馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi?mcq1.2和Rpi?OM1.2及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及兩個新的馬鈴薯抗晚疫病基因Rpi?mcq1.2和Rpi?OM1.2，該發(fā)明先從馬鈴薯野生種質(zhì)Solanum mochicense克隆了Rpi?mcq1.2的全基因，然后從馬鈴薯野生種質(zhì)Solanum venturii中擴增到抗晚疫病基因Rpi?Vnt1.1啟動子片段，利用融合PCR技術(shù)將Rpi?Vnt1.1啟動子片段融合Rpi?mcq1.2基因的CC?NB?LRR區(qū)域，得到一個新的重組基因片段Rpi?OM1.2，經(jīng)試驗證實Rpi?mcq1.2對晚疫病具有部分抗性，具有延遲發(fā)病的作用，而改造的新基因Rpi?OM1.2具有高抗晚疫病的特點。因此，DNA重組改造的新基因Rpi?OM1.2基因能夠在馬鈴薯抗晚疫病中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】
馬鈴善抗晚疫病基因 Rpi-mcq1 .2和Rpi-0M1 .2及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及馬鈴馨晚疫病抗病基因 Rpi- mcql. 2，化i-OMl. 2及其在作物改良，提高對晚疫病抗性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病 毒、細菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結(jié)果：（1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁 殖，引起相關(guān)病癥；（2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資 源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護環(huán)境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過程。參與植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 類：（1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
[0004] 根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認識，運類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或 間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導路徑(Tang et al. ,1996 ;Baker et al., 1997;Jia et al.,2000;Dangl and Jones,2001 ;Nimchuk et al.,2001)。抗病基 因介導的抗病反應(yīng)強，是很好的基因資源。但由于抗病基因的資源有限，使利用抗病基因改 良植物抗性受到限制。因此，如果能夠在原有抗病基因的基礎(chǔ)上改良抗病基因，拓寬抗病譜 延長抗病基因使用年限，將大大降低抗病基因的利用限制。
[0005] 馬鈴馨在生產(chǎn)過程中常遭受許多病害的嚴重危害，由致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont. )de Bary)引起的晚疫病一直被認為是最具毀滅性的病害，它能導致馬鈴 馨的減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)，曾引起1848-1850年間愛爾蘭大饑荒(Goodwin et al.，1995)，引起了 整個歐洲社會的動蕩。晚疫病發(fā)病較輕時塊莖產(chǎn)量損失一般在20 %左右，發(fā)病嚴重時，產(chǎn)量 損失一般在60%-80%，發(fā)病十分嚴重時植株全部死亡，塊莖幾乎絕收。晚疫病造成的損失 嚴重。防治晚疫病已引起國際社會的普遍關(guān)注。馬鈴馨為同源四倍體作物(化= 4X = 48)，遺 傳分離復(fù)雜，后代篩選煩瑣，許多野生種與栽培種之間存在有性雜交不親和現(xiàn)象，且病毒易 通過無性繁殖逐代積累，品種退化嚴重。通過常規(guī)育種獲得新品種耗時耗力且跟不上市場 的發(fā)展步伐。在培育馬鈴馨品種的研究中，利用基因工程技術(shù)有較大的優(yōu)勢，因其可W通過 塊莖無性繁殖，將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后代而無需經(jīng)花培純化或多代選育。
