甜蕎dreb轉(zhuǎn)錄因子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子涉及一種來(lái)自于植物且具有多于20個(gè)氨基酸的肽。所述的甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明運(yùn)用同源克隆技術(shù)（Race技術(shù)）從甜蕎中分離到甜蕎FeDREB1，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，使之在擬南芥中過(guò)表達(dá)，證實(shí)所分離的甜蕎FeDREB1可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜蕎FeDREB1在植物抗寒性和耐旱性狀改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來(lái)自于植物且具有多于20個(gè)氨基酸的肽。
【背景技術(shù)】
[0002]非生物脅迫(如干旱、高鹽、低溫)是植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物量形成和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量提高的主要限制因子。近20年來(lái)，大量受非逆境脅迫的誘導(dǎo)的基因被分離與功能鑒定，根據(jù)脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)物的作用，可將這些脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)基因的編碼產(chǎn)物在抗逆性中直接發(fā)揮功能，包括:1)直接保護(hù)細(xì)胞免受水份脅迫傷害的功能蛋白，如LEA蛋白(胚胎發(fā)生后期豐富蛋白)、滲透蛋白、抗凍蛋白、水通道蛋自、離子通道蛋白、伴侶蛋白和mRNA結(jié)合蛋白等滲透調(diào)節(jié)因子，如脯氨酸、甜菜堿、一些糖類(lèi)等的合成。在脅迫條件下，水通道蛋白，糖運(yùn)輸?shù)白裕彼徇\(yùn)輸?shù)鞍淄ㄟ^(guò)質(zhì)膜和液泡膜運(yùn)輸水分，糖類(lèi)和脯氨酸，以調(diào)節(jié)內(nèi)外滲透壓；2)毒性降解酶，如谷膚甘膚S轉(zhuǎn)移酶、可溶性環(huán)氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶等可以保護(hù)細(xì)胞，免受活性氧的傷害。第二類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物參與調(diào)控下游基因的表達(dá)以及信號(hào)的傳導(dǎo)，包括:I)感應(yīng)和傳一導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶，如活化分裂素的蛋白激酶、依賴鈣的蛋白激酶、受體蛋白激酶、核糖體蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶等；2)傳導(dǎo)信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子(乙烯反應(yīng)結(jié)合因子)、bZIP轉(zhuǎn)錄因子(帶有亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族)、MYC轉(zhuǎn)錄因子(帶有基本螺旋串的螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族)、MYB轉(zhuǎn)錄因子(帶有色氨酸串基元的轉(zhuǎn)錄因子家族)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子(N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列)、NAC轉(zhuǎn)錄因子(N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域)和DELLA轉(zhuǎn)錄因子；3)以及在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用的蛋自酶，如磷酸醋酶、磷酸酶c等。
[0003]植物的抗逆性往往是由多基因控制的數(shù)量性狀。植物對(duì)干早、低溫抗性的強(qiáng)弱往往不取決于某一單一基因，而是受許多基因的共同調(diào)控。一個(gè)關(guān)鍵因子可以調(diào)控許多相關(guān)功能基因的表達(dá)，因此，通過(guò)增強(qiáng)一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用可能使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。這與導(dǎo)入或改良個(gè)別功能基因來(lái)提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，將是提高作物抗逆性的更為有效的方法和途徑。研究表明DREB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在調(diào)控非生物脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起著重要的作用。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ER家族轉(zhuǎn)錄因子，它結(jié)合DRE或CRT脫水反應(yīng)元件,激活下游啟動(dòng)子區(qū)具有該元件的抗逆相關(guān)基因的表達(dá)。近年來(lái)，擬南芥、水稻、大麥、小麥、大豆、玉米、棉花和等大量植物中的DREB轉(zhuǎn)錄因子功能相繼被鑒定，證明它參與植物調(diào)控干旱、高鹽、低溫、病害和細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，提高植物耐低溫和干旱能力，是植物基因工程改良植物耐非生物脅迫的重要有效基因。如A.htalinaa的DREB1A/CBF3基因的超量表達(dá)能提高植株對(duì)低溫脅迫的耐性；Yamaguch1-Shinozaki等人(2006)的研究結(jié)果表明能有效的用，來(lái)提高作物的干旱、低溫的抗性。