一種快速獲得基因敲除細胞株的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速獲得基因敲除細胞株的方法，首先根據(jù)敲除目標基因設計sgRNA靶點，根據(jù)設計的靶序列合成多對單鏈寡核苷酸，每對分別兩兩退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)酶切，連入pX335載體中，分別獲得sgRNA表達質(zhì)粒載體；然后，將sgRNA表達質(zhì)粒載體兩兩組合與敲除目標基因的SSA載體，共同轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞即可獲得基因敲除細胞株。采用本發(fā)明方法可以快速高效的獲得穩(wěn)定的基因敲除細胞株。
【專利說明】
一種快速獲得基因敲除細胞株的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速獲得基因敲除細胞株的方法，具體是通過CRISPR/Cas9基因 敲除法篩選出基因敲除的細胞株。
【背景技術】
[0002] 基因敲除(knockout)技術是20世紀80年代發(fā)展起來的。是指一種遺傳工程基因修 飾技術，針對某個感興趣的遺傳基因，通過一定的基因改造過程，令特定的基因功能喪失， 并研究可能進一步對相關生命現(xiàn)象造成的影響，進而推測該基因的生物學功能。
[0003] 目前為止基因敲除的方法分三種：1.鋅指核酸酶(ZFNs);2.轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應 物核酸酶(TALENs);3.CRISPR-Cas9。鋅指核酸酶ZFNs在植物基因組定點改造上的可能前 景，但由于ZFNs的合成組裝技術難度大，一般實驗室難以實施，而且ZFNs易于對基因組進行 非特異性切割，或?qū)Π悬cDNA切割效率低，一直限制其進入實際應用。相比于傳統(tǒng)的鋅指核 酸酶(ZFNs)技術，TALENs具有獨特的優(yōu)勢:設計更簡單，特異性更高。但具有一定細胞毒性， 模塊組裝過程繁瑣，一般需要求助于外包公司。而CRISPR-Cas9系統(tǒng)對特異位點的識別靠小 的crRNA的引導，CRISPR區(qū)可以有一系列的crRNA組成，每個針對特異位點的crRNA只有幾十 個堿基，整個載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建。
[0004] CRISPR-Cas92013年1月份，美國兩個實驗室在《Science》雜志發(fā)表了基于CRISPR-Cas9技術在細胞系中進行基因敲除的新方法，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9出現(xiàn)，它主要是基于細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點是制作簡單、成本 低、作用高效。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/ Cas(CRISPR-aSS〇Ciated)系統(tǒng)是一種廣泛存在于細菌與古細菌中的，由RNA介導的可遺傳 的獲得性免疫系統(tǒng)，這種免疫系統(tǒng)為宿主細胞提供了對外源DNA(如噬菌體質(zhì)粒）的免疫功 能。
[0005] 此系統(tǒng)的工作原理是crRNA(CRISPR_derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA (trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白 在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有 引導作用的sgRNA(short guide RNA)，足以引導Cas9對DNA的定點切割。
[0006] 操作步驟如下:第一步:據(jù)靶序列設計RNA序列；第二步:根據(jù)自身需要選擇sgRNA 表達載體構(gòu)建，或sgRNA體外轉(zhuǎn)錄合成;第三步:選擇CRI SPR/Cas9載體;第四步:sgRNA活性 檢測;第五步:穩(wěn)定表達Cas9蛋白細胞株篩選。
[0007] CRISPR-Cas9系統(tǒng)，被稱為第三代基因編輯技術。相比于它的兩位前輩ZFN系統(tǒng)和 TALEN系統(tǒng)，它有著一些無可比擬的優(yōu)點。首先，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位置更多。其次， CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性，例如可以通過對Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈， 而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來的非同源末端連接造成的染色體變異 風險。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞 的影響。第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完 成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的是提供一種快速獲得基因敲除細胞株的方法，可以快速獲得高效的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，進而通過轉(zhuǎn)染實驗結(jié)合96孔板篩選獲得基因敲除細胞株。
