一種來源于菊芋的抗逆基因及其編碼蛋白與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于菊芋的抗逆基因LEA14及其制備方法和應(yīng)用。菊芋抗逆LEA14基因堿基序列如SEQ ID NO1；或，與SEQ ID NO：1所示堿基序列同源性在85％以上的基因。LEA14編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明利用聚合酶擴(kuò)增技術(shù)從菊芋塊莖中克隆抗逆基因LEA14的基因序列，所獲得的基因能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物對(duì)干旱、高鹽等多種非生物脅迫的抗性，在植物抗逆改良研究與應(yīng)用中具有極高的價(jià)值。
【專利說明】
-種來源于菊芋的抗逆基因及其編碼蛋白與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種來源于菊芋的抗逆基因 LEA14及其制備 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊芋俗稱洋姜或鬼子姜，是一種可在鹽堿地上種植的經(jīng)濟(jì)植物。與其它經(jīng)濟(jì)植物 相比，菊芋具有耐鹽堿、耐旱、耐寒W及抗病蟲害等抗逆特點(diǎn)。菊芋自身具有的多重抗逆性 狀使其在基因特異性方面的開發(fā)潛力非常大，對(duì)菊芋抗逆基因進(jìn)行研究，對(duì)于理解菊芋的 抗逆機(jī)制，W及進(jìn)一步進(jìn)行基因資源利用具有重要意義。
[0003] 胚胎晚期發(fā)生豐富蛋白（Xate embiyogenesis油undant protein,LEA)在減少環(huán) 境脅迫對(duì)植物傷害中起到重要的作用。在自然條件下LEA蛋白一般在種子發(fā)育晚期積累， 并能響應(yīng)干旱、寒冷、高鹽和ΑΒΑ等信號(hào)，對(duì)多種非生物脅迫具有很強(qiáng)的抵抗能力。LEA蛋 白通過保持細(xì)胞滲透壓、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、作為分子伴侶保護(hù)其它蛋白等方式維持植物正 常的代謝反應(yīng)?；贚EA蛋白的運(yùn)種特性，通過基因工程技術(shù)使植物過表達(dá)內(nèi)源或外源的 LEA蛋白，可W培育出抗旱、抗寒、耐鹽的作物品種，在植物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種來源于菊芋的抗逆基因及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 一種來源于菊芋的抗逆基因，菊芋抗逆LEA14基因堿基序列如SEQ ID NO 1 ;
[0006] 或，與SEQ ID NO :1所示堿基序列同源性在85% W上的基因。
[0007] 菊芋抗逆LEA14基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2。
[0008] 本發(fā)明LEA14基因由750個(gè)核巧酸組成。本發(fā)明LEA14基因編碼的蛋白質(zhì)為胚胎 晚期發(fā)生豐富蛋白，由153個(gè)氨基酸組成。
[0009] 一種權(quán)利要求1所述的抗逆基因的制備，包括如下步驟：
[0010] 選取菊芋塊莖提取總RNA，W總RNA為模板，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ;
[0011] 設(shè)計(jì)兩條引物，W上述cDNA為模板，結(jié)合5'建庫引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得菊芋抗 逆LEA14基因片段；
[0012] 上述擴(kuò)增片段回收后克隆入T載體，測序后獲得SEQ ID NO 1所示菊芋抗逆基因 LEA14。
[0013] 所述引物為：
[0014] 3，-LEAP-1:5,-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3，；
[0015] 3 ' -LEAP-2:5'-ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'。
[0016] 一種抗逆基因的應(yīng)用，所述抗逆基因在制備抗逆的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0017] 所述抗逆基因在制備抗鹽堿脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述抗逆基因在制備抗 旱的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果：
[0019] 本發(fā)明從菊芋中克隆獲得抗逆蛋白編碼基因 LEA14,屬于胚胎晚期發(fā)生豐富蛋白 基因，與木本棉LEA基因序列相似性最高，但其序列相似性僅為67%。所獲得的基因能用于 植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物對(duì)干旱、高鹽等多種非生物脅迫的抗性，在植物抗逆改良研究與應(yīng) 用中具有極高的價(jià)值。為了進(jìn)一步分析該基因在鹽、干旱逆境中的作用與功能，采用本發(fā)明 獲得基因可見，野生型擬南芥和本發(fā)明轉(zhuǎn)LEA14基因的擬南芥在抗逆性上有明顯的差異， 轉(zhuǎn)LEA14基因的擬南芥比野生型的植株有明顯的抗鹽、抗干旱能力，可見LEA14基因的轉(zhuǎn)入 提高了擬南芥植株的抗鹽抗旱能力。通過本發(fā)明菊芋LEA14基因的獲得，可W用于植物遺 傳轉(zhuǎn)化，提高植物對(duì)干旱、高鹽等多種非生物脅迫的抗性，在植物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià) 值。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的瓊脂糖電泳鑒定總RNA產(chǎn)物圖譜。
