一種用于叉頭轉錄因子o1基因突變檢測的試劑及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學及臨床分子診斷技術領域，特別是設及一種用于叉頭轉錄 因子Ol(FOXOl)基因突變檢測的試劑、PCR檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高 度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程 中，具有至關重要的作用。如果運條信號通路中的關鍵蛋白發(fā)生突變或者異常表達，導致信 號異?；罨?，就可能誘導癌癥的發(fā)生。Wnt信號通路包括經(jīng)典的Wnt信號通路與非經(jīng)典的Wnt 信號通路，在經(jīng)典通路即Wnt-0-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的 F;rizzle/LRP5/6協(xié)同受體后抑制細胞內游離0-catenin蛋白的憐酸化和降解，細胞質中的 0-catenin蛋白水平升高后將發(fā)生0-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中0-catenin蛋白 升高，胞核中e-catenin蛋白能夠聯(lián)合巧go2、Bd-9W及化xMl蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因 子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游祀基因的轉錄激活。
[0003] FOXO1蛋白是Wnt信號通路中0-caten in下游重要成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應激 狀態(tài)下，F(xiàn)OXOs能夠競爭性地與0-catenin結合，減少后者與TCF的結合，從而影響Wnt信號通 路的傳導。目前越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤中FOXOl蛋白均呈現(xiàn)不同程度的突 變。
[0004] 目前研究核屯、信號通路的核屯、分子調控機制，W及某些重要成員在細胞中的表達 水平，已經(jīng)成為治療腫瘤的一種關鍵手段。近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，W及FOXOl 蛋白作為Wnt信號通路重要成員其突變水平的研究，已經(jīng)成為研究開發(fā)腫瘤藥物急需解決 的重要問題，尤其是在FOXOl轉錄激活結構域中發(fā)生的突變，對FOXOl蛋白發(fā)揮功能啟動非 常重要的作用，例如在子宮內膜癌細胞中檢測出R609CS突變，前列腺癌細胞中檢測出D624N 突變等。
[0005] 膚核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類W多膚骨架取代糖憐酸主鏈的DNA 類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的 第S代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即W中性的膚鏈酷胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代 了DNA中的戊糖憐酸二醋鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可W通過Watson-化ick堿基配對的 形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA 之間不存在靜電斥力，因而結合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的 雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠 優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。
[0006] 本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類 似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核巧酸與其祀基因結合時因電荷相互排斥 所導致的雜交不穩(wěn)定性，結合不易受雜交液離子強度的影響，從而顯示出極強的雜交優(yōu)勢， 大大提高了檢測靈敏度。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中如何確定Wnt信號通路中核屯、的信號分子FOXOl 基因突變情況，W及如何解釋核屯、分子FOXOl在腫瘤細胞中的突變水平變化的困難，提供了 一種檢巧UWnt信號通路中FOXOl基因突變檢測試劑、PCR檢測方法及應用。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種用于叉頭轉錄因子01F0X01基因突變檢測的試劑，包括 用于阻斷野生型FOXOl基因擴增的野生型PNA序列、用于特異性擴增R609C、D624N突變型 FOXOl基因序列的一組引物對及突變型PNA巧光探針：
[0009] 所述檢測FOXOl基因 R609C突變正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1;
[0010] 所述檢測FOXOl基因 R609C突變反向引物如序列表中沈Q ID NO.2;
[00川所述檢測FOXOl基因 D624N突變正向引物如序列表中沈Q ID NO.3;
[001^ 所述檢測FOXOl基因 D624N突變反向引物如序列表中沈Q ID NO.4;
[0013] 所述檢測FOXOl基因 R609C突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.5;
[0014] 所述檢測FOXOl基因 D624N突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.6;
[0015] 所述特異性結合包含F(xiàn)OXOl基因609密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；
[0016] 所述特異性結合包含F(xiàn)OXOl基因624密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；
[0017] 所述PNA巧光探針的5'端的巧光報告基團為:FAM、皿乂^61\1〇6、￥1(：、1?0乂、切3或 〔75,3'端的澤滅基團為：14134、6。11986、8冊1、8冊2、8冊3或048(：化。
[0018] 本發(fā)明所述的檢測試劑還包括PCR反應液、609密碼子和624密碼子突變型參考品、 609密碼子和624密碼子野生型參考品，其中PCR反應液包括:DEPC水、具有5 ' 一3 '外切活性 的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆轉錄酶、01 igo (肌)和含Mg離子的溶 液。