[0009]為此，本發(fā)明采用的技術方案是，一種快速獲得基因敲除細胞株的方法，首先根據(jù) 敲除目標基因設計sgRNA靶點，根據(jù)設計的靶序列合成多對單鏈寡核苷酸，每對分別兩兩退 火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)酶切，連入pX335載體中，分別獲得sgRNA表達質(zhì)粒載 體;然后，將sgRNA表達質(zhì)粒載體兩兩組合與敲除目標基因的SSA載體，共同轉(zhuǎn)染預先培養(yǎng)好 的細胞，即可獲得基因敲除細胞株。
[0010]所述敲除目標基因的SSA載體構(gòu)建時，將目標片段與含有雙熒光素酶報告基因的 SSA-載體骨架連接獲得SSA-目標基因載體。
[0011]獲得基因敲除細胞株后，通過雙熒光素酶報告基因進行敲除效率檢測;選取敲除 效率較高的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染細胞，篩選細胞單克隆，測序，在靶基因特定區(qū)域發(fā)生序列突變的 單克隆細胞即可判斷為基因成功敲除的細胞。
[0012]以采用本發(fā)明方法獲得綿羊DKK2基因敲除細胞株為例，具體步驟如下，
[0013] (1)根據(jù)綿羊DKK2基因的第一外顯子的編碼區(qū)設計SgRNA靶點，正向靶標T1序列如 SEQIDNo.l所示，反向靶標T2序列如SEQIDNo.2所示；
[0014] (2)根據(jù)步驟（1)設計的靶序列合成單鏈寡核苷酸T1-F、T1-R、T2-F、T2-R、T3-F、 T3-R、T4-F、T4-R、T5-F、T5-R，序列分別如SEQIDNo·3-12所示；Tl-F與Tl-R，T2-F與T2-R， T3-F與T3-RT4-F與T4-R，T5-F與T5-R分別兩兩退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)酶 切，連入PX335載體中，分別獲得pX335-sgRNA-Fl、pX335-sgRNA-R2、pX335-sgRNA-F3、 pX335-sgRNA-F4、pX335-sgRNA-R5 載體；
[0015] (3) SSA載體的構(gòu)建
[0016] ①引物設計
[0017] 根據(jù)綿羊DKK2基因組序列設計引物并在引物5'端分別添加 AscI和Sail酶切位點， 獲得兩對引物SSAFl、SSARl、SSAF2、SSAR2序列分別如SEQIDNo.l3-16所示；
[0018] ②PCR及TA克隆
[0019]提取綿羊基因組DNA，以此為模板用步驟①的兩對引物進行PCR擴增，分別獲得 450bp、530bp的片段，與T載體連接并測序，選取無突變的質(zhì)粒用于后續(xù)酶切試驗；
[0020] ③用AscI和Sail酶切步驟②所得質(zhì)粒及序列如SEQ ID No·19所示的SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN質(zhì)粒，將回收的450bp或530bp的片段和SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN的載體骨 架連接，獲得SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體，序列如SEQIDNo.20所示 ；
[0021] (4)將上述獲得的 pX335-sgRNA-Fl 載體、pX335-sgRNA-R2 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2 載體，作為一個實驗組；將 pX335-sgRNA-F3 載體、pX335-sgRNA-R2 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2 載體為一個實驗組;pX335-sgRNA-F4 載體、pX335-sgRNA-R5 載體 和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體為一個實驗組；以pX335載體和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體組合作為陰性對照組，各組分別轉(zhuǎn)染預先培養(yǎng)好的細胞，即可獲得DKK2基因敲除 細胞株。