[002。 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的瓊脂糖電泳鑒定cDNA產(chǎn)物圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳述，W下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能W此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 本發(fā)明利用聚合酶擴(kuò)增技術(shù)從菊芋塊莖中克隆抗逆基因 LEA14的基因序列，所獲 得的基因能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物對(duì)干旱、高鹽等多種非生物脅迫的抗性，在植物抗 逆改良研究與應(yīng)用中具有極高的價(jià)值。
[0024] 所述抗逆LEA14基因，是通過W下方法獲得的：
[002引 1.菊芋cDNA文庫的構(gòu)建
[0026] 本發(fā)明取生長健壯的成熟期菊芋塊莖，用天根生化科技有限公司植物總RNA提取 試劑盒提取總RNA，W總RNA為模板，參照Clontech公司cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明，在反轉(zhuǎn) 錄酶和聚合酶的作用下合成cDNA雙鏈。
[0027] 2.引物的設(shè)計(jì)
[0028] 本發(fā)明設(shè)計(jì)兩條特異性引物 3' -LEAP-1:5' -CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3' ；3' -LEA P-2:5' -ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'，結(jié)合cDNA文庫構(gòu)建試劑盒提供的5'建庫引物擴(kuò)增 菊芋LEA14基因。
[0029] 3.利用PCR方法獲得LEA14基因片段
[0030] 本發(fā)明W合成的高質(zhì)量cDNA雙鏈為模板，利用正反向引物擴(kuò)增LEA14基因序列。 PCR 條件為：① 95°C，4min ;② 95°C，30s ;58°C，30s ;72°C，lmin ;30 個(gè)循環(huán)；③ 72°C，10min。
[0031] 4.克隆鑒定與序列測定
[003引擴(kuò)增片段采用北京百泰克公司DNA回收試劑盒回收純化后，克隆連接到PMD19-T 載體中，轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆鑒定和序列測定。
[003引 5.序列分析
[0034] 本發(fā)明通過核巧酸序列測定分析，最終獲得抗逆相關(guān)基因 LEA14,其核巧酸序列信 息如SEQ ID NO 1所示，進(jìn)而可得其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0035] 本發(fā)明所述的抗逆基因 LEA14能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，在提高抗逆性（抗鹽、抗干 旱）植物中的應(yīng)用。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 菊芋cDNA文庫構(gòu)建
[0038] 1. RNA 提取
[0039] 取50~lOOmg新鮮菊芋塊莖組織，加入液氮后迅速充分研磨，勻漿后移至1. 5血 EP管，選用天根公司RNA提取試劑盒，提取總RNA。
[0040] 用1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA，產(chǎn)物見圖1。圖中28S和18S rRNA兩條帶清 B析，比例約為2:1，表示提取到的總RNA未降解，質(zhì)量較高。
[0041] 2. cDNA文庫構(gòu)建
[0042] W總RNA為模板，參照Clontech公司cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明，在反轉(zhuǎn)錄酶和聚 合酶的作用下合成cDNA雙鏈。
[004引用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合成的cDNA，產(chǎn)物見圖2。圖中cDNA呈現(xiàn)出均勻分 布的彌散狀條帶，且片段大于l(K)bp，表明合成的cDNA質(zhì)量較高。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] PCR方法獲得LEA14基因片段
[0046] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中相近物種已有基因數(shù)據(jù)，運(yùn)用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì) 引物：3, -LEAP-l:5'-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3' ；
