一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白、其特異性肽鏈、載體、菌株及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白(Spodoptera exigua Vitellogenein，SEVg)的DNA序列。本發(fā)明還公開了一種可利用Western?blot檢測(cè)AlVg蛋白表達(dá)量的特異性多肽序列，本發(fā)明還公開了一種SEVg多肽的多克隆抗體及其制備方法。利用此多肽特異性抗體分析SEVg在甜菜夜蛾體內(nèi)的組織分布及蛋白水平上的差異表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明，可以用于田間對(duì)于甜菜夜蛾種群動(dòng)態(tài)的測(cè)報(bào)工作，也可為該蛋白的快速檢測(cè)和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
【專利說明】
-種甜菜夜蛾卵黃原蛋白、其特異性化鏈、載體、菌株及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白、其特異性膚 鏈、載體、菌株及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜菜夜蛾Spodoptera exigua(冊(cè)bner)屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性分布的多 食性重要害蟲，可嚴(yán)重危害多種重要經(jīng)濟(jì)作物。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的甜菜夜蛾防控面臨嚴(yán)峻 挑戰(zhàn)，由于其繁殖能力強(qiáng)及較高的抗藥性，急待開拓減少化學(xué)農(nóng)藥使用的新型無公害防控 手段。田間種群預(yù)測(cè)測(cè)報(bào)是其防治的重要一環(huán)，直接關(guān)系到病蟲防治的效果，對(duì)保證農(nóng)業(yè)豐 收具有重大作用。卵黃原蛋白（Vg)是昆蟲體內(nèi)卵黃的主要成分，其含量高低直接影響雌成 蟲產(chǎn)卵潛力大小。通過檢測(cè)Vg含量開發(fā)害蟲種群測(cè)報(bào)工作是一種甜菜夜蛾種群測(cè)報(bào)的新興 方法。然而目前對(duì)于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白（Spodoptera exigua Vitellogenein，SEVg) 蛋白表達(dá)量的檢測(cè)方法相對(duì)匿乏。同時(shí)SEVg蛋白在昆蟲體內(nèi)是相對(duì)比較大的蛋白，很難全 長(zhǎng)表達(dá)，進(jìn)而合成特異性抗體較難。因此分離純化SEVg基因特異性膚鏈，制備其多克隆抗 體，一方面可W預(yù)測(cè)甜菜夜蛾產(chǎn)卵量及田間爆發(fā)潛力，可為甜菜夜蛾田間種群測(cè)報(bào)新技術(shù) 的研發(fā)提供基礎(chǔ)；另一方面可為掲示預(yù)測(cè)甜菜夜蛾的卵黃發(fā)生規(guī)律、卵黃蛋白的降解W及 激素調(diào)控機(jī)理等研究提供了良好的方法保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的:本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白（SEVg) 的DM序列。
[0004] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白。
[0005] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于編碼甜菜夜蛾SEVg特異性膚鏈的DNA序列。
[0006] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg特異性膚鏈。
[0007] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有所述的用于編碼甜菜夜蛾SEVg特異性膚鏈的DNA 序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。
[000引本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá) 載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選得到轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0009] 本發(fā)明的又一目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg特異性膚鏈的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的又一目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg多克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明的又一目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg多克隆抗體的制備方法。
[0012] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg多克隆抗體的化LSA檢測(cè)方法。
[0013] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種甜菜夜蛾SEVg多克隆抗體的Western blot檢測(cè) 方法。
[0014] 技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于編碼甜菜 夜蛾卵黃原蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所 /J、- ο