[0022]最后，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行敲除效率檢測。選取敲除效率較 高的一對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，使用96孔板篩選細胞單克隆。將獲得的細胞單克隆擴大培養(yǎng)，提取 基因組DNA，PCR，克隆測序。在靶基因特定區(qū)域發(fā)生序列突變的單克隆細胞即可判斷為DKK2 基因成功敲除的細胞。
[0023]本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] (1)本發(fā)明方法適用范圍廣泛，采用本發(fā)明方法可以獲得穩(wěn)定的基因敲除細胞株。 不僅僅是可以快速獲得DKK2基因敲除細胞株，也可以適用于其它的基因敲除細胞株的獲 得。
[0025] (2)本發(fā)明方法通過設計多對引物，構(gòu)建多組pX335-sgRNA載體，分布在目的基因 的不同位置，根據(jù)序列特點采用載體兩兩配對組合方式，分別轉(zhuǎn)染細胞，可快速篩選出效率 尚的一對。
[0026] (3)本發(fā)明采用SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN質(zhì)粒，該質(zhì)粒改造自MSTN質(zhì)粒，帶有 AscI和Sail酶切位點，內(nèi)部含有一個螢火蟲熒光素酶表達基因和一個被目的基因隔斷的不 表達的海腎焚光素酶表達基因，對目的基因進彳丁有效的切割之后，海腎焚光素酶表達基因 發(fā)生重組使得海腎熒光素酶高效表達，通過表達量即可鑒定敲除的效率。可以直接在細胞 體內(nèi)進行敲除效率的驗證。極大提高工作效率。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實施例1設計sgRNA靶標設計圖。
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例1構(gòu)建的sgRNA表達載體電泳圖。
[0029] 圖3為本發(fā)明實施例1構(gòu)建的sgRNA表達載體測序序列對比圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明實施例1采取敖漢細毛羊全血基因組DNA，PCR獲得450bp、530bp片段 電泳圖。
[0031] 圖5為圖4中的450bp片段測序結(jié)果。
[0032] 圖6為本發(fā)明實施例lSSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體AscI和SaU酶切結(jié)果。
[0033]圖7為將450bp片段進行切膠回收然后與通過AscI和SaH酶切并切膠回收的MSTN 載體進行T4DNA連接酶連接并測序驗證SSA載體構(gòu)建情況，并且對鏈接完成的載體進行酶 切。
[0034]圖8為本發(fā)明實施例1敖漢細毛羊羊胎兒成纖維細胞原代培養(yǎng)3d和5d后的細胞形 ??τ 〇
[0035] 圖9為本發(fā)明實施例1敖漢細毛羊羊胎兒成纖維細胞傳代培養(yǎng)后胰酶消化后細胞 形態(tài)和傳代后3~5d細胞形態(tài)。
[0036] 圖10為本發(fā)明實施例1敖漢細毛羊羊胎兒成纖維細胞轉(zhuǎn)染前細胞形態(tài)。
[0037] 圖11、圖12為本發(fā)明實施例2雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行敲除基因效率 檢測結(jié)果。注：相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異極顯著(p〈〇.05)，相同字母大 小寫之間表示差異顯著(P〈〇. 01)?；驒z測結(jié)果相同處理組間比較，不同處理組間不進行 比較。
[0038] 圖13-15為本發(fā)明本發(fā)明實施例3獲得的DKK2基因敲除細胞株的突變位點。
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體試驗方法對本發(fā)明的技術方案及其所產(chǎn)生的技術效果進行進一步 的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教 導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0040] 本發(fā)明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領域常規(guī)方法。下述實施例中所用 的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041 ]下面以獲得敖漢細毛羊成纖維細胞DKK2基因敲除細胞株為例，對本發(fā)明方法做進 一步詳細說明：
[0042] 實施例1.獲得DKK2基因敲除細胞株
[0043] (1)靶標設計
