一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列及克隆方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青蒿AabZIP6基因編碼序列的克隆及其應(yīng)用。具體包括基因AabZIP6的克隆、含有該基因的植物表達載體的構(gòu)建、該基因?qū)η噍锼厣锖铣赏緩教赜谢騿幼拥募せ钭饔谩Ｉ鲜銮噍顰abZIP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了AabZIP6基因具有能夠激活青蒿素生物合成途徑特異基因ADS和ALDH1表達的特性。本發(fā)明中AabZIP6基因可應(yīng)用于青蒿品質(zhì)改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。
【專利說明】
-種青富bZ IP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列及克隆方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種青葛bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列 AabZIP6及其克隆方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物中新陳代謝分為初生代謝和次生代謝，初生代謝產(chǎn)物（如糖類、脂類和核酸） 存在于所有的植物中，是植物維持細胞生命活動所必需的，而植物次生代謝產(chǎn)物是指植物 中一大類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其合成與分布具有種屬、組織器官 和生產(chǎn)發(fā)育特異性。例如，治療追疾的特效藥物成分青葛素只在植物青葛（Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并儲存。近年來，隨著對中草藥成分研究的逐步深 入，發(fā)現(xiàn)許多中草藥的有效成分均為植物次生代謝產(chǎn)物，例如丹參中的丹參酬，長春花中的 長春生物堿等。
[0003] 大部分植物次生代謝產(chǎn)物其在天然植物中的含量極低，而使用化學(xué)合成的方法， 工藝流程復(fù)雜、成本太高，并且還有許多植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑不清晰，無法實 現(xiàn)化學(xué)全合成。因此，研究人員開始探索其他的提高植物次生代謝產(chǎn)物含量的方法?？紤]到 植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑復(fù)雜，參與反應(yīng)的基因數(shù)量多，且受到發(fā)育，環(huán)境等多種因素的 影響，對途徑上單個基因進行修飾有時難W奏效。而轉(zhuǎn)錄因子通?？蒞調(diào)控某個植物次生 代謝產(chǎn)物生物合成途徑上的多個酶基因的表達，從而調(diào)控該次生代謝產(chǎn)物的生物合成量。
[0004] 目前，在青葛中已有報道發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子可W有效調(diào)控青葛素合成途徑特有基因 的表達，從而調(diào)控青葛素的生物合成，例如AaORAl轉(zhuǎn)錄因子，AabZIPl轉(zhuǎn)錄因子，AaMYC2轉(zhuǎn)錄 因子等等。因此，克隆能調(diào)控青葛素生物合成途徑特有基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，對于改良并提 高青葛中青葛素的含量具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種青葛AabZIP6基因及獲得其核巧酸序列的方法，還提 供了該基因的蛋白編碼序列，并且提供了該基因生物學(xué)功能快速確定的方法。該基因編碼 一個bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，對其部分生物學(xué)功能進行了確定。將含有目的AabZIP6基因的農(nóng)桿菌 和含有青葛素生物合成途徑特異基因啟動子的報告載體的農(nóng)桿菌，通過煙草注射侵染瞬時 表達的方法，經(jīng)雙巧光素報告分析發(fā)現(xiàn)，該基因能夠激活青葛素生物合成途徑特異基因啟 動子的表達，為青葛素代謝工程改良提供了有效的候選基因。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種青葛bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，該編碼序列記為AabZIP6， AabZIP6的核巧酸序列如沈Q ID N0.1所示。
[000引本發(fā)明還提供了一種青葛bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，AabZIP6編碼的氨基酸序列 如沈Q ID NO.2所示。
[0009]本發(fā)明還提供了一種多膚，該多膚的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，該重組表達載體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核巧酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。其構(gòu)建方法包括 W下步驟：
[OOW 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計擴增AabZIP6基因開放閱讀框序列，擴增引物如 下：
[0012] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[0013] 反向引物P4:5' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3' ；
[0014] 步驟2、將PCR擴增產(chǎn)物回收純化后連接祀NTR-T0P0載體；