[0016] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈的DM序列， 其堿基序列如SEQ ID NO:3所示。
[0017] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括含有上述的用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈的DM 序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0019] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括將上述的DNA序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)甜 菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈的重組表達(dá)載體。
[0020] 其中，上述大腸桿菌表達(dá)載體為pCznl。
[0021] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo) 入大腸桿菌中，篩選得到轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0022] 本發(fā)明所述的大腸桿菌為化21 (DE3)。
[0023] 本發(fā)明所述的SEVg蛋白的特異性膚鏈DNA序列、所述的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在生產(chǎn)SEVg蛋白特異性膚鏈抗體中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種SEVg蛋白特異性膚鏈的制備方法，是培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)基因 重組菌得到的SEVg蛋白特異性膚鏈。
[0025] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種SEVg蛋白特異性膚鏈抗體的制備方法，是經(jīng)過抗原親和 純化法獲得針對(duì)SEVg蛋白特異性膚鏈多克隆抗體。
[0026] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種SEVg蛋白特異性膚鏈的制備方法，包括W下步驟：
[0027] 1)、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈cDNA片段的PCR擴(kuò)增，所述甜菜夜蛾卵黃原蛋 白特異性膚鏈cDNA序列如SEQIDN0:3所示；
[0028] 2)、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈cDNA片段的原核表達(dá)載體構(gòu)建；
[0029] 3)、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈的變性和復(fù)性；
[0030] 4)、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性膚鏈的純化即得。
[0031] 然后將上述得到的SEVg蛋白特異性膚鏈采用抗原親和純化法獲得針對(duì)SEVg蛋白 特異性膚鏈多克隆抗體;最后Western雜交驗(yàn)證SEVg蛋白特異性膚鏈抗體的效果。
[0032] 有益效果:本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0033] 本發(fā)明將原核表達(dá)純化的SEVg蛋白特異性膚鏈應(yīng)用于免疫家兔后制備了多克隆 抗體，在通過利用化ISA法確定了該多克隆抗體的效價(jià)后，發(fā)明人建立了一套高效、高靈敏 度和準(zhǔn)確的Western blot方法，可特異性地從甜菜夜蛾體內(nèi)檢測(cè)出Vg蛋白。本發(fā)明純化出 的SEVg蛋白特異性膚鏈抗體可用于甜菜夜蛾雌成蟲Vg含量的檢測(cè)，預(yù)測(cè)甜菜夜蛾田間爆發(fā) 潛力，對(duì)甜菜夜蛾田間種群測(cè)報(bào)新技術(shù)的研發(fā)著重要的實(shí)踐指導(dǎo)作用。同時(shí)應(yīng)用本發(fā)明，可 為卵黃發(fā)生規(guī)律及激素調(diào)控機(jī)理等研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0034] 圖1:沈Vg的結(jié)構(gòu)圖；
[0035] 圖2:SEVg蛋白特異性膚鏈DNA序列的PCR擴(kuò)增電泳圖；泳道1 :SEVg蛋白特異性膚鏈 DM序列；泳道2:為2000bp的DM maker;
[0036] 圖3: SEVg特異性膚鏈cDNA序列連接pCznl表達(dá)載體后Ndel和Xbal雙酶切圖譜；泳 道1:為5000bp的DNA maker;泳道2 :pCznl載體片段及SEVg蛋白特異性膚鏈基因；
[0037] 圖4 pCzn 1 -SEVg特異性膚鏈基因序列利用誘導(dǎo)表達(dá)的經(jīng)12 % SDS-PAGE分析電泳 圖；泳道M:為蛋白maker;泳道1:未經(jīng)誘導(dǎo)菌株的總蛋白；泳道2:誘導(dǎo)菌株的總蛋白；泳道3: 經(jīng)0.5mM IPTG在37°C誘導(dǎo)祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白包涵體;泳道4:經(jīng)0.5mM IPTG在37°C誘導(dǎo) 祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白上清液；
[003引圖5 SEVg特異性膚鏈誘導(dǎo)表達(dá)，純化后經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分析圖譜；泳道Μ:為 蛋白maker;泳道1:經(jīng)0.5mM IPTG在37°C誘導(dǎo)祀標(biāo)載體表達(dá)的總蛋白包涵體;泳道2:純化后 的祀標(biāo)蛋白；