[0044] 首先在NCBI GI :417531944的序列中提取綿羊DKK2基因第一外顯子的編碼區(qū)設計 sgRNA靶點，正向靶序列是GCTCACAGTTCGGCAGCTCG(74-93)(SEQIDNo·l)、反相靶序列是 GCTCTCCACCATCAGCACCG(56-75)(SEQIDNo.2)。兩個靶序列呈"頭對頭"的排布方式，二者 相距-2bp，即有2bp的重疊。分別命名為正向靶標T1、反向靶標T2。靶標設計如圖1所示。 [0045] (2)sgRNA表達質(zhì)粒對的構(gòu)建
[0046]根據(jù)步驟(1)設計的靶序列送公司合成單鏈寡核苷酸，具體序列如下：
[0057] 其中T1-F與T1-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段T1，經(jīng)Bbsl酶切，連入pX335 載體中，獲得pX335-sgRNA-Fl載體;T2-F與T2-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段T2，經(jīng) Bbsl酶切，連入pX335載體中，獲得pX335-sgRNA-R2載體。T3-F與T3-R、T4-F與T4-R、T5-F與 T5-R分別兩兩退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段1334、15，經(jīng)仙81酶切，連入?乂335載體 中，獲得pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-F4、pX335-sgRNA-R5載體。質(zhì)粒均送公司測序驗證， 測序引物bbsR的序列為：5'AAAGTCCCTATTGGCGTTAC 3'（SEQ ID No.17)。
[0058] 構(gòu)建結(jié)果：
[0059] 1'132、了334、了5的五個片段長度分別為2仙？、2牝？、25&?、25&?、25&?。將五個靶序 列和通過Bbsl酶切的px335質(zhì)粒進行T4DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后測序結(jié)果與原序 列對比一致。構(gòu)建的載體電泳結(jié)果如圖2所示，測序序列對比結(jié)果如圖3所示。
[0060] (3)SSA載體構(gòu)建設計引物設計
[0061 ]選取綿羊 DKK2 基因組序列（NCBI GI :417531944)的一段（601bp，18259800- 18260400)(SEQ ID吣.18)，使用?^11^-81^1'軟件設計引物。引物設計如下：
[0064]在上述引物5'端分別添加 AscI和SaU酶切位點，得：
[0069]上述引物送生物公司合成。
[0070] (4)PCR 及 TA 克隆
[0071] 采取敖漢細毛羊全血，提取基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，使用上述步驟 (3)設計合成的引物對，分別獲得450bp、530bp左右的片段（如圖4所示）。將PCR擴增所得到 的450bp片段與T載體通過T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，做菌液PCR鑒定連接結(jié)果并 送往公司測序:菌液PCR結(jié)果與原基因 PCR結(jié)果一致，證明鏈接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞成功，測序結(jié) 果如圖5所示。選取無突變的質(zhì)粒用于后續(xù)酶切試驗。
[0072] (5)SSA載體構(gòu)建
[0073] 使用AscI和SaH酶切上述步驟(4)所得質(zhì)粒及SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN質(zhì)粒，將 回收的450bp或530bp左右的片段及SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN的載體骨架(6.5kb)連接，獲 得 SSA-hRluc-ps iCHECK-DKK2 載體。
[0074] AscI和Sail酶切ΤΑ克隆載體結(jié)果如圖6所示。將450bp片段進行切膠回收然后與通 過AscI和Sail酶切并切膠回收的MSTN載體進行T4DNA連接酶連接并測序驗證SSA載體構(gòu)建 情況，并且對鏈接完成的載體進行酶切，結(jié)果如圖7所示。
[0075] (6)成纖維細胞的培養(yǎng)