[0015] 步驟3、將連接入AabZIP6基因的祀NTR-T0P0載體與祀earlygatel04植物表達載體 通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表達載體。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種重組表達轉(zhuǎn)化體，該重組表達轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1所 示的核巧酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017] 進一步地，上述重組表達轉(zhuǎn)化體的宿主菌株為農(nóng)桿菌。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述青葛bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP6在提高青葛素含量中 的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述青葛bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP6的克隆方法，該克隆 方法包括W下步驟：
[0020] 步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲 得青葛葉片總RNA;
[0021] 步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將青葛葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;
[0022] 步驟3、W上述cDNA為模板，通過設(shè)計基因特異引物，采用PCR的方法擴增，獲得PCR 產(chǎn)物，基因特異引物為：
[0023] 正向引物P1:5 ' -GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 '
[0024] 反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3 ' ；
[00巧]步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[00%]本發(fā)明還提供了一種快速檢測AabZIP6編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方法， 該方法包括W下步驟：
[0027] 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計擴增AabZIP6基因開放閱讀框序列，擴增引物如 下：
[0028] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[00巧]反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ；
[0030] 步驟2、將PCR擴增產(chǎn)物回收純化后連接祀NTR-T0P0載體；
[0031] 步驟3、將連接入AabZIP6基因的祀NTR-T0P0載體與祀earlygatel04植物表達載體 通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表達載體；
[0032] 步驟4、將青葛中青葛素合成途徑特有ADS基因的啟動子ProADS連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙巧光素檢測報告載體pGreenllOSOO-ProADS;
[0033 ]步驟5、將青葛中青葛素合成途徑特有CYP71 AVI基因的啟動子ProCYP? 1 AVI連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙巧光素檢測報告載體pGreenII0800-ProCYP71AVl;
[0034]步驟6、將青葛中青葛素合成途徑特有DBR2基因的啟動子ProDBR2連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙巧光素檢測報告載體pGreenII0800-ProDBR2;
[003引步驟7、將青葛中青葛素合成途徑特有ALDH1基因的啟動子ProALDHl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙巧光素檢測報告載體pGreenllOSOO-ProALDHl;
[0036] 步驟8、將祀earlygatel04-AabZIP6植物表達載體和植物雙巧光素檢測報告載體 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和 pGreenllOSOO-ProALD化分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的載體的農(nóng)桿菌工程菌株；
[0037] 步驟9、將包含pEearlygatel04-AabZIP6植物表達載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含 植物雙巧光素檢測報告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合后，通過注射侵染的方式注射到生長5 周的煙草葉片中；
[0038] 步驟10、取注射后培養(yǎng)2天的煙草葉片，用液氮速凍后研磨成粉末；
[0039] 步驟11、采用Promega-Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測巧光強度，確定AabZIPe 基因與青葛素合成途徑特有基因啟動子的激活作用。
[0040] 進一步地，上述步驟8中，宿主菌為農(nóng)桿菌GV3101菌株；上述步驟9中，包含 祀earlygatel04-AabZIP6植物表達載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含植物雙巧光素檢測報告 載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合比例為按3:1濃度混合。
