一種提高水稻耐鹽性的轉(zhuǎn)錄因子tfsalt1及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高水稻耐鹽性的轉(zhuǎn)錄因子TFSALT1及其應用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子TFSALT1來源于水稻。本發(fā)明還涉及該轉(zhuǎn)錄因子的編碼蛋白在培育耐鹽性水稻中的應用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子TFSALT1可用于提高水稻對鹽脅迫的抗性，培育高鹽抗性增強的水稻。水稻鹽脅迫相關基因TFSALT1的超量表達轉(zhuǎn)基因植株株系T2代在200mmol/L高鹽環(huán)境下的地上部分和地下部分長度均顯著高于對照，表明超量表達該基因的轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高水稻對高鹽環(huán)境的抗性。高鹽抗性水稻的栽培，對有效利用鹽堿土地、增加糧食產(chǎn)量等具有重要意義。該基因為培育高鹽抗性增強的水稻提供了一條重要途徑。
【專利說明】
-種提高水稻耐鹽性的轉(zhuǎn)錄因子TFSALT1及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及植物耐鹽相關基因，特別設及一個來源于水稻的與耐鹽性相關的轉(zhuǎn)錄 因子基因及其在培育耐鹽性植物中的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻(Oryza sativa L.)源于淡水沼澤植物，因此對鹽較為敏感。水稻作為中國第 一大糧食作物，水稻品質(zhì)的改良和產(chǎn)量的提高，一直是人們努力的目標。然而近年來，由于 化肥的大量施用W及不合理灌概等農(nóng)業(yè)措施，導致我國耕地的鹽潰化進一步加劇，鹽害已 成為影響我國水稻產(chǎn)量的主要限制因素之一。因此，研究、培育耐鹽水稻品種，提高水稻產(chǎn) 量已刻不容緩。
[0003] 研究表明，水稻耐鹽性是受多基因控制的復雜數(shù)量性狀。因此，明確水稻耐鹽的遺 傳機制，定位、克隆與利用水稻耐鹽相關基因，是提高水稻耐鹽性的關鍵。在鹽脅迫條件下， 鹽脅迫相關的轉(zhuǎn)錄因子可W調(diào)控一個或多個耐鹽基因的表達和信號的傳遞。增強一些關鍵 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)能力也許是提高植物耐鹽能力的一種重要途徑。目前，已有不少轉(zhuǎn)錄因子 應用到水稻耐鹽性提高的工程當中，如NAC、WRKY等。水稻的2個NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員 OsNACl和0SNAC2,是通過降低氣孔的開度來提高水稻的耐鹽性，利用OsNACl培育轉(zhuǎn)基因水 稻顯著提高了植株對高鹽的耐受能力化U H,Dai M,Yao J,et al.Overexpressing a NAM, ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103 (35): 12987-12992.)。過量表達0sbZIP23的轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐鹽性和抗旱性顯著提高， 同時對ΑΒΑ的敏感性增加 （Xiang Y,Tang N,Du H,et al.Characterization of 0sbZIP23曰s 曰 key pi曰yer of the b曰sic leucine zipper tr曰nscription f曰ctor family for conferring 曰bscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice.Plant Physiology,2008,148(4): 1938-1952.)。水稻OsGT 丫 亞家族 OsGT 丫 -1突變體植株的耐鹽性降低，而超表達OsGT 丫 -1能明顯提高水稻在鹽脅迫下的生長 能力，因此說明OsGT 丫-1是一個重要的鹽響應因子。（化ng Y，Xie K，Hou X，Hu H，Xiong L.Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a novel subfamily involved in stress responses.Molecular Genetics and Genomics ,2010,283:157- 169)。
[0004] 近年來在水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆和功能研究方面取得了很大進展，目前已克隆 的水稻耐鹽相關轉(zhuǎn)錄因子有30多個，它們在調(diào)節(jié)水稻不同生育時期的耐鹽性方面，發(fā)揮著 重要作用。但運些轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用機理大多不是很清楚，需要在今后研究中，充分利 用不斷發(fā)展和完善的分子生物學和基因工程技術，進一步了解它們在基因表達與調(diào)控中的 地位和作用，實現(xiàn)其在轉(zhuǎn)基因植物中高效穩(wěn)定表達，為利用轉(zhuǎn)錄因子進行植物抗逆基因工 程改良提供理論依據(jù)，最終實現(xiàn)其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于從水稻中分離一個包含該功能蛋白基因完整編碼區(qū)段的DNA序 列，利用運個基因提高水稻對高鹽脅迫的耐受能力，實現(xiàn)該基因在水稻耐鹽性遺傳改良中 的應用。經(jīng)系統(tǒng)進化分析表明，該基因?qū)儆谒綠T轉(zhuǎn)錄因子家族成員，本文將其命名為 TFSALT1基因。
[0006] 本發(fā)明分離和應用一種具有提高水稻耐鹽性功能的基因片段TFSALT1，該片段能 夠增強水稻在高鹽的逆境條件下的耐受能力。其中，所述TFSALT1基因是下列核巧酸序列之 -* .
