆的胚胎晚期豐富蛋白基因sikLEA，其序列為〈210>1，其特征在于該基因編碼區(qū)全長468bp，編碼155個氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的核苷酸序列,構建的植物表達載體。
3.根據(jù)權利要求2 述的植物表達載體，通過遺傳轉化獲得的抗寒轉基因植物。
【文檔編號】A01H5/00GK103882030SQ201210556022
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權日:2012年12月20日
【發(fā)明者】祝建波, 張林華, 王愛英, 馮玉杰, 沈海濤 申請人:石河子大學