[0006] 但轉(zhuǎn)基因又面臨著食品安全問題，主要是針對抗生素 W及除草劑等標記基因，因 此標記基因的去除已經(jīng)成為近年來轉(zhuǎn)基因研究的熱點。目前篩選標記的去除方法主要有轉(zhuǎn) 座子系統(tǒng)（Cotsaftis 0 et日1.，2002)、共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Sripriya R et日1.，2008)、同源重組 (Zubko E et al. ,2000)，W及位點特異性重組系統(tǒng)化operteldi L et al. ,2009)。位點特 異性重組系統(tǒng)因具有操作簡便，轉(zhuǎn)化周期短等特點，已逐漸成為篩選標記去除的首選工具。 其中Cre/lox系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛、研究最深入的位點特異性重組系統(tǒng)。此系統(tǒng)于1981年在P1 隧菌體中被發(fā)現(xiàn)(Speck N A et al. ,2009)，最早應(yīng)用于動物轉(zhuǎn)基因研究中。1990年，Dale 等首次將化e/lox系統(tǒng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草中，實現(xiàn)了分子內(nèi)特異性重組化ale E C et al.， 1990) dZuo等（2000)成功地開發(fā)了一個化學誘導型的化e/lox系統(tǒng)，此系統(tǒng)中，編碼重組酶 的ere基因在雌二醇的誘導下表達，將2個loxp位點之間的區(qū)間包括篩選標記的部分成功剪 切掉，從而達到去除NPT II基因的目的。目前此系統(tǒng)已經(jīng)成功的應(yīng)用于煙草、擬南芥、番茄 等多種植物的無選擇標記品種培育中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了兩個新的馬鈴馨抗晚疫病基因 化i-mcql. 2和化i-〇Ml. 2，該發(fā)明先從馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum mochicense克隆了化i- mcql. 2的全基因，然后從馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum venturii中擴增到抗晚疫病基因化i- 化tl. 1啟動子片段，利用融合PCR技術(shù)將化i-化tl. 1啟動子片段融合化i-mcql .2基因的CC- NB-LRR區(qū)域，得到一個新的重組基因片段化i-OMl.2,經(jīng)試驗證實化i-mcql.2對晚疫病具有 部分抗性，具有延遲發(fā)病的作用，而改造的新基因化i -0M1.2具有高抗晚疫病的特點。因此， DNA重組改造的新基因化i-OMl.2基因能夠在馬鈴馨抗晚疫病中發(fā)揮重要作用。
[000引發(fā)明人首先從馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum mochicense(CGN18263)(在W.D.Smi Ide, G.Brigneti,L.Jagger,S.Perkins,J.D.G.Jones,Solanum mochiquense chromosome IX carries a novel late bl ight resistance gene Rpi-mocl,Theor Appl Genet(2005) 110:252-258記載)克隆了化i-mcql .2的全基因，然后從馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum ven化rii (CGN18108)(在Simon J.Foster,^Tae-Ho Park/lathieu Pel,^ianinna Brigneti , 1 JadwigaS'l iwka',3Luke Jagger, ^Edwin van der Vossen, 2 and Jonathan D. G. Jones^, Rpi-vntl.1,a Tm-22 Homolog from Solanum venturii,Confers Resistance to Potato 1曰16 811曲1，]\^]\0￥〇1.22，齡.5,2009，卵.589-600中記載）中擴增到抗晚疫病基因化1- 化tl. 1啟動子片段，利用融合PCR技術(shù)將化i-化tl. 1啟動子片段融合化i-mcql .2基因的CC- NB-LRR區(qū)域，得到一個新的重組基因片段化i-OMl.2。