專利名稱：枳轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種從積(Poncirus trifoliata)中分離、克隆的一個(gè)bHLH (basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環(huán)-螺旋)家族轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH,還涉及一種轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物經(jīng)常遭受一系列的環(huán)境脅迫，包括干旱、高溫、低溫、鹽堿、淹水等，其中，低溫是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量及限制植物地理分布最為重要的因素之一。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)形成一套復(fù)雜的機(jī)制來(lái)適應(yīng)和生存非生物逆境。近二十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家在對(duì)植物響應(yīng)非生物逆境分子機(jī)制解析方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步(Qin et al.，2011)。現(xiàn) 在清楚的是，植物逆境響應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的多個(gè)信號(hào)途徑的過程。外界脅迫信號(hào)由已知或未知的傳感元件識(shí)別，激活第二信使(如鈣離子，活性氧和肌醇磷酸鹽)。之后，由不同的信號(hào)元件轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳達(dá)、放大脅迫信號(hào)，最終導(dǎo)致一系列的生理和代謝改變。人們?cè)阼b定參與逆境響應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件中已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步。大量的證據(jù)表明，復(fù)雜的逆境信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括了大量的逆境響應(yīng)基因，根據(jù)基因產(chǎn)物的功能大體上可以分為兩類。第一類是由直接保護(hù)細(xì)胞免受損傷的功能蛋白組成，第二類是由在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)起調(diào)控作用的調(diào)節(jié)蛋白組成(Agarwal etal. , 2006;Chinnusamy et al. ,2006;Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2007;Lataand Prasad, 2011)。對(duì)逆境響應(yīng)基因的研究不僅能夠了解逆境響應(yīng)機(jī)制，而且也使得人們通過轉(zhuǎn)基因創(chuàng)造抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物(Wang et al. , 2003; Qin et al. , 2011; Lata andPrasad, 2011)。大量研究表明，通過過量表達(dá)功能基因和調(diào)控基因能夠顯著提高植物的抗逆性。但是，功能基因和轉(zhuǎn)錄因子在組成性表達(dá)的結(jié)果可能不同(Agarwal et al.，2006)。與功能基因相比，轉(zhuǎn)錄因子在提高植物的抗性功能更強(qiáng)大。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)能夠激活一系列的靶基因，它們可以會(huì)一起在應(yīng)對(duì)逆境上起作用，而不是一個(gè)轉(zhuǎn)入的功能基因起作用。因此，轉(zhuǎn)錄因子遺傳轉(zhuǎn)化是植物抗性遺傳改良的一種重要途徑和手段。植物基因組擁有大量的轉(zhuǎn)錄因子；例如，擬南芥中有多于1500個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，占它的基因組將近 6%(Riechmann et al.，2000),其中 bHLH(basic helix-loop-helix,喊性螺旋-環(huán)-螺旋)類轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的成員，該家族蛋白具有bHLH域，HLH區(qū)域位于b HLH模體的C端，由約60個(gè)氨基酸組成的兩個(gè)功能明顯不同bHLH模體組成。HLH模體參與同型二聚體或異質(zhì)二聚體的形成是由于α -螺旋的相互作用。堿性區(qū)域位于bHLH模體的N端,含有大約15個(gè)堿性氨基酸,它決定著DNA和蛋白互作的特異性(Buck and Atchley,2003; Toledo-Ortiz et al. , 2003; Li et al.，2006)。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中廣泛分布，如在擬南芥和水稻中分別有147和167個(gè)基因(Li et al.，2006 ；ToIedo-Ortiz etal.，2003)。在動(dòng)物中，bHLH家族成員的功能已經(jīng)被廣泛研究，但在植物中的研究相對(duì)較少。