[0039] 圖6利用特異性膚鏈抗體Western雜交SEVg蛋白圖譜；泳道M:為250kd蛋白maker; 泳道l-3:80yg、4化g和20yg甜菜夜蛾總蛋白（加1抗和2抗），泳道4為水(加1抗和2抗）；泳道5 為80yg甜菜夜蛾總蛋白（不加1抗和2抗）。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0041 ]實(shí)施例1: SEVg全長(zhǎng)基因的獲得
[0042] 采用TRIzol法提取甜菜夜蛾總RNA，選擇電泳圖譜良好并且0D260/0D280值在1.8 ~2.0之間的總RNA樣品合并進(jìn)行mRNA的純化，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，PCR反應(yīng)體系為:0.5 yg總ΚΝΑ，2.5μ1 01ig〇-dT18,加1 MMlv Buffer,扣1 lOmM dNTP，40U RNasin，0.加1 MMlv 反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcrip1:ase)，加 dd出0至20μ1; PCR反應(yīng)參數(shù)為：42°C Ih，95°C lOmin。 根據(jù)已知昆蟲Vg基因的保守序列設(shè)計(jì)適用于PCR擴(kuò)增引物SEVg-lF(5 / - GCTGAATGGCGACGAGAGCT-3')及沈Vg-1R(5' -CTCATGGAAGCGATAATGCGGAC-3')，獲得沈Vg基因 保守序列，該保守序列參見序列表中的SEQ ID N0:11，PCR反應(yīng)體系為:5μ1 10X反應(yīng)緩沖 液，5μ1 25mM Mg2+，如1 lOmM (1ΝΤΡ，0.5μ1 Taq plus DNA聚合酶，1.5μ1 ΙΟμΜ上游引物 沈Vg-1-F，1.5yl ΙΟμΜ下游引物沈Vg-1-R，cDNA模板化1，加 d地20至50yl;PCR反應(yīng)參數(shù)為： 941：5111111;941：3〇3,551：3〇3,721：6〇3,40個(gè)循環(huán)；72°(：繼續(xù)延伸1〇111111;在根據(jù)獲得的沈￥邑 基因的保守序列設(shè)計(jì) RACE 引物56￥邑-抑。6-5'3(5'-64〔4〔66了66了66〔46了61'(：-3')，56￥邑- race-3' F(5' -GCTTTGTACATGAGTGTACAGTCA-3')，擴(kuò)增方法具體參見Clontech公司的cDNA末 端的快速擴(kuò)增(RACE)試劑盒的方法進(jìn)行，PCR反應(yīng)參數(shù)為:94 °C 30 s，70°C 180 s，5個(gè)循環(huán);94 1：3〇3,7〇1：3〇3,72°(：18〇3,5個(gè)循環(huán)；941：3〇3,681：3〇3,72°(：18〇3,72°(：繼續(xù)延伸1〇111111。通 過序列拼接，SEVg基因全長(zhǎng)5357bp，開放閱讀框(0RF)為5286bp，編碼1761氨基酸，包含Ξ個(gè) 結(jié)構(gòu)保守域:Vitellogenin_N，DUF1943，VWD(圖 1)。
[0043] 結(jié)論:SEVg基因0RF框包5286個(gè)堿基，編碼1761個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量200.48kDa。
[0044] 實(shí)施例2: SEVg蛋白特異性膚鏈cDNA克隆
[0045] 根據(jù)已測(cè)得的SEVg基因全長(zhǎng)序列用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)SEVg蛋白特異性膚鏈cDNA序 列，并設(shè)計(jì)？(^擴(kuò)增引物56￥邑-3。（5'-〔4了66〔444(：了66〔444(：1'門4-3')及56￥邑-31?(5'- TAATTCCACTCTTGATAGCAGAAC-3/ )，獲得沈Vg蛋白特異性膚鏈基因序列，PCR反應(yīng)體系為:5μ1 10Χ反應(yīng)緩沖液，5μ1 25mM Mg2%祉 1 lOmM (1ΝΤΡ，0.5μ1 Takala LA DNA聚合酶，1μ1 ΙΟμΜ 上游引物SEVg-3F，化1 ΙΟμΜ下游引物沈Vg-3R，cDNA模板化1，加 d地2〇至0μ1; PCR反應(yīng)參數(shù) 為:941：5111111;941：3〇3,551：3〇3,721：2111111，35個(gè)循環(huán)；72°(：繼續(xù)延伸1〇111111。電泳結(jié)果顯示 PCR擴(kuò)增拼接后，得到與預(yù)期大小209化P相符的條帶（圖2)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠 電泳分離和膠回收純化目的DNA，與pGEM-TEasy載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，挑選單 菌落培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的菌液及序列測(cè)定正確的進(jìn)行下一步表達(dá)載體構(gòu)建。
[0046] 結(jié)論:SEVg蛋白特異性膚鏈基因序列包含2091個(gè)堿基，編碼697個(gè)氨基酸。
[0047] 實(shí)施例3: SEVg蛋白特異性膚鏈DNA原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0048] 含有SEVg蛋白特異性膚鏈基因 T載體的原核表達(dá)載體構(gòu)建方法為:將上述測(cè)序正 確的PCR產(chǎn)物連入pGEM-TEasy的載體及pCznl均用限制性內(nèi)切酶Nde巧肋bal雙酶切，進(jìn)行連 接。酶切體系為:2種限制性內(nèi)切酶各1.化1，10 X Buff er緩沖液2.化1，帶有合適酶切位點(diǎn)的 基因片段ΙΟ.ΟμΙ，用dd此0補(bǔ)足至20μ1，37Γ水浴化。連接體系為:酶切回收后的載體5.化1， 基因片段10. 〇μ1，T4DNA連接酶1.0μ1，10 X Buffer緩沖液2.0μ1，用dd此0補(bǔ)足至20μ1，16°C 反應(yīng)12~16h，連接成功后的酶切圖譜見圖3。