然后構(gòu)建化i-mcql.2和化i-OMl.2含 有&e/lox位點特異性重組系統(tǒng)的無選擇標記載體，利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法將化i- mcql .2和化i-OMl .2基因的無選擇標記表達載體轉(zhuǎn)入馬鈴馨Desiree品種中，獲得轉(zhuǎn)基因植 株。
[0009] 抗病性檢測顯示晚疫病菌化J菌株在接種48小時后就能夠成功在Desiree上定植 擴展;化i-mcql. 2的轉(zhuǎn)基因植株對化J菌株具有部分抗性，較野生型晚發(fā)病24小時，在接種 7化后才定植擴展;而DNA重組的新基因化i-OMl. 2的轉(zhuǎn)基因植株對晚疫病菌化J菌株具有完 全抗性，病原菌完全不能在轉(zhuǎn)基因馬鈴馨上定植，菌絲沒有擴展。說明化i-OMl. 2的基因改 造能夠使其馬鈴馨對晚疫病菌的抗性顯著增強，使部分抗性增強為完全抗性。為檢測轉(zhuǎn)基 因植株的抗病譜，我們進行了 8個不同晚疫病菌株的接種實驗，Desiree對其中六個菌株均 表現(xiàn)出易感性;Rpi-mcq 1.2的轉(zhuǎn)基因植株只對其中五個表現(xiàn)為易感性，并能在接種過程中 清楚觀察到發(fā)病延遲的現(xiàn)象；而改造的新基因化i-OMl. 2對其中7個菌株均表現(xiàn)出高抗病 性，使菌絲不能擴展，對另外一個菌株表現(xiàn)出中抗。運些結(jié)果均說明化i-mcql. 2對晚疫病具 有部分抗性，具有延遲發(fā)病的作用，而改造的新基因化i-OMl. 2具有高抗晚疫病的特點。
[0010] 本發(fā)明所采用的化i-mcql.2是一個具有部分抗性的抗病基因，只對極少數(shù)馬鈴馨 晚疫病菌株具有部分抗性，而化i-化tl. 1是一個已克隆的馬鈴馨晚疫病抗病基因，但已被 部分晚疫病菌打敗。本發(fā)明的發(fā)明人首次將化i-化tl. 1啟動子片段融合化i-mcql. 2基因的 CC-NB-LRR區(qū)域，形成一個新的馬鈴馨晚疫病抗病基因化i-OMl. 2，并獲得了如上所述的有 益效果。
[0011] 其中，發(fā)明人提供的馬鈴馨晚疫病抗病基因化i-mcql.2,其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012] 在上述基礎(chǔ)上，發(fā)明人進一步提供了 一個利用融合PCR技術(shù)將高抗晚疫病基因 化i-化tl. 1啟動子融合到化i-mcql .2基因的CC-NB-LRR區(qū)域，得到改良抗病基因化i-OMl .2 的完整的DNA片段，利用其改良馬鈴馨抵御病害的能力，改造后獲得的馬鈴馨晚疫病抗病基 因化i-OMl.2,其基因序列如SEQ ID NO.3所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013] 獲得運兩個抗病基因片段之后，將其與載體連接，轉(zhuǎn)入馬鈴馨，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。 化i-mcql.2的遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴馨相較于野生型的馬鈴馨具有延遲發(fā)病的作用，而且抗病譜略 有拓寬。Rpi-OMl. 2基因表達的遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴馨相對于化i-mcql. 2的遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴馨和未 轉(zhuǎn)基因馬鈴馨對馬鈴馨晚疫病菌的抗性增強，抗病譜拓寬，對檢測的9個晚疫病菌株中的8 個均表現(xiàn)出高抗病性?？梢娀痠-mcql.2為一個弱的抗病基因，能夠顯著延遲晚疫病的發(fā)病， 使感病品系的抗病性提高;Rpi-OMl. 2基因穩(wěn)定表達之后可W提高植物對由馬鈴馨晚疫病 菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。證明化i-mcql.2、化i-OMl.2基因能夠在 馬鈴馨抗晚疫病中發(fā)揮重要作用。
