專利名稱：睪丸特異性蛋白50單克隆抗體、多克隆抗體的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是與乳腺癌等腫瘤密切相關(guān)的睪丸特異性蛋白50單克隆抗體及多克隆抗體制備方法，同時(shí)還提供了這些抗體或其衍生物在制備藥物和診斷試劑中的用途，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，從流行病學(xué)發(fā)展趨勢(shì)看，乳腺癌越來越集中在大城市，躍居女性惡性腫瘤的首位。目前對(duì)于乳腺癌的診斷手段依然是以影像學(xué)及組織病理學(xué)檢查為主，不僅費(fèi)用較高而且無法實(shí)現(xiàn)早期診斷。
近年來有關(guān)腫瘤遺傳學(xué)的研究提示，腫瘤的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化過程中常常伴有癌基因的活化和(或)抑癌基因的失活。睪丸特異性蛋白50(testes specificprotein 50，以下簡(jiǎn)稱TSP50)是最近新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)原癌基因，它編碼一個(gè)385個(gè)氨基酸的蛋白，且此蛋白與多種絲氨酸蛋白酶有相似的結(jié)構(gòu)，但其接觸反應(yīng)的殘基Ser被Thr所取代，因此它可能是一個(gè)特殊類型的蘇氨酸蛋白酶。在正常情況下其只表達(dá)在人的睪丸組織中，且只存在于精原細(xì)胞中，而不在精子中，提示其在精子產(chǎn)生的過程中具有重要的作用。而在睪丸以外的其他正常組織中，此基因不表達(dá)(Yuan，L.，Shan，J.，De Risi，D.，Broome，J.，Levecchio，J.，Gal，D.，Vinciguerra，V.，and Xu HP.Isolation of a novel gene，TSP50，by a hypomethylated DNA fragment in human breast cancer.Cancer Res.1999，59，3215-3221)。但最近的研究表明，在90％以上的乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)TSP50的異常高表達(dá)，而且此種表達(dá)局限在惡變的上皮細(xì)胞中(Shan，J.，Yuan，L，Xiao，Q.，Chiorazzi，N.，Budman，D.，Teichberg，S.，and Xu，HP，TSP50，A possible protease in human testis，is activated in breast cancerepithelial cells.Cancer Res.2002，62，290-294)。由此我們推測(cè)TSP50是一個(gè)新的腫瘤-睪丸抗原(cancer testes antigen，CTA)，作為蘇氨酸蛋白酶在乳腺癌發(fā)生和精子形成過程中起著重要的作用，它將是乳腺癌診斷和治療的重要靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種睪丸特異性蛋白50單克隆抗體及多克隆抗體制備方法，目的在于制備TSP50的單克隆及多克隆抗體，建立穩(wěn)定、敏感的ELISA雙抗體夾心系統(tǒng)，通過檢測(cè)TSP50的表達(dá)情況對(duì)乳腺癌等TSP50相關(guān)疾病進(jìn)行早期診斷，并為乳腺癌等疾病的治療及預(yù)后提供有力的理論依據(jù)。
本發(fā)明還提供了睪丸特異性蛋白50單克隆抗體及多克隆抗體在制備藥物和診斷試劑中的用途。
本發(fā)明的另一目的在于將該單克隆抗體和多克隆抗體標(biāo)記后用于腫瘤的定位及治療。
本發(fā)明還用此抗體檢測(cè)TSP50與其它分子的相互作用，從而研究TSP50的功能。
為達(dá)到本發(fā)明目的，本發(fā)明人依據(jù)人TSP50的氨基酸序列(詳見附圖1)及其與其它絲氨酸蛋白酶的同源性比較，選取TSP50接觸反應(yīng)功能區(qū)內(nèi)的氨基酸親水區(qū)第156-206氨基酸進(jìn)行合成，這50個(gè)氨基酸的小肽是TSP50特異肽，我們將其命名為pep-50。同時(shí)我們還根據(jù)人TSP50的cDNA序列，設(shè)計(jì)了TSP50特異性引物，通過RT-PCR方法，從人睪丸組織中釣取了TSP50cDNA片段，并連接入原核及真核表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)。用pep-50和原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)載體作為抗原分別免疫小鼠和家兔，制備抗體。
