植物源高效轉錄激活功能域sac3及應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，提供一種植物源高效轉錄激活功能域SAC3及應用，其氨基酸序列為DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC。本發(fā)明從杉木的cDNA文庫中分離得到一段高效轉錄激活序列SAC3，CPRG結果顯示其轉錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4?UAS為基礎的雙熒光素酶系統(tǒng)結果顯示：在擬南芥中SAC3的轉錄激活活性為VP16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應用于植物的基因工程技術中，用以精確激活植物體內特定基因的表達，改善植物與該特定基因相關的重要性狀，大幅提高作物的經濟價值。
【專利說明】
植物源高效轉錄激活功能域SAC3及應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種植物源高效轉錄激活功能域SAC3及應用?！颈尘凹夹g】
[0002]全球人口的日益膨脹和生存環(huán)境的改變，給農作物的經營和發(fā)展提出了極大的挑戰(zhàn)。興起于上世紀80年代的基因工程技術，是大幅改善農作物的產量及提高其對環(huán)境改變的適應性的強有力手段?；蚣夹g在植物中有大規(guī)模的應用，常將外源基因直接隨機整合入目標植物基因組中，并以此改善植物一些重要性狀，如抗除草劑和抗蟲性。然而這種方法可能會產生一些副作用，而且無法達到精確控制特定基因表達的效果。
[0003]擬轉錄激活因子效應器，Transcript1n activator-like effectors (TALEs)， 是實現(xiàn)精確控制特定基因表達最有效和應用最廣泛的技術；以及近年來CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat - CRISPR-associated 9)系統(tǒng)的開發(fā)和應用，生物體的研究和改造帶來巨大潛力，這類人工合成的轉錄調節(jié)因子為精確控制植物內源基因的表達提供了可靠的工具。然而由于其轉錄激活活性的發(fā)揮完全取決于轉錄激活功能域。迄今為止應用在基因工程中的效果顯著的轉錄激活功能域基本來源于動物病毒(VP16)，在植物中缺乏完全匹配的工作環(huán)境，使其功能發(fā)揮受到限制。已知的植物中的轉錄激活因子主要是對環(huán)境因素響應的蛋白，其中H)LL motif為已報道的最強植物源轉錄激活因子，該功能域的發(fā)現(xiàn)和運用讓人們有理由相信植物中存在強大的轉錄激活功能域，但其轉錄激活功能與VP16相比依然很低，以酵母為篩選載體，本發(fā)明從杉木的cDNA 文庫中分離得到一段高效轉錄激活序列SAC3(Strong Activat1n domain from China fir-3)，CPRG結果顯示其轉錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4-UAS為基礎的雙熒光素酶(LUC和REN)系統(tǒng)結果顯示:在擬南芥中SAC3的轉錄激活活性為VP16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應用于植物的基因工程技術中，用以精確激活植物體內特定基因的表達，改善植物與該特定基因相關的重要性狀，大幅提高作物的經濟價值。
[0004]
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種植物源高效轉錄激活功能域SAC3及應用，可以應用于植物的基因工程技術中，用以精確激活植物體內特定基因的表達，改善植物與該特定基因相關的重要性狀，大幅提高作物的經濟價值。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:植物源高效轉錄激活功能域S A C 3，所述的S A C 3的氨基酸序列為 DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo
[0007]所述的植物源高效轉錄激活功能域SAC3在改善植物基因表達中的應用。[〇〇〇8]本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明從杉木的cDNA文庫中分離得到一段高效轉錄激活序列SAC3(Strong Activat1n domain from China fir-3)，CPRG結果顯不其轉錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4-UAS為基礎的雙熒光素酶(LUC和REN)系統(tǒng)結果顯示:在擬南芥中SAC3的轉錄激活活性為VP 16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應用于植物的基因工程技術中，用以精確激活植物體內特定基因的表達，改善植物與該特定基因相關的重要性狀，大幅提高作物的經濟價值?！靖綀D說明】
[0009]圖1 TUP1轉錄激活因子篩選系統(tǒng)簡圖。
[0010]圖2杉木文庫在酵母TUP1系統(tǒng)中篩選結果的自激活能力。
[0011]圖3 SAC3轉錄激活功能域的確定。
[0012]圖4植物中SAC3的轉錄激活能力?！揪唧w實施方式】 [〇〇13] 實施例11.杉木中轉錄激活因子的篩選 1.1載體的構建本系統(tǒng)篩選載體以pGBKT7(Clontech)為背景，首先將酵母轉錄抑制因子構建入PGBKT7 中GK)的C端，采用的構建方式為將線性化的pGBKT7(引物1:5 ’ -TATGGCCATGGAGGCCGAATTCC-3’；弓I物2:5’- TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3’)與TUP1 (弓| 物3: 5’-TCAGAGGAGGACCTGCATATG atgactgccagcgtttcgaatacgcag-3’ ； CTCCATGGCCATATG TGCCACGGAAACCTGGGGAGG-3’)通過In-fus1n融合成GBD-TUP1 〇