[0041] 在本發(fā)明中，克隆AabZIP6基因可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包 括質(zhì)粒、粘粒等。在本發(fā)明中構(gòu)建AabZIP6植物表達載體，也可選用本領(lǐng)域已知的各種載體， 如市售的pCAMBIA系列載體;在本發(fā)明中構(gòu)建啟動子雙巧光素報告載體，也可選用本領(lǐng)域已 知的各種其他載體，如市售的Promega公司的載體;本發(fā)明中所設(shè)及的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，該菌株可W從市場上公開購買。
[0042] W下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，W充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和 技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0043] 通過閱讀參照W下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0044] 圖1示出了在一個較優(yōu)實施例中，煙草瞬時轉(zhuǎn)化AabZIP6基因顯著提高ADS和AL畑1 運2個基因啟動子的表達活性。
【具體實施方式】
[0045] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明：本實施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克 隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[OOW 實施例1、實施例1青葛AabZIP6基因的克隆
[0047] 1、青葛在人工氣候室培養(yǎng)，生長條件為光周期1她/化(光亮/黑暗），25°C;
[004引2、青葛葉片總RNA的提取。取100毫克左右幼嫩的青葛葉片組織材，置于液氮中充 分研磨至粉末狀，按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化，北京)說明書的方法，提取葉片總 RNA。將獲得的植物總RNA取化L進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的質(zhì)量，然后在化no化op (Thermo Fisher,美國）分光光度計上測定總RNA的濃度。
[0049] 3、基因的克隆。W提取的總RNA為模板（500ng)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(hKaRa，大連）說明書的方法，反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)第一鏈cDNA; 通過設(shè)計的特異引物，W cDNA為模板進行PCR擴增，特異引物序列如下：
[0050] 正向引物P1:5 ' -GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 '
[0化 1 ]反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3 '
[00對 PCR反應(yīng)總體積為50化，反應(yīng)體系為:5化10XK0D緩沖液，5化dNTPs，化L MgS04， 1化正向引物，1化反向引物，化L cDNA模板，化L K0D酶，d地20補齊至50化。
[0053] PCR 擴增條件，預(yù)變性 95°C3min，35 個循環(huán)：95°C，30sec;54°C，30sec;68°C， lOOsec，最后 68°C 延伸 5min。
[0054] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，連接平末端載體化B(天根生化有限公司產(chǎn)品）并測序， 獲得pLB-AabZIP6質(zhì)粒載體。
[0055] 通過上述步驟，獲得了青葛中AabZIP6基因的序列如SEQ ID N0.1所示，并推導(dǎo)出 其蛋白編碼序列如SEQ ID NO.2所示。
[0化引 實施例2、包含AabZIP6基因的植物表達載體的構(gòu)建 [0化7] 1、中間載體祀NTR-T0P0-AabZIP6的構(gòu)建。
[0化引根據(jù)SEQ ID N0.1序列信息設(shè)計擴增AabZIP6基因開放閱讀框序列，擴增引物如 下：
[0059] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[0060] 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 '
[0061 ] 祀NTR/D-T0P0載體購置于Invihogen公司，為該公司Gateway克隆技術(shù)的入口載 體，按照該產(chǎn)品說明書的要求，在正向引物ATG堿基前添加 CACC四個堿基。WpLB-AabZIP6質(zhì) 粒為模板，用平末端高保真酶K0D進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收純化后通過Gateway克隆技術(shù) 的方法連接到祀NTR-T0P0載體，具體方法按照Invi化ogen公司祀NTR/D-T0P0克隆試劑盒說 明書進行。
[0062] 2、包含目的基因的植物表達載體構(gòu)建。按照Invitrogen公司LR Clonase II 化巧me試劑盒將將中間載體祀NTR-T0P0-AabZIP6與祀earlygatel04植物表達載體進行LR 反應(yīng)，反應(yīng)體系按試劑盒說明書配制，放置于25°C金屬浴反應(yīng)3小時后轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a感 受態(tài)，進行陽性克隆PCR驗證，最終獲得包含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表 達載體。
[00創(chuàng)實施例3.青葛素合成途徑特異基因啟動子雙巧光素報告載體的構(gòu)建
[0064] 1、PCR擴增青葛素合成途徑特異基因的啟動子。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青葛ADS基因的 啟動子(GenBank: DQ448297.1)序列信息，設(shè)計ADS基因啟動子擴增特異引物，正反特異引物 分別含有Kpn I和Pst I酶切位點，引物序列如下：
[00化]ProADS F 5，-gg化ccACCGGGGACCTCTAGAGATC-3,，