[0007] 1)序列表沈Q ID N0.1所示的DNA序列;或
[0008] 2)編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的DNA序列;或
[0009] 3)1)和2)所包含的亞片段。
[0010] 本發(fā)明的第二目的在于提供水稻耐鹽脅迫相關基因 TFSALT1編碼的蛋白，其具有 如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明的第Ξ目的在于提供水稻耐鹽脅迫相關基因 TFSALT1在培育耐鹽抗性增強 的水稻中的應用。
[0012] 所述培育耐鹽抗性增強的水稻可采用如下方法：
[0013] 構(gòu)建水稻鹽脅迫相關基因 TFSALT1的超表達載體，并將其轉(zhuǎn)化到水稻，篩選得到耐 鹽抗性增強的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0014] 所述的超表達載體為Ti類質(zhì)粒載體，優(yōu)選為Superl300。
[0015] 所述轉(zhuǎn)化可采用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍介導轉(zhuǎn)化法，優(yōu)選農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化方 法。
[0016] 在鹽脅迫條件下，本發(fā)明中的水稻鹽脅迫相關基因 TFSLAT1的超量表達轉(zhuǎn)基因植 株株系的地上部分平均長度及地下部分平均長度顯著高于對照，表明該基因的超量表達能 夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對鹽脅迫的抗性。
[0017] 可使用包括本發(fā)明的基因的表達載體來轉(zhuǎn)化的宿主可W為包括水稻在內(nèi)的多種 植物，用于培養(yǎng)相應的耐鹽性植物品種。
[0018] 本發(fā)明基因是受逆境(尤其是高鹽環(huán)境)誘導表達的，因此，可將本發(fā)明的基因與 任何感興趣的逆境誘導啟動子結(jié)合后連入合適的表達載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件 下可誘導表達本發(fā)明的基因，提高植物對高鹽脅迫的抗性。
[0019] 本發(fā)明為培育耐鹽抗性增強的水稻提供了一條重要途徑。而生產(chǎn)上栽培耐鹽抗性 增強的水稻，對有效利用鹽堿±地、增加糧食產(chǎn)量等具有重要意義。
[0020] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明。
【附圖說明】
[0021] W下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0022] 圖1，對本發(fā)明已構(gòu)建好的TFSALT1過表達載體酶切驗證的結(jié)果示意圖。其中，對 TFSALT1過表達載體進行Xbal和Sail雙酶切，大片段表示的是線性化的Superl300載體，小 片段為TFSALT1基因片段。
[0023] 圖2，PCR檢測TFSALTl過表達的陽性植株。分別提取所獲得42株TFSALTl過表達植 株的DNA，用PCR法檢測轉(zhuǎn)基因植株中的潮霉素基因，約為827bp。圖2顯示了部分陽性植株的 檢測結(jié)果。
[0024] 圖3，RT-PCR檢測部分T2代TFSALTl過表達植株中的TFSALTl基因表達量。分別提取 部分陽性TFSALTl過表達植株的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNAdW野生型日本晴水稻中TFSALTl的表 達量為1，檢測TFSALTl過表達植株中TFSALTl的表達量。結(jié)果顯示在TFSALTl過表達植株中 的該基因表達量達到374~5413倍。
[0025] 圖4,水稻中超表達TFSALTl基因能提高植株耐鹽脅迫能力。A:轉(zhuǎn)基因株系和野生 型日本晴對照在不含或含有200mM化C1的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的表型觀察。B:轉(zhuǎn)基因 株系和野生型日本晴對照在不含或含有200mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天后地上和地 下部分長度的統(tǒng)計。結(jié)果說明，超表達TFSALTl基因后，能提高水稻耐鹽脅迫能力。
【具體實施方式】
[0026] W下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，運些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0028] 分離克隆TFSALTl基因
[0029] 本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一個受鹽誘導上調(diào)表達的基因 TFSALTl。提取鹽脅迫處理 的水稻日本晴總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBKht1:p: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)中 TFSLATl基因序列設計引物，并在引物兩端分別引入限制性內(nèi)切酶Xbal和Sail識別位點及 保護堿基。引物序列如下，其中TCTAGA堿基為限制性內(nèi)切酶Xbal的識別位點及保護堿基； GTCGAC堿基為限制性內(nèi)切酶Sal I的識別位點及保護堿基。
[0030] FP:5 '-TCTAGAATGTCTATCCTCCTTTGGCTAT-3'Xbal