自第一個(gè)植物bHLH蛋白(Lc)在玉米中被報(bào)道(Ludwig et al.，1989)以來(lái)，在一些植物中鑒定了部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)表明，植物bHLH蛋白在不同的生物學(xué)過程起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，包括皮毛或根毛發(fā)育(Berhardt et al. , 2003; Tominaga-ffada et al. , 2012;Karasetal.，2009)、葉綠體發(fā)育(Monte et al.，2004),類黃酮生物堿和花青素合成(Nesi etal. , 2000; Yamada et al.，2011)。一些bHLH蛋白，諸如PIF3 (光敏色素相互作用因子3)、PIF4 及 HFRl 參與光誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ni et al. , 1998;Huq and Quail, 2002;Fairchildet al.，2000)。然而，植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在環(huán)境脅迫應(yīng)答方面卻不多。目前，研究得最為清楚的逆境應(yīng)答bHLH轉(zhuǎn)錄因子是ICEl (inducer of CBF expression 1)，它編碼一個(gè)MYC類似的轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)控CBF3啟動(dòng)子中的順式作用元件來(lái)提高植物的抗寒能力(Chinnusamy et al.，2003)。之后，鑒定了 2個(gè)與ICEl有較高同源性的bHLH基因，即擬南芥ICE2 及蘋果 MdCibHLHKFursova et al. , 2009;Feng et al.，2012)。其它與脅迫應(yīng)答有關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子包括AtbHLH38、AtbHLH39、FIT，它們能被缺鐵所誘導(dǎo)，AtbHLH38、AtbHLH39的過量表達(dá)能增強(qiáng)植物對(duì)鐵或鎘的吸收(Yuan et al. , 2008; Lignam et al. , 2011 ；ffuetal.，2012)，表明它們?cè)谥亟饘俣竞?yīng)答中起作用。此外，水稻的一個(gè)bHLH基因也被發(fā)現(xiàn)參與干旱脅迫應(yīng)答(Seo et al.，2011)。所有這些研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，在利用基因工程提高植物抗逆性方面有很大的潛力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供了一種從極抗寒的積(Poncirus trifoliata)中分離、克隆出的一個(gè)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子(申請(qǐng)人將其命名為PtrbHLH)，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種bHLH類轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的應(yīng)用，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入煙草和檸檬，鑒定其抗寒功能，為植物抗逆分子設(shè)計(jì)育種提供新的基因資源，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)、節(jié)水農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)手段以bHLH為關(guān)鍵詞搜索柑橘EST數(shù)據(jù)庫(kù)(HarvEST =Citrus ver. 0. 51)，搜索到17個(gè)和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進(jìn)行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列，序列分析發(fā)現(xiàn)拼接后的序列包括一個(gè)完整的ORF閱讀框，根據(jù)這條拼接好的序列作為一個(gè)參考序列，設(shè)計(jì)引物在枳上擴(kuò)增出基因PtrbHLH，其核苷酸序列為SEQ IDNO I所示，在SEQ ID NO 1所示序列的253-1824bp處為該基因的編碼區(qū)；其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，它包含1464bp的開放閱讀框，編碼487個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為
5.3，預(yù)測(cè)的分子量為53. 6kD。申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了克隆上述的基因PtrbHLH的cDNA序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3，；反向引物5’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3，。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草和檸檬，獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能。在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了枳PtrbHLH轉(zhuǎn)錄因子的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到抗寒性提高的植株，突破了傳統(tǒng)育種手段的障礙；此外，本發(fā)明的基因在多種植物中抗性穩(wěn)定，為植物抗寒基因工程提供了重要的基因資源。