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21(DE3)后采用PCR 篩選陽性克隆。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCznl-SEVg轉(zhuǎn)化到10化1大腸桿菌化21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞后，置冰上20min，42°C熱激90s，迅速至冰中5min，加入600ul LB培養(yǎng)液振搖一 個(gè)小時(shí)，離屯、后涂布到含卡那霉素(50yg/mU的平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜;從轉(zhuǎn)化后培養(yǎng) 過夜的平板上挑單克隆到3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37Γ搖床中振蕩培養(yǎng)過夜;次日將菌液 按1 %的比例接種到LB液體培養(yǎng)基(含50yg/mL卡那霉素）中，37 °C搖床(200巧m)振搖至菌液 的0D600達(dá)到0.6-0.8之間（約化）。取出1ml培養(yǎng)物，lOOOOg室溫離屯、2min，棄上清，用10化1 1 X上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5mM，37°C22化pm 振搖12h，誘導(dǎo)祀標(biāo)載體融合蛋白表達(dá)；取出1ml培養(yǎng)物，12000g室溫離屯、2min，棄上清，用 100μΙ 1 X上樣緩沖液重懸菌體沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)（圖4)。
[0049] 結(jié)論:經(jīng)37°C，0.5mM IPTG誘導(dǎo)12h后沈Vg特異性膚鏈基因可在pCznl載體中進(jìn)行 高效表
[(K)加 ]達(dá)，主要W包涵體形式存在。
[0051 ]實(shí)施例4: SEVg蛋白特異性膚鏈變性和復(fù)性及蛋白的純化
[0052] 祀標(biāo)融合蛋白的提取及純化：將實(shí)施例3誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液低溫4°C離屯、 6000g，10min，菌體沉淀重懸與20ml裂解buffer(包含20mM Tris-肥l、lmM PMSF和細(xì)菌蛋白 酶抑制劑cocktail混合液，pH 8.0)，超聲破碎(功率400W，工作4s，間歇8s，共20min);將超 聲破碎的細(xì)胞裂解液4°ClOOOOg離屯、20min，收集沉淀;使用包涵體洗涂液(20mM化is，ImM EDTA，2M尿素，IM化Cl，1 %Triton X-100，p服.0)洗涂包涵體3次；用溶解緩沖液（20mM 化iS，5mM DTT，8M尿素抑8.0)，按一定比例溶解包涵體，4度放置過夜。室溫，15000巧m離屯、 15min，將包涵體溶解液滴加至lj(20mM Tris-肥L，5mM EDTA Buffer，PH7.8)緩沖液中逐步成 倍梯度稀釋，緩慢攬拌，將蛋白溶液裝入透析袋于PBS pH7.4溶液中透析過夜。利用低壓層 析系統(tǒng)，包涵體溶液W〇 . 5ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA- Sepharose 化-6B親和層析柱，用化-IDA Binding-Buffe;r、Ni-IDA Washing-Buffe;r、Ni- IDA Elution-Buffer洗脫目的蛋白，收集流出液。將蛋白溶液裝入透析袋于4°C在20mM PBS，pH 7.4中透析過夜，進(jìn)行12 % SDS-PAGE電泳檢ii (圖5)。
[0053] 結(jié)論:通過變復(fù)性的方式，重溶，純化獲得祀標(biāo)蛋白，電泳檢測(cè)為目的蛋白，并呈現(xiàn) 單一條帶。
[0054] 實(shí)施例5: SEVg蛋白特異性膚鏈抗體制作
[0055] 動(dòng)物免疫:將實(shí)施例4純化的祀標(biāo)蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定，免疫2只新西蘭白兔 (2-2.5KG)，皮下免疫40化g/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血檢測(cè)，通過間接化ISA方法確 定抗血清針對(duì)蛋白的效價(jià)，待效價(jià)大于1:50000進(jìn)行，最終采血制備抗血清，并準(zhǔn)備純化?？?體純化:將蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS等量混 合后緩慢上樣，待抗原抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，立即在 PBS中進(jìn)行4 °C透析過夜，隔日進(jìn)行純度，濃度和效價(jià)測(cè)定。
[0056] 結(jié)論:獲得高質(zhì)量的SEVg蛋白特異性膚鏈抗體，抗體的濃度0.5mg/ml，抗體純化后 純度在90 % W上。
[0057] 實(shí)施例6: SEVg蛋白特異性膚鏈多克隆抗體的化LSA檢測(cè)
[005引據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)好包被板，并在板條上做上標(biāo)記。用PBS包被液將SEVg蛋白稀釋成 需要的濃度，混勻后加入板條中，每孔1(Κ)μ1，4Γ冰箱過夜。包被抗原:SEVg蛋白；包被濃度： 5μg/ml，10化1/孔;包被緩沖液:憐酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4);包被好后，棄去包被液，洗板3 次，每孔加入20化1封閉液，37 °C恒溫箱比。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板1次。一抗反應(yīng):SEVg 蛋白純化抗體按1/500,2倍稀釋，每孔l(K)yl，37°C恒溫箱化。二抗反應(yīng):取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi) 液，洗板3次，向每孔中加入10化1稀釋好的酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗:羊抗兔-HRP(鐘鼎生物公 司），1/5000。37 °C恒溫箱1小時(shí)。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，洗板4次，每孔先加入10化1 TMB顯 色液，根據(jù)顏色的深淺決定顯色時(shí)間，一般37°C，15min。每孔加入10化1 1M Η化溶液，終止 反應(yīng)。即刻在酶標(biāo)儀上450nm讀數(shù)，將0D值大于設(shè)定的陰性對(duì)照0D值的2.1倍的孔對(duì)應(yīng)的稀 釋度，定為該樣品的效價(jià)。