[0014] 更進一步的，發(fā)明人利用0-雌二醇誘導p)(6載體中的Cre/lox位點特異性重組系統(tǒng) 將篩選標記NPTn基因去掉，形成無選擇標記的化i-OMl .2馬鈴馨，能夠讓轉(zhuǎn)基因食品更容 易讓公眾接受。其所設(shè)及的無選擇標記表達載體PX6-GFP，獲得的馬鈴馨重組表達載體為 pX6-mcql.2和PX6-0M1.2,其插入了如沈Q ID N0.1或3所示序列。
[0015] 具體實驗過程中所采用的引物如下：
[0016] Rpi-mcql .2的擴增所述引物1,5' -ATGCTCGAGGCCACATATCTGACTCCAAA-3'，序列如 序列表沈9 10^.5，^及引物2,5'-4164圳461'雌4〔446〇：4〔44414〔41'(：-3'，序列如序列表 沈Q ID NO.6;
[0017] 化i-OMl. 2基因片段利用融合PCR技術(shù)將高抗晚疫病基因化i-化tl.l啟動子融合 化i-mcql.2基因的CC-NB-LRR區(qū)域，其通過特殊設(shè)計的引物擴增馬鈴馨抗病基因化i- 化tl. 1的啟動子和化i-mcql .2基因的CC-NB-LRR區(qū)，其中所述的引物包括化i-vntl. 1啟動 子區(qū)引物3,5'-〔66441'^4口'46164刊46刊414〔4(：-3'其序列如序列表沈〇10顯.7所示，和 引物4，5' -CTGCTGTAAGAAGAATTTCAGCCATCTTTTGTTAGCTGGTATTTCG1-3'，其序列如序列表SEQ ID N0.8所示；Rpi-mcql.2的CC-NB-LRR區(qū)弓|物5，5'- 示，引物6，5' -CGGAATTCTCACAAGCCACAAATACATC-3'，其序列如序列表沈Q ID NO. 10;
[001引在利用In-化sion的方法構(gòu)建化i-OMl. 2基因的無選擇標記載體時，其中所述的引 物包括引物7,5' -TTATAGATCTTCGACGAATTCACTAGTGATTAGTTA-3'，其序列如序列表SEQ ID NO. 11。引物8，5' -GTGTGGGCAATGAAACCTACCTTTGCAACCAAACAA-3'，其序列如序列表SEQ ID NO. 12,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將兩個抗病基因的無選擇標記表達載體轉(zhuǎn)入馬鈴馨品種Desiree 中即可。
[0019] 除此之外，發(fā)明人還進一步要求保護馬鈴馨晚疫病抗病基因化i-mcql.2、Rpi- 0M1.2在作物改良提高對馬鈴馨晚疫病抗性中的應(yīng)用，所述的作物為茄科作物。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人，通過實現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)容，可W達到W下效果：
[0021] (1)獲得馬鈴馨晚疫病抗病基因化i-mcql.2,并且成功驗證了其功能
[0022] (2)獲得馬鈴馨晚疫病抗病基因化i-OMl. 2,并且成功驗證了其功能；
[0023] (3)利用基因功能研究，最終發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株可W賦予植物對由致病疫霉所引起 的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得抗病性提高、抗病譜拓寬的植株。
[0024] (4)利用0-雌二醇誘導的標記基因剔除的方法，獲得無選擇標記的抗病植株，可W 被更加廣泛的認同和接受。
【附圖說明】
[0025] 圖1.化i-OMl .2轉(zhuǎn)基因株系的抗病性檢測結(jié)果示意圖，
[0026] A:qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系化i-OMl.2的表達量，結(jié)果顯示化i-OMl.2的表達量較 化i-mcql. 2有微弱提高；其中Desiree為野生型；
[0027] B:轉(zhuǎn)基因株系接種馬鈴馨晚疫病化J菌株，結(jié)果顯示相較于野生型和化i-mcql. 2 轉(zhuǎn)基因株系，HLJ菌株幾乎不能在化i-OMl.2轉(zhuǎn)基因馬鈴馨中定植擴展，說明化i-OMl.2能夠 提高植物抗病性，其中Desiree為非轉(zhuǎn)基因馬鈴馨感病品種，PX6-1.2為化i-mcql. 2轉(zhuǎn)基因 株系，Line4與Line85為化i-OMl. 2的轉(zhuǎn)基因株系；