[0019] 所述609密碼子突變型參考品為含SEQ NO.9的重組質粒DNA;
[0020] 所述609密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 10的重組質粒DNA;
[0021] 所述624密碼子突變型參考品為含SEQ NO. 11的重組質粒DNA;
[0022] 所述624密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 12的重組質粒DNA;
[0023] 所述具有5 ' 一3 '外切活性的DNA聚合酶為化q酶；
[0024] 所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應體系中的終濃度為：Taq酶0.0 IU/化~ 0.0抓AiUdNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer IX ,RNASIMOU/化~60UAiL，M-MLV逆轉錄 酶20011/化~3201]/化，]\%(：12 1.5~5.01111，溶劑為肥?(：水。
[0025] 具體地，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9測，所述反向引物的終濃度為0.05~ 0.9咖，所述oligo(dT)終濃度為0.05~0.9測，所述互補PNA序列終濃度為0.05~0.9咖，所 述巧光探針的終濃度為0.05~0.9iiM。
[0026] 本發(fā)明所述的試劑進行實時巧光定量PCR的反應程序為:42°C逆轉錄20min;94°C 預變性，2min; 95 °C變性，30s，58 °C，45s川欠集巧光），進行40個循環(huán)。
[0027] 本發(fā)明的原理是通過構建與FOXOl基因野生型互補的一段膚核酸PNA序列，當膚核 酸PM序列與FOXOl基因互補結合時，任一突變均可導致PNA/DNA產(chǎn)生錯配，從而使得溶解溫 度發(fā)生改變。進而根據(jù)FOXOl基因突變型設計特異性的膚核酸PNA探針W及引物對FOXOl突 變型基因進行巧光定量PCR擴增，經(jīng)過一輪的PCR擴增后，即可將FOXOl基因突變型與野生型 進行區(qū)分開來。
[0028] 進一步地，本發(fā)明還提供了所述的試劑在制備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用， 所述癌細胞為宮內膜癌、前列腺癌。
[0029] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：FOXOl基因是Wnt信號通路中0-catenin蛋白上游發(fā)揮著重要功能的基因，本發(fā)明提供了直接檢測Wnt信號通路中FOXOl基 因突變檢測的試劑，借助于所述檢測試劑能夠通過實時巧光定量PCR法在轉錄水平快速檢 測出FOXOl基因的突變，而與普通實時巧光定量PCR不同的是，本發(fā)明設計野生型PNA序列， 可有效抑制野生型基因組擴增，只富集突變型基因擴增，大大提高了檢測特異性，我們使用 的突變型PNA巧光探針更加靈敏，本發(fā)明為抗癌藥物的篩選，新祀向藥物的機制研究都提供 了非常有力的工具。
[0030] 同時本發(fā)明的實驗體系可W在任何一臺實時巧光定量PCR儀器上進行，上述引物 置于八聯(lián)管中，進行實時巧光定量PCR檢測，實驗操作簡單，費用低廉，結果重復性，敏感性 好，是研究腫瘤相關藥物作用機理及基礎科學研究的一種重要手段。
【附圖說明】
[0031 ]圖1是本發(fā)明實施例中所述膚核酸質譜圖；
[0032] 圖2是樣品、R609C突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
[0033] 圖3是樣品、D624N突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
【具體實施方式】
[0034] 通過W下詳細說明結合附圖可W進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施 例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不W任何方式限制本發(fā)明掲示的其余內容。
[0035] 本發(fā)明通過子宮內膜癌細胞進行舉例說明，但是本發(fā)明不局限于子宮內膜癌細 胞，本發(fā)明所述檢測試劑還可W應用于前列腺癌。
[0036] 實施例中的有關DNA和RNA基本操作均參考《分子克?。簩嶒炇也僮髦改稀?金冬雁 等譯，科學出版社，北京（1998))和《精編分子生物學指南》（顏子譯，科學出版社，北京 (1998))。
[0037] 本發(fā)明中IsWkawa(人子宮內膜癌Ish化awa細胞系)購自美國ATCC，培養(yǎng)細胞所使 用的RPMI-1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清均購自英俊公司，其他試劑主要購自寶生物工程(大 連)有限公司。
[0038] 【實施例1】引物探針設計
[0039] 根據(jù)美國國家生物技術信息中屯、（National Center for Biotechnology Information，NCBI) (http : //www. ncbi . nlm. nih . gov)報道的FOXOl mRNA序列（NCBI Ref erence Sequence : NM_002015.3)，使用Appl ied Biosystems公司開發(fā)的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設計特異的FOXOl引物與探針。
[0040] FOXOl R609C：
[0041 ] FOXOl-F: 5' -CCTTCTCCACCAGGAGAAGCTC-3';(沈Q NO. I)
[0042] FOXOI-R: 5' -CTTGACACTGTGTGGGAAGCTT-3';(沈Q NO. 2)
[0043] 突變型尸0乂01。臟）斗：5,施-167^41764616(：7^64(：-8冊3'；（沈9^.5)
[0044] 野生型F0X01-PNA: 5 ' -TGTTCATTGAGCGCTTAG-3 ' ；（SEQ NO. 7)
[0045] 突變型祀序列：
[0046]
[0化引 W上:F:fo;rward，正向;FOXOl-F表示用于檢測核酸的正向引物。
[0化9] R:reverse，反向;FOXOl-R表示用于檢測核酸的反向引物。
[0060] P:probe，巧光探針;FOXOl-P表示用于檢測核酸的巧光探針，該巧光探針為化qMan 巧光探針。
[0061 ]在本發(fā)明實施例中，修飾巧光探針的5 '端的巧光報告基團可W為:FAM，皿X，TET， 106，￥1(：，1?0乂，切3或切5;修飾巧光探針的3'端的澤滅基團可^為^411?4,6。11936,8朋1， B冊2，BHQ3或DABCTL，該巧光報告基團與澤滅基團不影響巧光定量PCR的擴增，只需根據(jù)探 針的