[0076]原代培養(yǎng)從試驗羊場將懷孕40天的母羊取子宮立刻帶回實驗室進行細胞分離(實 驗前照射紫外30min)。用滅過菌的眼科剪、眼科鑷子將胎兒外的組織清理掉，用含有雙抗的 PBS將胎兒清洗幾遍，并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。取新的眼科剪、眼科鑷子，剝離胎兒，去除頭、 尾巴、四肢、內(nèi)臟及軀干部皮膚，僅保留軀干部皮下組織放入干凈培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS 清洗幾遍，直至漂液洗清亮透明為止，移至5mL離心管中，用眼科剪將其剪成0.5~1.0mm3大 小的組織塊加入37.0°C預熱的0.25%胰蛋白酶混勻后放入新的培養(yǎng)皿中并于⑶ 2培養(yǎng)箱 (37 · 5Γ，5 · 0 % C〇2)培養(yǎng)8min，加入3~5mL的工作液(DMEM/HIGH GLUC0SE80 % +20FBS+1 % 雙抗)終止消化，用10mL注射器吸、吹打，并平分到2個100mm的培養(yǎng)皿中，加入10mL工作液 (DMEM/HIGH GLUC0SE80 % +20FBS+1 %雙抗)置于C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，第二天換液時先用 DPBS沖洗掉組織塊和死細胞，再加入新鮮的培養(yǎng)液(DMEM/HIGH GLUC0SE80%+20FBS+1%雙 抗)繼續(xù)培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，待細胞長滿皿底90%左右開 始傳代。
[0077]傳代培養(yǎng)觀察培養(yǎng)皿中細胞生長狀況，待細胞增殖至鋪滿瓶壁的80%~90%，吸 除瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液，用預熱的DPBS洗滌1~2次，再向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.1 %的胰蛋白酶1. OmL 左右，37.0°C消化4~5min后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，當胞質(zhì)回縮、細胞變圓、細胞間隙 增大后，加入3倍體積的DMEM終止消化，用吸管反復吹打瓶壁細胞，吹打過程要按順序進行， 細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。接種到1.5ml離心管中l(wèi)OOOr差速離心5分鐘，去上清加入新 培養(yǎng)基按1:3傳代至新的培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待細胞達90%匯合后， 按照上述傳代方法將F2代細胞接種到24孔板上培養(yǎng)24h。
[0078] 細胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察:每天用電子倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)的敖漢細毛羊羊胎兒成 纖維細胞的生長情況，并進行拍照，記錄細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的生長狀況及特點。組織 經(jīng)胰蛋白酶處理后24h可觀察到組織塊附近有梭形、不規(guī)則三棱形的成纖維細胞游離生長， 除此細胞外還有橢圓形或圓形的上皮樣細胞生長，沒有組織塊的區(qū)域細胞密度極低。培養(yǎng) 至第5d，培養(yǎng)皿皿底長滿細胞，即可進行傳代培養(yǎng)。如圖8所示，左為原代培養(yǎng)3d的細胞形 態(tài);右為原代培養(yǎng)5d后的細胞形態(tài)。
[0079] 細胞傳代培養(yǎng)形態(tài)觀察：當細胞密度達到90 %左右時進行傳代，采用胰酶消化法 和差速離心法可將成纖維細胞和上皮樣細胞及其他細胞分離開來，經(jīng)3~4代培養(yǎng)的細胞僅 剩成纖維細胞，經(jīng)傳代后細胞增殖加快，細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變化。如圖9所示，左為胰 酶消化后細胞形態(tài);右為傳代后3~5d細胞形態(tài)。轉(zhuǎn)染前細胞形態(tài)如圖10所示。
[0080] (7)轉(zhuǎn)染
[0081 ]將pX335-sgRNA-Fl載體和pX335-sgRNA-R2載體各取0· 25ug，SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體取0.5ug，三種質(zhì)粒共計lug為實驗組2,加入到150ul基礎培養(yǎng)基(DMEM) 中進行稀釋，加入3ul脂質(zhì)體混合孵育15min后逐滴加入上述步驟(6)的已接種培養(yǎng)細胞的 24孔板，每孔加50ul，加三孔以作為平行實驗。同樣將pX335-sgRNA-F3載體、pX335-sgRNA-R2 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2 載體為實驗組 3;pX335-sgRNA-F4 載體、pX335-sgRNA-R5載體和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體為實驗組4;以pX335載體和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體組合作為陰性對照組1，各組同實驗組2處理方法相同，分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞。即獲得 敖漢細毛羊成纖維細胞DKK2基因敲除細胞株。