[0028] C:各馬鈴馨株系接種化J菌株后各時間點的菌絲生長量變化，結(jié)果顯示化i- mcql. 2的轉(zhuǎn)化株系對化J感病菌絲生長量在4她后急劇增加，但比野生型增加慢，化i-OMl. 2 的轉(zhuǎn)化株系菌絲不生長；
[0029] 圖2為轉(zhuǎn)基因植株的抗病性檢測結(jié)果示意圖，
[0030] A:Rpi-mcql.2和化i-0M1.2表達的植株接種馬鈴馨晚疫病菌5天后的病情指數(shù)統(tǒng) 計，共進行S次生物重復(fù)，每次分別進行S組實驗重復(fù)，結(jié)果顯化i-OMl. 2基因?qū)臃N的八 個菌株中的屯個具有很高的抗性，其中Desiree為野生型；
[0031] B:化i-OMl.2表達的植株接種馬鈴馨晚疫病5天后的發(fā)病情況，說明化i-OMl.2的 確提高了馬鈴馨對晚疫病的抗性，拓寬了抗病譜；
[0032] 圖3.無選擇標記植株的獲得與檢測檢測結(jié)果示意圖，
[0033] A:標記基因的PCR檢測，說明無選擇標記的化i-OMl.2馬鈴馨成功獲得。其中NPTE 為標記基因，Line4與Line85為化i-OMl. 2的轉(zhuǎn)基因株系；
[0034] B:無選擇標記植株生長參數(shù)的檢測，測量其莖粗，株高，開花率均顯示與野生型無 明顯差異，說明化i-OMl.2基因不影響馬鈴馨的正常生長；
[0035] 圖4為圖1的彩色示意圖；
[0036] 圖5為圖2的彩色示意圖.
【具體實施方式】
[0037] W下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)W上的描述和運些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可W對本發(fā)明 作出各種改變和修改，W使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[003引實施例1:化i-mcql. 2基因的分離克隆和重組基因化i-OMl. 2的獲得
[0039]發(fā)明人為克隆抗晚疫病基因 R P i - m C q 1 . 2，設(shè)計擴增引物1，5 / - ATGCTCGAGGCCACATATCTGACTCCAAA-3'，序列如序列表SEQ ID N0.5，W及引物2,5'- ATGACTAGTTCACAAGCCACAAATACATC-3'，序列如序列表沈Q ID N0.6。
[0040] W馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum mochicense(CGN18263)DNA為模板進行PCR擴增。
[0041 ] 反應(yīng)程序如下:預(yù)變性94°C 53min，變性94°C30s，退火55°C 30s，延伸72°C 180s，反 應(yīng)35個循環(huán)，后延伸72°C7min。
[0042] PCR結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴增片段，然后將純化的DNA 片段連接至載體pUC-T(康為世紀），獲得TA克隆載體pUC-mcql. 2，轉(zhuǎn)化E. coli畑5a感受態(tài) 細胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序由華大基因完成，獲得長度為5449bp的化i-mcql.2片段， 具有序列表SEQ ID NO. 1的DNA序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0043] 發(fā)明人根據(jù)數(shù)據(jù)庫化i-vntl.l基因序列設(shè)計引物，W馬鈴馨野生種質(zhì)Solanum venturii(CGN18108)的全基因組為模版，擴增化i-Vntl.l的啟動子片段，所用引物包括引 物3，5' -CGGAATTCACTAGTGATTAGTTATACAC-3'其序列如序列表SEQ ID NO. 7所示，和引物4， 5' -CTGCTGTAAGAAGAATTTCAGCCATCTTTTGTTAGCTGGTATTTCG1-3'，其序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
[0044] 然后W構(gòu)建的化i-mcql.2的TA克隆載體pUC-mcql.2為模版，設(shè)計引物擴增化i- mcql . 2 的 CC-NB-LRR 區(qū)，包括引 物 5,5' - 示，引物6,5'-〔6644口'口'〔4〔446〇：4〔44414〔41'(：-3'，其序列如序列表沈0 10備.10。