圖I為一種本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2為一種PtrbHLH基因在低溫、鹽脅迫和脫水迫下的表達(dá)。其中圖2A是枳田間苗(未轉(zhuǎn)基因)在4°C處理下，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析本發(fā)明基因的相對(duì)表達(dá)量；圖2B是枳田間苗(未轉(zhuǎn)基因)在200mM氯化鈉處理下，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析本發(fā)明基因的相對(duì)表達(dá)量；圖2C是枳田間苗(未轉(zhuǎn)基因)室溫下脫水不同時(shí)間點(diǎn)下本發(fā)明基因的表達(dá)模式。圖3為一種PtrbHLH基因亞細(xì)胞定位示意圖。圖3A，GFP基因(對(duì)照)在明場(chǎng)(圖左)、暗場(chǎng)(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成 像；圖3B，PtrbHLH基因在明場(chǎng)(左)、暗場(chǎng)(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像。圖4為一種PtrbHLH基因轉(zhuǎn)錄激活鑒定示意圖。圖4A是空載體(pDEST 32)轉(zhuǎn)化的酵母在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況；圖4B是融合載體PtrbHLH轉(zhuǎn)化的酵母在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。圖5為一種PtrbHLH基因載體構(gòu)建示意圖。圖6為一種PtrbHLH基因轉(zhuǎn)化檸檬過程示意圖。左上為共培養(yǎng)的莖段，右上為在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出抗性芽，左下為芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上的叢芽，右下為生根培養(yǎng)苗。圖7為一種PtrbHLH基因轉(zhuǎn)化煙草和檸檬再生植株P(guān)CR鑒定示意圖。圖7APtrbHLH轉(zhuǎn)化煙草后得到的再生植株P(guān)CR鑒定圖(左為NPTII基因特異引物PCR擴(kuò)增圖，右為35S正向引物和PtrbHLH特異引物PCR擴(kuò)增圖)。圖7B是PtrbHLH轉(zhuǎn)化檸檬后得到的再生植株利用NPTII基因特異引物PCR擴(kuò)增圖。圖7C是PtrbHLH轉(zhuǎn)化檸檬后得到的再生植株利用35S正向引物和PtrbHLH特異引物PCR擴(kuò)增圖。圖8為一種鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)基因PtrbHLH的表達(dá)量分析示意圖。圖8A為轉(zhuǎn)基因煙草PtrbHLH的表達(dá)量分析，圖8B是轉(zhuǎn)基因檸檬PtrbHLH的過量表達(dá)分析。圖9為一種30天大小的PtrbHLH轉(zhuǎn)基因煙草苗(0E8和OElO兩個(gè)系)與野生型抗寒性比較及成活率統(tǒng)計(jì)示意圖。圖9A (左)是轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照低溫處理前的表型-M (中)是0°C處理23小時(shí)后的表型；9A (右)是0°C處理23小時(shí)并在25°C下恢復(fù)10天后的表型。圖9B是煙草轉(zhuǎn)基因系和野生型0°C處理23小時(shí)并在25°C下恢復(fù)10天后的成活率。圖10為一種60天大小的PtrbHLH轉(zhuǎn)基因煙草苗(0E8和OElO兩個(gè)系)與野生型抗寒性比較示意圖。左圖(上)是PtrbHLH基因轉(zhuǎn)化煙草和野生型在低溫處理前；(中)0°C處理23小時(shí)后的表型；(下)25°C恢復(fù)生長(zhǎng)5天后的表型。右圖是另一組重復(fù)。圖11為一種30天大小的PtrbHLH轉(zhuǎn)基因煙草苗(0E8和OElO兩個(gè)系)與野生型(TC處理23小時(shí)后細(xì)胞壞死染色、電導(dǎo)率測(cè)定示意圖。圖IlA是細(xì)胞壞死染色；圖IlB是電導(dǎo)率測(cè)定。圖12為一種PtrbHLH轉(zhuǎn)基因檸檬(#2和#8)與野生型抗寒性比較示意圖。