[0047] 3' -LEAP-2:5' -ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'，結(jié)合 cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒提供的 5'建庫引物，擴(kuò)增菊芋LEA14基因。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0048] 在滅菌的1. 5血EP管中依次混勻下列試劑：10 X PCR buffer 5. 0 μ L，dNTPs 4 μ L cDNA 模板 1 μ L (20ng)，引物 0. 5 μ L Taq 0. 5 μ L 加無菌水定容至 50 μ L。
[0049] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 4min，95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 Imin， 共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，在72°C延伸lOmin。
[0050] 實(shí)施例3
[0051] 克隆鑒定與序列測定
[005引 1. PCR產(chǎn)物純化與回收
[005引取上述實(shí)施例所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖120V電泳40min，邸染色后紫外線檢 測擴(kuò)增片段，在紫外儀下切取特異性條帶，用北京百泰克生物技術(shù)公司的DNA回收試劑盒 進(jìn)行基因片段回收。
[0054] 2.回收產(chǎn)物與PMD19-T載體的連接及轉(zhuǎn)化
[005引將回收到的目的片段連接到PMD19-T載體中，體系如下：Solution I 1 μ LT載體 5 μ L目的片段DNA 4 μ L 16°C過夜連接。
[0056] 將上述10 μ L連接產(chǎn)物加入D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻。
[0057] 冰浴30min，42°C水浴熱激90s，冰浴2min，加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基（37°C提前 溫?。靹?。
[0058] 37 °C 搖床（50巧m，15min ;100巧m，15min ;150巧m，15min)培養(yǎng)，5000巧m 離屯、 3min，棄去800 μ L上清，余200 μ L吸吹均勻，涂布于含有100 μ g/mL Amp的LB平板上，至 菌液完全吸收，37Γ倒置培養(yǎng)過夜。
[0059] 3.目的片段序列測定
[0060] 挑取單菌落于ImL含100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200;rpm振蕩培養(yǎng) 3-4h〇
[006。 化培養(yǎng)好的菌液為模板，M13-F和M13-R通用引物PCR檢測單菌落中是否插入目 的片段。引物序列為：M13-F:
[0062] 5, -GTAAAACGACGGCCAGTG-3, ；M13-R:
[0063] 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'。
[0064] 挑選含有目的片段的陽性克隆送到上海生工進(jìn)行測序。
[0065] 本發(fā)明通過核巧酸序列測定分析，最終獲得菊芋抗逆基因 LEA14,其堿基序列信息 如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0066] 沈Q ID NO 1
[0067]
[0068] 序列特征：
[0069] 長度：750個(gè)堿基
[0070] 類型：DNA
[0071] 鏈型：單鏈
[0072] 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線型
[0073] 來源：菊芋化elianthus 1:ube;rosus Linn)
[0074] SEQ ID NO 2
[00 巧]
[0076] 序列特征：
[0077] 長度：153個(gè)氨基酸
[0078] 類型：氨基酸
[0079] 鏈型：單鏈
[0080] 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線型
[0081] 來源：菊芋化elianthus 1:ube;rosus Linn)
[00的]實(shí)施例4
[0083] 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得及抗逆性分析
[0084] 1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[00財(cái) W限制性內(nèi)切酶XBa I和Sac I分別雙酶切LEA14基因的加酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物 和PCAMBIA2301載體，分別回收LEA14片段和PCAMBIA2301載體，W 5 :1的比例連接，通過 PCR和酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
[008引 1)酶切體系為：
[0087]
[008引 37。過夜。
[0089] 2)按實(shí)施例3的方法膠回收LEA14基因片段和PCAMBIA2301載體。
[0090] 3)將回收的LEA14片段與PCAMBIA2301表達(dá)載體在16°C下連接過夜，連接體系 為：
[0091]
[0092]
[009引 4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue，挑取單菌落，接種于20血LB+Km的Ξ角瓶 中，37Γ恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，W菌液為模板做PCR檢測。將陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并 純化，用XBa I和Sac I做雙酶切，檢測克隆是否正確。