[0082] 實施例2.雙熒光素酶報告基因檢測DKK2基因敲除效率
[0083] (1)稀釋CellLysis Buffer(CLB):用無菌水將5*Cell Lysis Buffer進行5倍稀 釋，配制成1倍CLB使用。CLB-20 °C保存，使用前需新鮮配制。
[0084] (2)配制Luciferase Assay Reagent:將 Luciferase Dilution Buffer 和5〇* Lucifcrase Assay Reagent室溫融化，用Luciferase Dilution Buffer將50*Luciferase Assay Reagent進行50倍稀釋，稀釋好的Luciferase Assay Reagent分裝后_20°C保存，避 免反復凍融。測定前取出室溫融化使用。
[0085] (3)配制Stop Reagent:將Stop Buffer室溫融化后，按照每個樣品100ul體系，根 據(jù)樣品數(shù)量50倍稀釋Stop Reagent50*Atop Reagent需使用前新鮮配制，不可長期保存或 反復凍融。Stop Buffer融化后，會有白色沉淀出現(xiàn)，將其平衡至室溫后充分混勻，白色沉淀 會消失。
[0086] (4)細胞裂解：
[0087] ①細胞洗滌:吸除細胞培養(yǎng)基，用足量的PBS輕輕洗滌細胞兩次，盡量去除洗滌液。
[0088] ②加入配置好的細胞裂解液(CLB):按照如下用量加入CLB，用移液器輕輕吹打幾 次，促進細胞充分裂解，室溫放置5-10分鐘后檢測，如果直接將細胞培養(yǎng)板放置在振蕩器上 比較溫和的裂解，可適當延長裂解時間至20分鐘。
[0090]本實驗采用的是24孔板，因此加入裂解液的量為150ul每孔。
[0091] (5)螢火蟲熒光素酶活性測定：
[0092] 取100ul Luciferase Assay Reagent加入測定管底部，加入20ul待測樣品，輕輕 混勾后，放入一起進行檢測，也可以取50ul Luciferase Assay Reagent加入10ul待測樣品 進行檢測，但每個樣品的檢測體系需要一致，本項目里采用的是l〇〇ul的體系。
[0093] (6)海腎熒光素酶活性測定：
[0094] 取100ul稀釋好的Stop Reagent加入步驟5的測定管中，輕輕混勾后，放入一起進 行檢測，Stop Reagent能夠立即終止螢火蟲熒光素酶發(fā)光，并且同時啟動海腎熒光素酶發(fā) 光反應，加入體系同步驟(5)相同。
[0095] 試驗樣品為對照組1(ρχ335)、實驗組2(T1-T2)、實驗組3(T2-T3)、實驗組4(T4-Τ5)、每組三個重復最后求平均值做比較。
[0096]將轉(zhuǎn)染18-72小時的細胞通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行敲除基因效率 檢測，檢測結(jié)果如圖11和圖12所示。
[0097] 通過數(shù)據(jù)對比得到Τ1-Τ2和Τ2-Τ3的敲除效率比值為17.17751和17.5629差異不顯 著(Ρ>0.05)，相比較陰性對照組2.34654差異極顯著（Ρ〈0.01)，與Τ4-Τ5的值16.63465差異 顯著(Ρ〈0.05)。選取比值稍高于組1的組2用于后續(xù)基因敲除試驗（圖11)。
[0098] 本發(fā)明所用雙熒光素酶報告基因檢測是針對MSTN這一獨特的質(zhì)粒內(nèi)部含有一個 螢火蟲熒光素酶表達基因和一個被本發(fā)明的目的基因隔斷的不表達的海腎熒光素酶表達 基因，當對MSTN中目的基因進行有效的切割之后，海腎熒光素酶表達基因發(fā)生重組使得海 腎熒光素酶高效表達，從而通過表達量來鑒定敲除的效率，因此在雙熒光素酶報告基因檢 測結(jié)果中，螢火蟲熒光素酶在每個MSTN載體中都表達，當螢火蟲熒光素酶表達，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染細胞成功，并且在結(jié)果中螢火蟲熒光素酶表達量差異不顯著說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量相差不多， 如果海腎熒光素酶表達量越高，那么海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的比值就越高，證明 目的片段的敲除效率越高，此處優(yōu)點在于通過海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的比值來消 除轉(zhuǎn)染過程中轉(zhuǎn)染量多少的差異所帶來的誤差。通過數(shù)據(jù)對比得到T1-T2和T2-T3的敲除效 率比值為17.17751和17.5629差異不顯著，相比較陰性對照組2.34654差異極顯著，與T4-T5 的值16.63465差異顯著，實驗組2的敲除效率最高（圖11)。