(上)野生型和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系低溫處理前的表型；(中)是0°C處理48小時(shí)轉(zhuǎn)入_3°C處理2小時(shí)后的表型；(下)是25°C恢復(fù)生長(zhǎng)5天的表型。圖13為一種轉(zhuǎn)基因檸檬與野生型低溫0°C處理48h小時(shí)轉(zhuǎn)入_3°C處理2小時(shí)的電導(dǎo)率測(cè)定及細(xì)胞壞死染色示意圖。圖13A電導(dǎo)率測(cè)定；圖13B細(xì)胞壞死染色。圖14為一種PtrbHLH轉(zhuǎn)基因煙草和檸檬及對(duì)應(yīng)的野生型在低溫處理后的DAB染色示意圖。指示H2O2含量，染色越深表明H2O2越多；圖14A顯示轉(zhuǎn)基因煙草(0E8和0E10)和野生型在低溫處理后的DAB染色；圖14B顯示轉(zhuǎn)基因檸檬(#2和#8)和野生型在低溫處理后的DAB染色。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例I PtrbHLH基因分離克隆及表達(dá)分析以bHLH為關(guān)鍵詞搜索柑橘EST數(shù)據(jù)庫(kù)(HarvEST =Citrus ver. O. 51)，搜索到17個(gè)和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進(jìn)行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列,序列分析發(fā)現(xiàn)拼接后的序列包括一個(gè)完整的ORF閱讀框，根據(jù)這條拼接好的序列作為一個(gè)參考序列，設(shè)計(jì)引物在枳上擴(kuò)增出基因PtrbHLH。使用Trizol試劑盒抽提積葉片4°C處理48小時(shí)的RNA (試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，抽提按照提供的說明書操作)，將抽提的IugS RNA樣品經(jīng)IU的DNaseI (購(gòu)自Fermentas公司)室溫處理30分鐘后，加入I μ I EDTA (25mM),于65°C溫育10分鐘。用MBI反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA(貨號(hào)K1621，購(gòu)自Fermentas公司，按照試劑盒說明書操作)，所得的第一鏈cDNA用于擴(kuò)增PtrbHLH基因全長(zhǎng)。50 μ I的反應(yīng)體系中包括200ng cDNAUX緩沖液(TransStart FastPfu緩沖液)、10mM dNTPUU Taq聚合酶(前述緩沖液和聚合酶購(gòu)自TRANS公司)及I. O μ M引物。正向引物5 ’ -TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3 ’ ；反向引物5 ’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3’。PCR反應(yīng)在ABI 7500 (Applied Biosystem)擴(kuò)增儀上按以下程序完成95°C I分鐘；95°C變性20秒、58°C退火20秒、72°C延伸60秒(共40個(gè)循環(huán))；循環(huán)完成后72°C延伸5分鐘。產(chǎn)生一條PCR條帶產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用E.Z.N.A t)NA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自O(shè)mega公司，美國(guó))回收特異帶(提取步驟參照使用說明)?；厥占兓腄NA溶液與pMD18-T載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，即TaKaRa公司)進(jìn)行連接反應(yīng)(按說明書操作)，連接反應(yīng)體系中PtrbHLH基因與pMD18-T載體的摩爾比為3 :1，連接反應(yīng)總體積是10 μ 1，包括5 μ I的2Χ緩沖液(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，4. 5 μ I純化的PCR產(chǎn)物和O. 5 μ I T載體。16 °C連接過夜。取10 μ I連接產(chǎn)物，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有50mgL氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽(yáng)性克隆，挑取2_4個(gè)克隆測(cè)序。為分析PtrbHLH基因是否對(duì)脅迫有響應(yīng)，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析該基因在低溫、鹽 和脫水處理下的表達(dá)。結(jié)果表明，低溫(見圖2A)、鹽(見圖2B)和脫水處理(見圖2C)均能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，表明它是一個(gè)逆境應(yīng)答基因。實(shí)施例2PtrbHLH基因亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活分析由于PtrbHLH基因有I個(gè)核定位信號(hào)(NLS)，本研究利用洋蔥表皮來(lái)研究PtrbHLH基因的亞細(xì)胞定位。利用RT-PCR擴(kuò)增出PtrbHLH基因整個(gè)ORF (閱讀框)，并在其擴(kuò)增引物兩端分別加上NcoI和SpeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。首先將擴(kuò)增產(chǎn)物裝在pMD 18-T載體上，從而得到一個(gè) PMD18-TN/s-PtrbHLH 重組載體。同時(shí)用 NcoI 和 SpeI 雙酶切 PMD18_TN/s-PtrPtrbHLH和pCAMBIA1302，回收產(chǎn)物并連接，從而得到pCAMBIA1302-PtrbHLH_GFP重組載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。