[0066] ProADS R 5'-ctgcagGATTTTACAAACTTTGAA-3'。
[0067] 同樣的，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青葛CYP71AV1基因的啟動子(GenBank:FJ870128.1)序 列信息，設(shè)計分別含有Kpn I和Pst I酶切位點的CYP71AV1啟動子特異引物，引物序列如下：
[006引 ProCYP F 5'-ggtaccATGGGTCAATTTCGGGTTG-3'，
[0069] ProCYP R 日'-ctgcagTGCTTTTAGTATACTCTTC-3'；
[0070] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青葛DBR2基因的啟動子(GenBank:KC118524.1)序列信息，設(shè)計 分別含有Kpn I和Pst I酶切位點的DBR2啟動子特異引物，引物序列如下：
[0071] ProDBR2 F 5'-gg化ccAAGATGAGATAGGGAACTAAC-3'，
[0072] ProDBR2 R 5'-ctgcagTATTGAGTTTGATGTTGACC-3'；
[0073] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青葛ALDHl基因的啟動子(GenBank:KC118522.1)序列信息，設(shè) 計分別含有Kpn I和Pst I酶切位點的ALD化啟動子特異引物，引物序列如下：
[0074] ProALDHl F 5'-ggtaccATGAACCATTAGAAGGGAAGG-3'，
[0075] ProALDHl R 5'-ctgcagCTTTGTTTTTTATGAAA-3'；
[0076] W青葛基因組DM為模板，PCR擴增上述4個啟動子片段，回收純化。
[0077] 2.啟動子PCR產(chǎn)物連接入雙巧光素報告載體。將上述PCR產(chǎn)物用Kpn I和Pst I雙酶 切，回收酶切片段，將4個酶切回收后的片段連入用Kpn I和Pst I雙酶切后回收的 pGreenII0800-LUC載體片段，構(gòu)建植物雙巧光素檢測報告載體pGreenllOSOO-ProADS、 pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenllOSOO-ProALDHl。
[007引實施例4.煙草瞬時轉(zhuǎn)化檢測基因與啟動子激活作用
[OOW] 1、農(nóng)桿菌工程菌株的獲得，將祀6曰1'17旨曰16104空載體、966曰1'17旨曰16104-4曰621口6 表達載體和4個啟動子雙巧光檢測報告載體通過凍融法轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中， 獲得包含有空載體的農(nóng)桿菌工程菌株、包含有AabZIP6基因的農(nóng)桿菌工程菌株和4個包含有 啟動子的農(nóng)桿菌工程菌株。
[0080] 2、農(nóng)桿菌工程菌株的擴大培養(yǎng)與處理。將上述6個農(nóng)桿菌工程菌株在包含50mg/L 利福平+20mg/L慶大霉素巧Omg/L卡那霉素 S種抗生素的LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)(5mL)，28°C， 220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜。第二天測定菌液濃度，當農(nóng)桿菌菌液濃度達到0D600值在20D~ 2.50D左右后停止培養(yǎng)。離屯、，收集農(nóng)桿菌，然后用lOmM濃度MgCl2溶液重懸浮菌體，調(diào)整重 懸浮菌液0D值為0.6。向重懸浮菌液中添加乙酷下香酬，其濃度為200mM。將上述重懸浮農(nóng)桿 菌菌液靜置3小時。
[0081] 3、注射侵染法瞬時轉(zhuǎn)化煙草。將上述靜置處理后的包含有空載體的農(nóng)桿菌工程菌 株與4個包含有啟動子的農(nóng)桿菌工程菌株分別按3:1濃度比例混合，作為對照組;將包含有 目的基因 AabZIP6表達載體的農(nóng)桿菌工程菌株與4個包含有啟動子的農(nóng)桿菌工程菌株也分 別按3:1濃度比例混合，作為實驗組。通過1ml的注射器，將混合后的農(nóng)桿菌菌夜注射到生長 5周左右的煙草葉片中，黑暗培養(yǎng)1天然后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。
[0082] 4、Dual-Luciferase檢測。用直徑為1.0cm的圓形打孔器，取注射后培養(yǎng)2天的煙草 葉片，用液氮速凍后研磨成粉末；采用Promega Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測巧光強 度，按Promega公司說明書的方法操作。
[0083] 本發(fā)明中AabZIP6基因能夠顯著激活青葛素生物合成途徑中ADS和AUm運2個重 要的結(jié)構(gòu)基因啟動子的表達，與對照組相比，AabZIP6能顯著激活運ADS啟動子的表達能力， 提高其活性至對照組的3.4倍左右;對ALD化啟動子也有一定激活能力，提高至對照組的2.6 倍左右。而對CYP71AV1和DBR2的啟動子無顯著激活能力。通過本發(fā)明為進一步利用該基因 在青葛中過量表達進而提高青葛中青葛素的含量提供了有力的實驗證據(jù)。
[0084] W上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng) 造性勞動就可W根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可W得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述編碼序列記為AabZIP6,所述 AabZIP6的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述AabZIP6編碼的氨基酸序列如 SEQIDN0.2**。3. -種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。