[0099] 實施例3.綿羊DKK2基因敲除細胞株的篩選
[0100]選取第二組質(zhì)粒對（pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-R2 和 SSA-hRluc-psiCHECK- DKK2)轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細胞，使用96孔板篩選細胞單克隆。將獲得的成纖維細胞單克隆 擴大培養(yǎng)，提取基因組DNA，PCR，克隆測序。在靶基因特定區(qū)域發(fā)生序列突變的單克隆細胞 即可判斷為DKK2基因成功敲除的細胞。
[0101] 具體過程如下，
[0102] (1)使用Amaxa核轉(zhuǎn)儀及配套的核轉(zhuǎn)試劑盒進行轉(zhuǎn)染。首先使用0.05 %胰蛋白酶消 化貼壁細胞，用胎牛血清終止消化，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，添加轉(zhuǎn)染試劑，使用程序 T-016轉(zhuǎn)染細胞。
[0103] ⑵將步驟（1)得到的重組細胞32-33 °C培養(yǎng)48小時，然后收集細胞。具體步驟是： 首先使用〇. 05 %胰蛋白酶消化貼壁細胞，用胎牛血清終止消化，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩 次，對細胞進行計數(shù)，然后將細胞稀釋到10個/ml的濃度，在96孔板的每孔中添加100微升細 胞稀釋液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37°〇。10_14天之后，將96孔板中存在匯合細胞的 單克隆轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，然后使用0.05 %胰蛋白酶消化貼壁細胞，用胎牛血 清終止消化，取三分之一的細胞提取基因組DN，剩余三分之二的細胞凍存?zhèn)溆?。一共獲得單 克隆32個，分別命名為1至32號克隆。
[0104] (3)提取步驟(2)收集的細胞的基因組DNA并作為模板，用PCRF與PCRR組成的引物 對進行PCR擴增（SSAF1 :GGCGCGCCAGACTGAGTTCACACGGTGC(SEQ ID NO. 13) ；SSAR1: GTCGACCGGGTCCCTACCTCTTCTGG(SEQ ID NO. 14))，回收450bp左右的PCR擴增產(chǎn)物。
[0105] 所述提取步驟(2)收集細胞基因組DNA的具體步驟是:使用TIANGEN公司DNA提取試 劑盒提取DNA。將步驟(2)的細胞懸液中添加20微升蛋白酶K溶液，混勻。加入200微升緩沖液 GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入 200微升無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上述溶液加入 一個吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入500微升緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸 附柱CB3中加入700微升緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管 中。向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱CB3放回 收集管中，12000rpm離心2分鐘。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中 殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200微升洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0106] (4)將步驟(3)得到的PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，得到連接產(chǎn)物。具體的連 接步驟是:在微量離心管中配置下列DNA溶液:pMD18-T載體1微升，PCR產(chǎn)物4微升。加入5微 升 SolutionI。16°C 反應 30 分鐘。
[0107] (5)取5微升連接產(chǎn)物加入50微升DH5a感受態(tài)細胞中，冰上放置30分鐘。42°C加熱 90秒，再在冰上放置1分鐘。加入500微升S0C培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)60分鐘。涂布于氨芐青霉 素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，隨機挑取10個克隆并進行測序，計算突變的克隆 占總體克隆數(shù)的比例，從而判斷出各個克隆DKK2基因是否被敲除以及雙等位基因敲除的個 數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在32個單克隆細胞中有3個在預期切割位點附近出現(xiàn)突變，其中一個克?。?3 號克隆）為DKK2單等位基因敲除（如圖13)，另外兩個克?。?號克隆、17號克隆)為雙等位基 因敲除（圖14、圖15)。實驗結(jié)果表明，可以通過本發(fā)明方法可以快速獲得基因敲除細胞株。