[0化9] 表1抗體間接Elisa結(jié)果 [0060]
「00611
[0062] 起始稀釋度：1:500
[0063] 效價(jià)即樣品0D/空白0D〉= 2.1的最高稀釋度
[0064] 結(jié)論:甜菜夜蛾卵黃原蛋白多克隆抗體效價(jià)均大于1:512000。
[0(?日]實(shí)施例7 :Weste;rn雜交驗(yàn)證
[0066] 甜菜夜蛾飼養(yǎng):供試蟲源為室內(nèi)人工繼代飼養(yǎng)的甜菜夜蛾(江蘇鹽城大豐市大豐 港農(nóng)田）。人工飼料W玉米粉和麥胚粉為主要原料，輔W-些維生素和抗生素;飼養(yǎng)條件為 溫度(26±1)°C，相對(duì)濕度70%±5%，光周期1^:0=14:10。成蟲期補(bǔ)充10%蜂蜜水，用養(yǎng)蟲 籠室溫飼養(yǎng)。取甜菜夜蛾羽化2日齡成蟲，提取蛋白開展Wes tern雜交實(shí)驗(yàn)。
[0067] Western雜交樣品使用10頭雌成蟲所提取的蛋白樣品，總蛋白提取使用南京鐘鼎 生物技術(shù)有限公司的總蛋白提取試劑盒。取組織樣品通過RIPA裂解液提取蛋白，按梯度上 樣80yg，4化g，20yg等。上樣完畢后，聚丙締酷胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V 直到電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜，約為1.5小時(shí)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后， 取下膜后先用PBS洗涂4次，每次5分鐘。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37°C1小時(shí)。用 封閉液稀釋一抗(SEVg蛋白純化抗體），膜在一抗稀釋液中37°C反應(yīng)1小時(shí)。洗膜4次，每次5 分鐘；用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗(鐘鼎生物公司的羊抗兔-HRP)。膜在二抗中37°C反應(yīng) 1小時(shí)。洗膜E化顯影(參見圖6)。
[0068] 結(jié)論:SEVg蛋白特異性膚鏈抗體可W用于Western雜交分析SEVg蛋白的表達(dá)情況， 其雜交出的單一條帶在200-210kDa之間，與SEVg蛋白預(yù)測(cè)分子量一致。
[0069] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種甜菜夜蛾卵黃原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. -種用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO: 3所示。4. 一種甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所 不。5. 含有權(quán)利要求3所述的用于編碼甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的DNA序列的重組 表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，將權(quán)利要求3所述的DNA序列插入 到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的重組表達(dá)載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述大腸桿菌表達(dá)載體為pCznl。8. -種轉(zhuǎn)基因重組菌，其特征在于，所述重組菌是將權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載 體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選得到轉(zhuǎn)基因重組菌。9. 權(quán)利要求3所述的DNA序列、權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基 因重組菌在生產(chǎn)甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈抗體中的應(yīng)用。10. -種甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈cDNA片段的PCR擴(kuò)增，所述甜菜夜蛾卵黃原蛋白特 異性肽鏈cDNA序列如SEQIDN0 :3所示； 2) 、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈cDNA片段的原核表達(dá)載體構(gòu)建； 3 )、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的變性和復(fù)性； 4)、甜菜夜蛾卵黃原蛋白特異性肽鏈的純化即得。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK106011144SQ201610350116
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】趙靜, 孫洋, 肖留斌, 譚永安, 柏立新
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院