Dubuozet等人(2003)也證明水稻的以基因能明顯提高單子葉植物對(duì)干旱、低溫脅迫的耐性。甄偉等將CBFl基因轉(zhuǎn)入煙草和油菜基因組中，對(duì)轉(zhuǎn)化的煙草和油菜抗寒性的檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因油菜的抗寒性有明顯提高，轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等將擬南芥的CBFl轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)基因番茄葉片中的過(guò)氧化氫酶的活性比對(duì)照顯著提高，H202含量比對(duì)照明顯降低，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性得到顯著改善。韋善君等將玉米泛素啟動(dòng)子(Pubi)調(diào)控的CBFl基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)CBFl組成型表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性。金建鳳等將CBFl基因轉(zhuǎn)入水稻中，發(fā)現(xiàn)低溫處理后轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)脯氨酸含量比野生型明顯增加，植株的抗寒性也明顯增強(qiáng)。金萬(wàn)梅等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將擬南芥CBFl基因?qū)氩葺?，提高了草莓?duì)低溫脅迫的抵抗力。DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物抗逆的作用明顯，是目前被用來(lái)提高農(nóng)作物的耐逆功能的重要基因之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種能有效提高植物耐逆性的甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明還提供了該轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。
[0005]本發(fā)明還提供了一種提高植物耐逆性的方法。
[0006]本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子命名為甜蕎FeDREBl。
[0007]本發(fā)明所述的甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本發(fā)明所述的甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所
/Jn o
[0009]本發(fā)明還提供了含有上述編碼基因的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌。
[0010]本發(fā)明所述的提高植物耐逆性的方法，將含有上述編碼基因?qū)胫参镏屑纯伞Ｆ渲兴龅哪湍嫘詾榭购院湍秃敌浴?br> [0011]本發(fā)明運(yùn)用同源克隆技術(shù)(Race技術(shù))從甜蕎中分離到甜蕎FeDREBl，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，使之在擬南芥中過(guò)表達(dá)，證實(shí)所分離的甜蕎FeDREBl可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜蕎FeDREBl在植物耐寒性狀改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為轉(zhuǎn)化FeDREBl擬南芥T3代植株和野生型植株耐寒效果比較。
[0013]圖2為轉(zhuǎn)化FeDREBl擬南芥T3代植株和野生型植株耐旱效果比較。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施1:甜蕎FeDREBl基因的制備一
(I)將甜蕎“西農(nóng)9976”種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，在光照條件為8000LUX，溫度為25°C條件下生長(zhǎng)3周成苗，將整個(gè)植株放入一 6°C低溫培養(yǎng)箱中，冷脅迫6小時(shí)，取植株葉片，錫箔紙包裹后，迅速放入液氮，于一 80°C低溫冰箱永久保存，采用Takara公司RNA提取試劑盒，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最終用PCR方法擴(kuò)增FeDREBl基因序列。其擴(kuò)增引物如下，其上游引物中引入Xbal酶切位點(diǎn)，下游引物中引入Sac I酶切位點(diǎn):
上游引物:5’_ CGTCTAGAGCGATCATGGATTCTTTCTC -3’
下游引物:5’- AGGAGCTCGGTTCAAAATTTACCAAG -3’
PCR反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的甜蕎DREB轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.含有權(quán)利要求2所述編碼基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求2所述編碼基因的細(xì)胞系。
5.含有權(quán)利要求2所述編碼基因的宿主菌。
6.一種提高植物耐逆性的方法，其特征在于將含有權(quán)利要求2所述編碼基因?qū)胫参镏屑纯伞?br> 7.如權(quán)利要求6所述的提高植物耐逆性的方法，其特征在于所述的耐逆性為抗寒性和耐旱性。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103483436SQ201310377196
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】方正武, 馮佰利, 王鵬科, 高小麗, 高金鋒, 楊璞 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)