[0045] 一次擴增分別得到存在重疊區(qū)域的化i-Vntl.l啟動子和化i-mcql.2基因的CC- NB-LRR區(qū)域，反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94°C53min，變性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C90s， 反應(yīng)35個循環(huán)，后延伸72 °C 7min;
[0046] 再利用引物1和引物4進行第二次擴增，反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94°C 53min，變性94 °C30s，退火55°C30s，延伸72°C180s，反應(yīng)12個循環(huán)，后延伸72°C7min;得到包含化i-化tl.l 啟動子和化i -mcq 1.2基因的CC-NB-LRR區(qū)域的改良基因化i -0M1.2。
[0047] PCR結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴增片段，然后將純化的DNA 片段連接至載體pUC-T(康為世紀），獲得PUC-0M1.2載體，轉(zhuǎn)化E. col i畑5a感受態(tài)細胞，挑 選陽性克隆提質(zhì)粒，測序由華大基因完成，獲得長度為4217bp的化i-OMl.2片段，具有序列 表SEQ ID NO.3的DNA序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[004引實施例2:化i-mcql .2和化i-OMl .2基因無選擇標記載體的構(gòu)建和功能驗證
[0049] 將pUC-mcql.2和PX6-GFP載體同時用肥B公司化〇1和Spel雙酶切進行線性化，反應(yīng) 體系如下：載體10uL，buf4加 L，Spel和趾〇1 luL，dd此0 33uL，37°C酶切5小時。將pX6載體 和化i-mcql.2片段(5449bp)用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴增片段，然后利用 化KaRa公司T4連接酶，進行連接，反應(yīng)體系如下：載體luL，buf4 luL，T4連接酶0.3uL，化i- mcql. 2片段7.7uL，16°C連接過夜。熱激轉(zhuǎn)化E. coli D冊a感受態(tài)細胞。將鑒定好的重組子擴 大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測序后與原序列比對，連入的片段為全長DNA并且沒有堿基突變和 缺失，證明化i-mcql .2無選擇標記的雙元表達載體pX6-mcql .2構(gòu)建成功。
[0050] 根據(jù)測序片段通過infus ion方法設(shè)計引物，其中所述的引物包括引物7,5/- 17八14641'(：7^64〔6441'1'〔4別46164刊46刊4-3'，其序列如序列表569 10^.11。引物8,5'- GTGTGGGCAATGAAACCTACCTTTGCAACCAAACAA-3'，其序列如序列表沈Q ID N0.12。
[0051 ]利用測序成功的TA克隆載體PUC-OMl. 2為模版，擴增帶有融合接頭的化i-OMl. 2基 因；反應(yīng)程序如下:預(yù)變性94°C53min，變性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C180s，反應(yīng)35個 循環(huán)，后延伸72°C7min;用康為公司的DNA回收試劑盒回收化i-OMl.2片段。
[0052] 將PX6-GFP載體用肥B公司Spel和趾〇1雙酶切進行線性化，反應(yīng)體系如下：載體 10uL，buf4 5uL，Spel和趾〇1 luL，dd此0 33uL，37°C酶切5小時。然后通過in化Sion酶將 化i-OMl. 2膠回收片段與線性化的pX6載體融合，得到無選擇標記的雙元表達載體，反應(yīng)體 系如下：膠回收片段4uL，線性化載體4uL，In-Fusionase化L，50°C重組15min，立即置于冰 上。熱激轉(zhuǎn)化E.coli D冊a感受態(tài)細胞。將鑒定好的重組子擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測序 后與原序列比對，連入的片段為全長cDNA并且沒有堿基突變和缺失，證明化i-OMl.2無選擇 標記的雙元表達載體PX6-0M1.2構(gòu)建成功。