5. -種重組表達轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述重組表達轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP6在提高青蒿素含量 中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP6的克隆方法，其特征在 于，所述克隆方法包括以下步驟： 步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲得青 蒿葉片總RNA; 步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將所述青蒿葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA; 步驟3、以所述cDNA為模板，通過設(shè)計基因特異引物，采用PCR的方法擴增，獲得PCR產(chǎn) 物，所述基因特異引物為： 正向引物PI: 5 '-GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 ' 反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3; 步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以 下步驟： 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計擴增AabZIP6基因開放閱讀框序列，擴增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 ' 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ； 步驟2、將PCR擴增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體； 步驟3、將連接入AabZIP6基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達載體通過 LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP6植物表達載體。9. 一種快速檢測根據(jù)權(quán)利要求2所述的AabZIP6編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方 法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計擴增AabZIP6基因開放閱讀框序列，擴增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 ' 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ； 步驟2、將PCR擴增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體； 步驟3、將連接入AabZIP6基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達載體通過 LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP6植物表達載體； 步驟4、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ADS基因的啟動子ProADS連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報告載體pGreenII0800-ProADS; 步驟5、將青蒿中青蒿素合成途徑特有CYP71AV1基因的啟動子Pr〇CYP71AVl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報告載體pGreenII0800-ProCYP71AVl; 步驟6、將青蒿中青蒿素合成途徑特有DBR2基因的啟動子Pr〇DBR2連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報告載體pGreenII0800-ProDBR2; 步驟7、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ALDH1基因的啟動子ProALDHl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報告載體pGreenII0800-ProALDHl; 步驟8、將所述pEearlygate104-AabZIP6植物表達載體和所述植物雙熒光素檢測報告 載體 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2 和 pGreenII0800-Pr〇ALDHl分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的載體的農(nóng)桿菌工程菌株； 步驟9、將包含所述pEearlygatel04-AabZIP6植物表達載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含 所述植物雙熒光素檢測報告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合后，通過注射侵染的方式注射到生 長5周的煙草葉片中； 步驟10、取注射后培養(yǎng)2天的所述煙草葉片，用液氮速凍后研磨成粉末； 步驟11、采用Promega-Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測焚光強度，確定AabZIP6基因 與青蒿素合成途徑特有基因啟動子的激活作用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟8中，宿主菌為農(nóng)桿菌GV3101菌 株;所述步驟9中，包含所述pEearlygatel04_AabZIP6植物表達載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包 含所述植物雙熒光素檢測報告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合比例為按3:1濃度混合。
【文檔編號】C12Q1/66GK106047895SQ201610680529
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月17日
【發(fā)明人】唐克軒, 沈乾, 馬亞男, 呂宗友, 潘琪芳, 唐岳立
【申請人】上海交通大學(xué)