[0094] 5)將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,獲得重組農(nóng)桿菌，并 經(jīng)PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子（含有SEQ ID NO 1所示的LEA14基因的轉(zhuǎn)化子），用于侵染擬 南芥植株。
[0095] 2. LEA14轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定
[0096] 將上述重組農(nóng)桿菌侵染待轉(zhuǎn)化的擬南芥植株花序，收取其種子。將收取的種子種 植在MS固體培養(yǎng)基的平板上（含Km 60 μ g/mL)篩選T。代陽性轉(zhuǎn)基因植株。將綠色幼苗移 入盆中生長，待τ。代的綠色幼苗長大，結(jié)芙收取種子進(jìn)行τ 1代陽性植株的篩選。將篩選得 到的Τι代陽性植株種植，收取不同Τ 1代陽性株系的種子。將收取的Τ 1代種子種植在含Km 60 μ g/血的MS固體培養(yǎng)基上，篩選T2代純合株系。采用CTAB法提取純合轉(zhuǎn)基因株系基因 組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體株系。
[0097] 3.含LEA14基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性鑒定
[009引將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交純合一代，選取3個(gè)純合轉(zhuǎn)化株系，收取種子。播種后，幼苗 生長7天，用對(duì)照組野生型擬南芥和了2代轉(zhuǎn)基因幼苗分別移置含有300mM化化和甘露醇 的MS固體培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)10-25天研究植株的生長情況。結(jié)果如表1所示，鹽脅迫 后70%左右非轉(zhuǎn)基因植株枯萎而死，轉(zhuǎn)基因植株死亡率僅為30%左右。在干旱脅迫下，非 轉(zhuǎn)基因植株生長比轉(zhuǎn)LEA14基因植株緩慢，T2代純合系轉(zhuǎn)基因植株的鮮重顯著高于野生型 植株，表明轉(zhuǎn)基因植株同野生型植株相比對(duì)干旱具有抗性。
[0099] 可見LEA基因在干旱和鹽脅迫下的抗逆境功能，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良作 物抗旱耐鹽的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
[0100] 表1轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的鹽、干旱處理后生長情況
[0101]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種來源于菊芋的抗逆基因，其特征在于：菊芋抗逆LEAH基因堿基序列如SEQ ID NO 1 ； 或，與SEQ ID NO :1所示堿基序列同源性在85%以上的基因。2. 按權(quán)利要求1所述的抗逆基因，其特征在于：菊芋抗逆LEA14基因編碼的氨基酸序 列如 SEQ ID NO 2。3. -種權(quán)利要求1所述的抗逆基因的制備，其特征在于：包括如下步驟： 菊芋cDNA文庫的構(gòu)建：選取菊芋塊莖提取總RNA，以總RNA為模板，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的 作用下合成cDNA ; 設(shè)計(jì)兩條引物，以上述cDNA為模板，結(jié)合5'建庫引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得菊芋抗逆 LEA14基因片段； 上述擴(kuò)增片段回收后克隆入T載體，測序后獲得SEQ ID NO 1所示菊芋抗逆基因 LEA14〇4. 按權(quán)利要求3所述的抗逆基因的制備，其特征在于：所述引物為： 3' -LEAP-l:5，-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3，； 3' -LEAP-2:5'-ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3' 。5. -種權(quán)利要求1所述的抗逆基因的應(yīng)用，其特征在于：所述抗逆基因在制備抗逆的 轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。6. 按權(quán)利要求5所述的抗逆基因的應(yīng)用，其特征在于：所述抗逆基因在制備抗鹽堿脅 迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。7. 按權(quán)利要求5所述的抗逆基因的應(yīng)用，其特征在于：所述抗逆基因在制備抗旱的轉(zhuǎn) 基因植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK106011145SQ201510581421
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年9月14日
【發(fā)明人】楊少麗, 秦松, 王義鵬, 蘇振, 李莉莉
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所