[0031] RP:5 '-GTCGACTGGATGATTAGCATTGCCCTTT-3'Sail
[0032] W反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR反 應條件為:94°C 預變性 3111111，941：3〇36(3,581：3〇36(3,72°(：1111111，35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111。 將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌化1-blue，放在37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16- 1她，挑選菌落進行PCR并酶切驗證，挑選正確的克隆送北京六合華大基因科技股份有限公 司進行測序分析，獲得所需的基因全長cDNA。將該克隆命名為T-TFSALT1。
[0033] TFSALTl基因超表達載體構(gòu)建
[0034] 為了更好的分析TFSALTl的功能，
【申請人】使其在水稻中超表達，從轉(zhuǎn)基因植株的表 現(xiàn)研究該基因的功能。
[0035] 用限制性內(nèi)切酶Xbal和Sail對含T-TFSALT1質(zhì)粒和空載體Superl300質(zhì)粒進行雙 酶切，分別回收目的片段和Superl300質(zhì)粒的大片段進行連接。用Progema T4連接酶連接目 的片段和Superl300載體大片段（l〇XT41igase buffer lyl，T41igase化1，目的片段化 l，Superl300質(zhì)粒大片段化1)，4°C冰箱過夜連接16-1化，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過抗 性培養(yǎng)基篩選(構(gòu)建成功的載體只在Kana上生長，在Amp上不生長）、菌落PCR篩選重組子和 酶切驗證(結(jié)果如圖1所示)正確的，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序 驗證正確的克隆即為本發(fā)明所構(gòu)建的TFSLATl基因過表達載體，并提取其質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng) 桿菌EHA105。挑取陽性克隆用甘油保存在-80°C，并用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。
[0036] 農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
[0037] (1)愈傷的獲得:挑取選取不帶病斑、胚發(fā)育良好的日本晴水稻種子去穎殼，消毒 后的種子用無菌水在30°C黑暗條件下浸泡過夜，用解剖刀將胚剝下置于誘導培養(yǎng)基上。每 皿均勻放置12個胚，在30°C黑暗條件下放置2~3周誘導愈傷組織，至長出淡黃色顆粒狀愈 傷。
[0038] (2)轉(zhuǎn)基因植株的獲得:利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將TFSALT1超表達載體 轉(zhuǎn)化至水稻愈傷中，具體轉(zhuǎn)化過程參考了文獻Duan等人在"An Efficient and化gh- throughput Protocol for Agrobacterium-mediated Transformation based on Phosphomannose Isomerase Positive Selection in Japonica Rice(0ryza sativa L.).Plant Cel 1 R邱OTts(2012)"中公開的方法。其中，使用到的篩選劑為潮霉素，為過表 達載體中包含的潮霉素基因的編碼產(chǎn)物。共獲得TFSALT1過表達植株42株。
[0039] (3)W過表達植株的DNA為模板，用化usion高保真DNA聚合酶(肥B公司生產(chǎn)），PCR 擴增潮霉素基因，共檢測出潮霉素陽性植株35株，部分結(jié)果如圖2所示。其中PCR擴增所用的 引物為：
[0040] FP:5 '-CGCCGATGGTTTCTACCAA-3 '
[0041 ] RP:5 '-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3 '
[0042] TFSALT1過表達T2代苗期植株耐鹽性篩選
[0043] 為了驗證轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性是否增強及增強是否與轉(zhuǎn)入的TFSALT1基因有關， 本發(fā)明采用qRT-PCR對轉(zhuǎn)基因水稻植株中的TFSALT1基因表達量進行檢測。具體步驟為:T2 代TFSLATl過表達植株在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽并生長10天，W野生型日 本晴為對照。幼苗經(jīng)液氮速凍后存于-80°C超低溫冰箱用于提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA"qRT- PCR采用天根公司（北京）的S叩erReal巧光定量預混液試劑盒（TIANGEN，SYBR Green， FP205)dW水稻ACTIN基因作為內(nèi)參基因?qū)λ肦NA模板量進行定量。采用2-aagt(acT = CT 目標基因-CT內(nèi)參基因 ；Δ Δ CT= Δ CT處理后-Δ CT對照)對獲得的信號和數(shù)據(jù)進行處理。 每個基因做3次重復。本實驗中用到的基因的定量引物為：