農(nóng)桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進(jìn)行(I)劃平板，挑單克隆(含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌)于3毫升YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25mg/L)，28°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí),至OD6tltl約O. 6。(2)用手術(shù)刀將洋蔥內(nèi)表皮劃成Icm2大小,撕下置于MS基本培養(yǎng)基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上暗培養(yǎng)24小時(shí)。(3)按體積比為I :1000比例，接種50 μ I農(nóng)桿菌菌液于50毫升YEB (含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25 μ g/ml)中，28°C振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)。(4) 4000rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。(5)加入50毫升YEB培養(yǎng)基(含有IOmM MgCl2)，將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。(6)吸干表面菌液，置于MS基 本培養(yǎng)基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上28°C暗培養(yǎng)兩天。用Olympus BX61型顯微鏡觀察報(bào)告基因定位情況，結(jié)果表明，對(duì)照載體轉(zhuǎn)化時(shí)整個(gè)細(xì)胞中均有熒光(圖3A)，而重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中熒光只能在核中檢測(cè)到(圖3B)，說明PtrbHLH是一個(gè)核定位蛋白。采用PCR擴(kuò)增PtrbHLH基因ORF (擴(kuò)增引物5’端和3’端分別加上EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI和XhoI消化后，回收并亞克隆到用EcoR I和XhoI消化的線性pENTR 3C (購(gòu)自Invitrogen公司)載體上，得到融合載體pENTR 3C-PtrbHLH，再利用重組技術(shù)將pENTR 3C-PtrbHLH重組到pDEST 32表達(dá)載體上，從而得到融合表達(dá)載體pDEST 32-PtrbHLH。測(cè)序確認(rèn)序列無(wú)誤后將融合表達(dá)載體及空載體(pDEST 32)分別轉(zhuǎn)化酵母菌株MV203 (購(gòu)自invitrogen),然后在不同的缺失培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),空載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞只能在缺失培養(yǎng)基SD/-Trp上生長(zhǎng)(圖4A)，在添加了不同濃度的3-AT缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His上完全被抑制，而融合載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能在缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His (含有不同濃度的3-AT)上正常生長(zhǎng)(圖4B)，表明PtrbHLH具有轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化超表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)PMV載體的多克隆位點(diǎn)和PtrbHLH基因的編碼區(qū)序列上的酶切位點(diǎn)分析，選擇SalI和KpnI作為內(nèi)切酶。首先將以PtrbHLH基因的克隆子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過TA克隆連接到pMD18-T載體上，從而構(gòu)建一個(gè)重組載體pMD18-T-PtrbHLH。雙酶切體系總體積為 40 μ 1，其中含有 pMD18-T-PtrbHLH 質(zhì)粒 8μ 1、10ΧΜ 緩沖液(購(gòu)自 Takana) 4 μ UKpnI及XhoI各2μ I、雙蒸水24 μ I。在37°C酶切3-4h后純化回收。pMV載體的雙酶切體系同上。連接反應(yīng)體系中PtrbHLH基因與載體pMV分別為6 μ I和2 μ 1，反應(yīng)總體積為10 μ 1，10ΧΤ4連接緩沖液I μ 1，Τ4連接酶I μ 1，16°C連接14-16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選，挑單克隆PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，測(cè)序確定讀碼框沒有突變后，即PMV-PtrbHLH重組載體構(gòu)建成功。構(gòu)建完成的載體圖見圖5。應(yīng)用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)將重組載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中并保菌。