[0053] 采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達載體導入馬鈴馨Desiree品種中。獲得的 遺傳轉(zhuǎn)化植株分別被命名為化i-mcql. 2和化i-OMl. 2，結(jié)果共獲得化i-mcql. 2轉(zhuǎn)基因植株 60株，其中陽性轉(zhuǎn)基因植株29株，轉(zhuǎn)化效率達到48%;獲得化i-OMl. 2轉(zhuǎn)基因植株51株，其中 陽性轉(zhuǎn)基因植株33株，轉(zhuǎn)化效率達到65%。利用葉片離體接種的方法，對轉(zhuǎn)基因株系接種馬 鈴馨晚疫病菌化J菌株，方法如下：馬鈴馨晚疫病菌在黑麥培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)14天，向培養(yǎng) 好的平板中加入10ML滅菌的dd此0,用涂布器輕輕刮取抱子囊，收集懸浮液至離屯、管中，放 入四度冰箱饑餓處理化;期間取長勢一致的馬鈴馨葉片，鋪在濕潤的濾紙上，葉背面向上； 將處理好的抱子懸浮液調(diào)節(jié)濃度至5*10~4個每毫升，每20化一滴，滴到鋪好的馬鈴馨葉片 上，每個葉片6滴。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型完全感病;化i-mcql.2轉(zhuǎn)基因株系具有部分抗性，但比野 生型晚發(fā)病一天，菌絲擴展較慢，最終發(fā)病后的菌絲生長量與野生型無顯著差異；而化i- 0M1.2的轉(zhuǎn)基因植株對化J菌株完全抗病，菌絲不擴展。說明化i-OMl. 2能夠顯著提高馬鈴馨 對晚疫病的抗性(如圖1所示）
[0054] 實施例3:轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測
[0055] 選擇葉齡一致的馬鈴馨株系進行抗病檢測，同樣采用葉片離體接種的方法，共接 種8個國內(nèi)爆發(fā)過的馬鈴馨晚疫病菌菌株，已野生型和化i-mcql. 2轉(zhuǎn)基因植株為對照，接種 五天后統(tǒng)計病情指數(shù)(如表1所示）。結(jié)果顯示化i-OMl.2的轉(zhuǎn)基因植株對其中7個菌株都表 現(xiàn)出高抗，對另外一個菌株表現(xiàn)出中抗;而野生型和化i-mcql. 2僅對其中3個表現(xiàn)出部分抗 性，其余均感病(如圖2所示）。說明化i-OMl. 2能夠顯著提高馬鈴馨對晚疫病的抗病性，拓寬 抗病譜。
[0056] 表1Ppi-OMl. 2表達植株接種馬鈴馨晚疫病5天后的病情指數(shù) [0化7]
[005引實施例4:無選擇標記轉(zhuǎn)基因再生植株的獲得
[0059]在PCR檢測陽性的line4和line85株系進行0-雌二醇誘導，每株系分化出苗后分別 用引物9,5'-別4164圳666〔4〔44〔464〔441'〇3'，其序列如沈0 10^:13所示和引物10,5'- GCGATAGAAGGCGATGCGCT-3^其序列如569 ID NO: 14所示。進行?0?檢測，檢測篩選標記(3'6基 因，在11株的二次分化植株中，未擴增出NPTE基因條帶。運表明經(jīng)(6-雌二醇誘導后，成功獲 得無選擇標記的化i-OMl.2轉(zhuǎn)基因植株(如圖3，A)。大田種植后，在生長期測量其生長參數(shù)， 莖粗，株高，開花率均顯示與野生型無明顯差異(如圖3，B)，說明化i-OMl.2基因不僅能夠提 高馬鈴馨對晚疫病的抗病性，還不影響其生長農(nóng)藝性狀。
【主權(quán)項】
1. 一種馬鈴薯晚疫病抗病基因 Rpi-rncql.2,其特征在于:其基因序列如SEQ ID N0.1所 不。2. -種馬鈴薯抗晚疫病基因 Rpi-OMl.2,其特征在于:其基因序列如SEQ ID NO.3所示。3. 馬鈴薯晚疫病抗病基因 Rpi-mcql. 2和Rpi-OMl. 2在抗晚疫病中的應(yīng)用。 4 ·馬鈴薯重組表達載體pX6_mcql · 2和ρΧ6-0Μ1 · 2，其特征在于：pX6_mcql · 2插入了如 SEQIDN0.1所示序列;pX6-0M1.2插入了如SEQIDN0.3所示序列。5.馬鈴薯重組表達載體pX6_mcql. 2和ρΧ6-0Μ1.2在抗晚疫病中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK106047888SQ201610355832
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】儲昭輝, 丁新華, 王嬌
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學