[0044] Actin-FP，5 '-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3 '；
[0045] Actin-RP，5 '-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3 '
[0046] 用于ACTIN的擴增；
[0047] TFSLAT1-FP，5 '-TTGTCACCTCATGCTCGAATGA-3 '；
[004引 TFSLAT1-RP，5 ' -GGAAAGGGTTTGTTGATATCCAAC-3 ' 用于TFSLATl基因的擴增。
[0049] W野生型日本晴中TFSALT1的表達量為1(CK)，結(jié)果顯示，在TFSALT1過表達植株中 的該基因表達量達到374~5413倍(圖3)。
[0050] 對本發(fā)明T2代植株的部分家系進行了耐鹽性篩選。具體步驟為:Τ2代植株種子在 含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽2天，日本晴水稻1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽2天，挑選發(fā) 芽一致的轉(zhuǎn)基因幼苗和日本晴幼苗移栽在含有200mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上進行生長W在 不含化C1的培養(yǎng)基上生長同樣天數(shù)的水稻幼苗為對照。在生長10天后，我們分別測量了野 生型日本晴和轉(zhuǎn)基因植株的地上部分長度和地下部分長度。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株無論在 地上部分長度，還是地下部分長度，都明顯強于野生型對照（圖4中的A和B)。說明TFSALTl基 因的確與植株耐鹽性相關，其超表達后能明顯提高植株的耐鹽性。
[0051] W上對本發(fā)明【具體實施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可W根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求的范 圍。
【主權項】
1. 一種提高鹽脅迫耐受能力的水稻TFSALT1基因，其特征在于，所述TFSALT1基因提取 自水稻，所述TFSALT1基因用于提高水稻耐鹽性。2. 如權利要求1所述的水稻TFSALT1基因，其特征在于，其核苷酸序列為下述中的至少 一種： 1) 、序列表中SEQ ID N0.1所不序列； 2) 、編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的DNA序列;或 3) 、1)和2)中所包含的亞片段。3. 如權利要求1所述的TFSALT1基因，其特征在于，所述水稻TFSALT1基因的序列是序列 表中SEQ ID NO. 1所示序列的cDNA序列或基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上 同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。4. 一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的TFSALT1基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應用，利 用根據(jù)權利要求1所述的TFSLAT1基因編碼下述氨基酸序列（i)或（ii)所示的蛋白質(zhì)： (i) 序列表中的SEQ ID N0:2; (ii) 在（i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且所衍 生的蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物耐鹽性的功能。5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述應用包括:將所述水稻TFSALT1基因?qū)?水稻細胞、組織或器官，再將導入了所述水稻TFSALT1基因的水稻細胞、組織或器官培育成 植株，得到耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因水稻植株。6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，將所述水稻TFSALT1基因通過植物表達載體 導入植物細胞、組織或器官。7. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述植物表達載體是Super 1300。8. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述應用包括用所述水稻TFSALT1基因構(gòu)建 植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上一種組成型、組織特異型或誘導型啟動子。9. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述應用包括用所述水稻TFSALT1基因構(gòu)建 植物過表達載體時添加組成型啟動子。
【文檔編號】C12N15/29GK106011152SQ201610639546
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月5日
【發(fā)明人】李娟 , 楊劍波, 秦瑞英, 魏鵬程, 楊亞春, 李莉, 李 浩, 許蓉芳
【申請人】安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所