實(shí)施例4煙草遺傳轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下I.根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)取超低溫冰箱中保存的根癌農(nóng)桿菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養(yǎng)基中，28°C 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，待菌液濃度達(dá)到0D_=0. 3-0. 8時(shí)作浸染。2.浸染取未轉(zhuǎn)基因的煙草葉片，切成O. 5cmX0. 5cm大小,然后放入制備好的根癌農(nóng)桿菌菌液中，浸泡8-10分鐘，期間不斷振蕩。3.共培養(yǎng)取浸染后的煙草葉片，無(wú)菌濾紙吸干上面的的菌液，然后接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(葉背面向下)，25°C暗培養(yǎng)3天。4.篩選培養(yǎng)經(jīng)共培養(yǎng)3天后的煙草葉片，用500mgL濃度的頭孢霉素溶液洗一遍，然后無(wú)菌水沖洗3-5次,再轉(zhuǎn)移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mgL頭孢霉素的篩選
培養(yǎng)基中。5.生根培養(yǎng)待篩選培養(yǎng)基上的不定芽長(zhǎng)到Icm左右時(shí)，切下并轉(zhuǎn)入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養(yǎng)基上。6.煙草苗轉(zhuǎn)入土培待生根后的轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，由生根培養(yǎng)基中取出，用自來(lái)水洗凈轉(zhuǎn)化苗上的培養(yǎng)基，并栽植于滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中。煙草轉(zhuǎn)化苗所用培養(yǎng)基見表I。表I煙草轉(zhuǎn)化苗所用培養(yǎng)基配方
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丨工,!,JiifrU-OJ ing/L NAA^HlO nmL Km -5()0 rng^L Ccf7.陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草初步確定按照上述方法得到轉(zhuǎn)PtrbHLH煙草抗性芽，提取DNA。方法如下設(shè)計(jì)引物NPTII和35S+基因內(nèi)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性苗。鑒定為可能的陽(yáng)性植株移栽后獨(dú)立收獲種子(Tl代種子)，4°C春化處理3天，取O. Ig在I. 5ml的離心管中，先用70%酒精浸泡種子20秒，接著用滅菌雙蒸水洗一次，再加入Iml 2. 5%NaC10表面消毒7分鐘，充分振蕩，棄去NaClO后用滅菌雙蒸水洗3次,最后用接種針將滅好的種子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培養(yǎng)基的上，結(jié)果表明本發(fā)明獲得的抗性苗在抗性平板上能正常生長(zhǎng)，為綠色，而非抗性苗則黃化死去。成活的植株移栽再收獲Tl代種子，T2代種子用于播種及抗性分析。實(shí)施例5朽1檬遺傳轉(zhuǎn)化I、取檸檬種子，用lmol/L的NaOH浸泡15分鐘后洗凈，再在超凈工作臺(tái)上用2%(體積比)的次氯酸鈉浸泡滅菌15-20min，無(wú)菌水洗滌3次再在無(wú)菌條件下剝?nèi)シN皮，接種于MT固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3-4周再光照培養(yǎng)3-5d用于轉(zhuǎn)化。2、農(nóng)桿菌在含有卡那霉素50mg/L的固體LB培養(yǎng)基上劃線，28°C暗培養(yǎng)兩天；挑取單菌落接種在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培養(yǎng)2-3天；用手術(shù)刀刮下已長(zhǎng)好的農(nóng)桿菌，接種在不加抗生素的液MT培養(yǎng)基中，同時(shí)加20mg/L (IOOuM) AS，28°C 200r/min振蕩培養(yǎng)2h (同時(shí)在這段時(shí)間準(zhǔn)備切上胚軸)；用分光光度計(jì)測(cè)量菌液的OD6tltl值，用MT液體培養(yǎng)基調(diào)整OD6tltl值到O. 6-0. 8進(jìn)行侵染。3、取實(shí)生苗上胚軸，于超凈工作臺(tái)斜切成1-1. 5cm長(zhǎng)莖段，切好的莖段暫時(shí)放于滅菌的空三角瓶中(加少量水保濕)，待農(nóng)桿菌菌液制備完成后用于轉(zhuǎn)化。4、將切好的外植體浸泡在已制備好的農(nóng)桿菌菌液里，侵染20min，中間搖動(dòng)幾次。侵染完后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面菌液，再接種到共培養(yǎng)基上21-23°C暗處共培養(yǎng)3天。5、共培養(yǎng)3天后，用無(wú)菌水洗3-5次，再用無(wú)菌吸水紙吸干表面的農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)到加有卡那霉素50mg/L及頭孢霉素400mg/L的篩選培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)4周后再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出抗性芽，當(dāng)抗性芽>0. 