【主權項】
1. 一種快速獲得基因敲除細胞株的方法，其特征是，首先根據(jù)敲除目標基因設計SgRNA 靶點，根據(jù)設計的靶序列合成多對單鏈寡核苷酸，每對分別兩兩退火獲得帶粘性末端的雙 鏈DNA片段，經(jīng)酶切，連入pX335載體中，分別獲得SgRNA表達質(zhì)粒載體;然后，將SgRNA表達質(zhì) 粒載體兩兩組合與敲除目標基因的SSA載體，共同轉(zhuǎn)染預先培養(yǎng)好的細胞，即可獲得基因敲 除細胞株。2. 如權利要求1所述的快速獲得基因敲除細胞株的方法，其特征是，所述敲除目標基因 的SSA載體構(gòu)建是，將目標片段與含有雙熒光素酶報告基因的SSA-載體骨架連接獲得SSA-目標基因載體。3. 如權利要求2所述的快速獲得基因敲除細胞株的方法，其特征是，獲得基因敲除細胞 株后，通過雙熒光素酶報告基因進行敲除效率檢測;選取敲除效率較高的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染細 胞，篩選細胞單克隆，測序，在靶基因特定區(qū)域發(fā)生序列突變的單克隆細胞即可判斷為基因 成功敲除的細胞。4. 用權利要求1-3任一所述方法獲得綿羊DKK2基因敲除細胞株的方法，其特征是，步驟 如下， (1) 根據(jù)綿羊DKK2基因的第一外顯子的編碼區(qū)設計SgRNA靶點，正向靶標Tl序列如SEQ ID No. 1所示，反向祀標T2序列如SEQ ID No.2所示； (2) 根據(jù)步驟（1)設計的靶序列合成單鏈寡核苷酸T1-F、T1-R、T2-F、T2-R、T3-F、T3-R、 T4-F、T4-R、T5-F、T5-R，序列分別如SEQIDNo·3-12所示；Tl-F與Tl-R，T2-F與T2-R，T3-F與 T3-RT4-F與T4-R，T5-F與T5-R分別兩兩退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)酶切，連入 PX335載體中，分別獲得pXSSS-sgRNA-FUpXSSS-sgRNA-I^hpXSSS-sgRNA-FSjXSSS-sgRNA-FtpXSSS-sgRNA-RS 載體； (3) SSA載體的構(gòu)建 ① 引物設計 根據(jù)綿羊DKK2基因組序列設計引物并在引物5'端分別添加 AscI和Sail酶切位點，獲得 兩對引物 SSAFl、SSARl、SSAF2、SSAR2序列分別如SEQIDNo.l3-16所示； ② PCR及TA克隆 提取綿羊基因組DNA，以此為模板用步驟①的兩對引物進行PCR擴增，分別獲得450bp、 530bp的片段，與T載體連接并測序，選取無突變的質(zhì)粒用于后續(xù)酶切試驗； ③ 用AscI和Sail酶切步驟②所得質(zhì)粒及序列如SEQ ID No. 19所示的SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN 質(zhì)粒，將回收的 450bp 或 530bp 的片段和 SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN 的載體骨 架連接，獲得SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體，序列如SEQIDNo.20所示； (4) 將上述獲得的 pX335-sgRNA-Fl 載體、pX335-sgRNA-R2 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2 載體，作為一個實驗組；將 pX335-sgRNA-F3 載體、pX335-sgRNA-R2 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2 載體為一個實驗組；pX335-sgRNA-F4 載體、pX335-sgRNA-R5 載體和 SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體為一個實驗組；以pX335載體和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2載體 組合作為陰性對照組，各組分別轉(zhuǎn)染預先培養(yǎng)好的細胞，即可獲得綿羊DKK2基因敲除細胞 株。
【文檔編號】C12N15/85GK105950656SQ201610374366
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】趙金山, 楊峰, 李和剛, 謝寶琦, 劉華偉, 李蘭蘭
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學