[0014]將杉木文庫通過In-fus1n插入到GBD-TUP1的BamHI位點(引物5:5’-TATGGCCATGGAGGCCGAAITCC-3 ’；引物6:5 ’ - TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3 ’)，文庫大小為 2X105〇
[0015]1.2酵母的轉化與篩選酵母的轉化參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual (PT4084-1)_092413, Clontech?宿主菌株為Gold,篩選文庫大小為2X106。
[0016]本研究采用的TUP1篩選系統(tǒng)能最大程度分離出轉錄激活活性極強的基因片段，通過在SD篩選培養(yǎng)基(SD/-His-Ade-Trp，3-AT，AbA，X-alpha-gal)上的顯色反應，鑒定出目的克隆，通過載體引物(T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3’； 3’BD: 5’-mTCGITTTAAAACCTAAGAGTC-3’)擴增出目的基因片段，并測序。
[0017]2.SAC3轉錄激活功能的鑒定SAC3的轉錄激活功能用CPRG方法鑒定，將目的片段克隆入pGBKT7中(BamHI位點)，并轉入酵母Y187中(方法參照1.1 )，用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，檢測并比較轉化菌株的員-galactosidase units (具體方法參照 Yeast Protocols handbook，PT3024_l， Clontech)〇[〇〇18] 3.SAC3轉錄激活功能域的確定轉錄激活因子SAC3的功能片段的鑒定同樣借助CPRG的方法。首先通過生物信息學手段，預測SAC3可能的功能域，而后分別克隆這些功能域到pGBKT7中(BamHI位點)，轉入酵母Y187中(方法參照1.1)，用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，檢測并比較轉化菌株的P-galactosidase units (具體方法參照 Yeast Protocols handbook，PT3024_l， Clontech)〇
[0019] 4.植物中SAC3的轉錄激活功能 4.1載體的構建本實驗采用GAL4-UAS系統(tǒng)，首先分別構建報告載體和效應載體。報告載體以 ?6^611110800為背景在1^(:基因序列的5’端插入1^5及迷你355啟動子序列(5’-CGGAGTACTGTCCTCCGCGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTT GGAGAGGACACGCTGGGATCC-3’)，構成UAS-mini35S:: LUC (以35S::REN為內參)；效應載體為 35S::GAL4 (DNA-BD) - AD，以pEarlyGatel04為背景，其中GAL4 (DNA-BD)為酵母GAL4的 DNA binding domain(l-147aa)，AD 分別為SAC3(DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQ FAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC) / EDLL(EVFEFEYLDDKVLEELLDSEERKR) / VP16 (413-490 aa)。所有質粒均由無內毒素質粒大提試劑盒制備(0MEGA，D6922-02)。
[0020]4.2瞬時表達擬南芥葉肉細胞原生質體的制備以及原生質體轉化參照T i w a r i等描述的方法 (PubMed ID: 16739582)，其中效應載體的使用量為10微克，報告載體的使用量為5微克，共轉入原生質體中。轉化后的原生質體在黑暗中培養(yǎng)12h后，用雙熒光報告系統(tǒng)檢測試劑盒 (Promega，E2920)檢測樣品中的LUC表達量，并以REN表達量為內參比較各樣品中LUC/REN 的值。每個樣品均作3個生物學重復，每個生物學重復作3個技術重復。[〇〇21]實驗結果:1.酵母中SAC3轉錄激活功能通過在酵母TUP1系統(tǒng)中對杉木的文庫進行篩選，得到4個自激活能力大于等于VP16的基因片段，分別命名為SAC1、SAC2、SAC3和SAC4。通過CPRG檢測發(fā)現(xiàn)，SAC3(179aa)在酵母中的自激活能力極顯著高于VP16(19倍以上)。[〇〇22] 2.SAC3的轉錄激活功能域通過序列分析，將3403的轉錄激活功能域假定為1-60&&、61-110&&、110-179&&和60-179aa，分別檢測這些功能域的轉錄激活功能發(fā)現(xiàn):SAC3的轉錄激活能力可由C端(110-179aa)完全替代，其氨基酸序列為，DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSA WDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo [〇〇23] 3.植物中SAC3的轉錄激活功能雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測結果顯示，SAC3在植物中有顯著較高的轉錄激活活性，大概是VP16的2倍和EDLL的8-10倍。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.植物源高效轉錄激活功能域S A C 3，其特征在于:所述的S A C 3的氨基酸序列為 DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo2.如權利要求1所述的植物源高效轉錄激活功能域SAC3在改善植物基因表達中的應用。
【文檔編號】C07K14/415GK105949293SQ201610484782
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】蘇軍, 岡義人, 楊兆河, 劉伯斌
【申請人】福建農林大學