5cm時(shí)，再轉(zhuǎn)到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上促其伸長(zhǎng)。待芽有I. 5cm長(zhǎng)時(shí)，切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，檸檬轉(zhuǎn)化過程見圖6。 常用培養(yǎng)基配方LB固體培養(yǎng)基蛋白胨10g/l+酵母提取物5gl+NaCl IOgl+瓊脂15g/l檸檬生芽及伸長(zhǎng)培養(yǎng)基MT+BA1. Omg/1 +瓊脂7. 5g/l+蔗糖35gl (pH為5. 8)檸檬生根培養(yǎng)基1/2MT+IBAO. lmg/1+NAA O. 5mg/l+ 活性炭 O. 5g/l+ 瓊脂 7. 5g/1+鹿糖 35g/l (pH 為 5. 8)實(shí)施例6轉(zhuǎn)化植株分子及生理鑒定I煙草及檸檬葉片DNA提取取適量的葉片放入I. 5mL離心管中，加液氮，充分研磨；然后加入700 μ I 65°C預(yù)熱的十六烷基三乙基溴化銨(簡(jiǎn)稱CTAB) DNA提取緩沖液(配方100mM Tris-HCl, pH8. 0，
I.5M NaCl, 50mM EDTA, pH 8.0,1% (質(zhì)量比)聚乙烯吡咯烷酮，2% (質(zhì)量比)CTAB)，65°C溫浴60-90分鐘(溫浴過程中每15分鐘取出離心管上下輕輕顛倒混勻)；10000Xg離心10分鐘；取上清，加600 μ I氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；10000 Xg離心15分鐘；取上清450 μ 1，加入900μ I預(yù)冷無(wú)水乙醇，34μ I 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，10000 X g離心10分鐘；棄上清后，用Iml 75% (體積比)的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。2陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)采用引物NPTII和35S上游引物和基因右側(cè)內(nèi)弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。弓丨物序列、反應(yīng)程序及體系分別見表2、表3和表4。首先采用NPTII引物對(duì)煙草再生植株進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均能擴(kuò)增出NPTII基因的片段，利用35S上游引物和基因右側(cè)引物進(jìn)行PCR，表明選取的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(圖7A)，表明它們?yōu)殛?yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。在檸檬鑒定中，采用NPTII引物對(duì)21個(gè)再生系進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系能擴(kuò)增出NPTII基因的片段(圖7B)，利用35S上游引物和基因右側(cè)引物對(duì)其中7個(gè)系進(jìn)行PCR，均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(圖7C)，表明它們均是轉(zhuǎn)基因植株。表2、引物序列信息
權(quán)利要求
1.一種分離的基因，其特征在于其序列為SEQ ID NO. I所示。
2.—種權(quán)利要求I所述的基因在提高植物抗寒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枳轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的應(yīng)用，以bHLH為關(guān)鍵詞搜索柑橘EST數(shù)據(jù)庫(kù)(HarvESTCitrusver.0.51)，搜索到17個(gè)和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進(jìn)行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列，序列分析發(fā)現(xiàn)拼接后的序列包括一個(gè)完整的ORF閱讀框，根據(jù)這條拼接好的序列作為一個(gè)參考序列，設(shè)計(jì)引物在枳上擴(kuò)增出基因PtrbHLH利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草和檸檬，獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能，突破了傳統(tǒng)育種手段的障礙；此外，本發(fā)明的基因在多種植物中抗性穩(wěn)定，為植物抗寒基因工程提供了重要的基因資源。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102719451SQ201210221920
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者劉繼紅, 黃小三 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)