用上述抗原免疫動(dòng)物制備的抗體包括單克隆抗體及多克隆抗體。TSP50多克隆抗體的獲得是用pep-50和原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)載體為抗原，用真核載體作為抗原時(shí)，直接用含有TSP50基因的重組質(zhì)粒注射動(dòng)物股四頭肌，pep-50和原核表達(dá)蛋白作為抗原時(shí)加完全和不完全弗氏佐劑多次免疫動(dòng)物，包括家兔、小鼠、大鼠、羊等，獲得與天然TSP50有結(jié)合活性的血清。單克隆抗體的制備方法，是采用雜交瘤技術(shù)(Kohler G.and Milstein C.Nature 1975，256495)制備小鼠抗TSP50單抗，但不限于小鼠，也可用大鼠(Rat Hybridomas and RatMonoclonal Antibodies P75-115，265-270，Bazin H.CRC Press，Inc.Florida1990)。上述所得的多抗及單抗通過ELISA方法檢測(cè)其生物學(xué)活性。第一用合成小肽pep-50包板4μg/ml，第二用原核表達(dá)蛋白包板5μg/ml，再以常規(guī)的ELISA方法檢測(cè)自制的抗體與二者均有結(jié)合反應(yīng)。經(jīng)間接ELISA法測(cè)3株單抗的亞類分別為IgG1、IgM、IgG2b?？贵w的效價(jià)分別為1∶128000，1∶64000，1∶96000。結(jié)果見圖2。所得多抗的效價(jià)為1∶2000，結(jié)果見圖3。
本發(fā)明還包括從以上單克隆抗體衍生的抗體。在本發(fā)明中，所謂衍生抗體是指包含本發(fā)明單克隆抗體的獨(dú)特型的任何分子，特別是嵌合抗體、單鏈抗體(ScFv)和Fab片段。嵌合抗體可以按照Morrison等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，159870(1984)；Neberger等，自然(Nature)312604-608(1984)；Takeda等，自然，314452-454(1985)所述的技術(shù)獲得。含有本發(fā)明抗體抗體獨(dú)特性的Fab片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)產(chǎn)生。例如，這些片段包括但不限于F(ab’)2片段，可通過胃蛋白酶消化抗體而產(chǎn)生的片段；可通過還原F(ab)2片段的二硫鍵獲得的Fab片段，以及可通過木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體獲得的Fab片段。
本發(fā)明的目標(biāo)還在于從上述單克隆抗體衍生的ScFv。這種單鏈抗體可通過專利US4946778，US5132405和US5476786中所述技術(shù)獲得。
本發(fā)明還涉及含有上述單克隆抗體所衍生單鏈抗體的編碼基因的核酸序列。這種序列的制備方法和體內(nèi)表達(dá)抗體的應(yīng)用在專利申請(qǐng)WO94/29446中有述。
本發(fā)明還涉及編碼這些ScFv的核酸序列或含有它們的載體在制備治療或外科處理人或動(dòng)物體的藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及含有如上所定義的載體(特別是病毒載體)或核酸序列的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及如上所定義的抗體在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明更具體地涉及所述抗體在制備治療或預(yù)防過度增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗體可與各種毒素、同位素或藥物偶聯(lián)制成靶向藥物，通過抗體與TSP50的特異性結(jié)合而將抗體上所攜帶的藥物、毒素或同位素帶到TSP50異常表達(dá)的部位，如惡性增生部位，從而達(dá)到治療與TSP50異常表達(dá)相關(guān)的疾病。
本發(fā)明還涉及含有治療有效量的本發(fā)明抗體和任選與之混合的藥物可接受的載體的藥物組合物，所述量可中和TSP50活性。
本發(fā)明的抗體還可以作為診斷試劑用于鑒定或定量測(cè)定TSP50蛋白。實(shí)際上，已證明TSP50蛋白在腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)，并且該過量表達(dá)構(gòu)成細(xì)胞增殖現(xiàn)象中的標(biāo)志。因此這些抗體可特別用于診斷引起TSP50蛋白過度表達(dá)的過度增殖性疾病。
本發(fā)明因而還涉及如上所定義的抗體作為診斷試劑的應(yīng)用以及含有所述單克隆抗體及多克隆抗體的免疫診斷試劑盒。此試劑盒包括但不限于雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)試劑盒，可用于檢測(cè)但不限于組織勻漿液、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞外分泌液、血清等各種液體樣品中TSP50蛋白的量，以雙抗體夾心法為例其試劑盒包括(1)標(biāo)準(zhǔn)品乳腺癌標(biāo)志分子TSP50蛋白溶液400μl，其濃度為0.1mg/ml。
(2)單克隆抗體小鼠抗TSP50單克隆抗體50μl，抗體濃度為0.1mg/ml，應(yīng)用時(shí)可稀釋1000倍。
(3)多克隆抗體兔抗TSP50多克隆抗體50μl，抗體濃度為1mg/ml，應(yīng)用時(shí)可稀釋1000倍。
(4)酶標(biāo)抗體羊抗兔IgG抗體50μl(購(gòu)自promega公司)，應(yīng)用時(shí)可稀釋1000倍。
試劑盒至少包括上述試劑，同時(shí)為了方便，也可裝入酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、濃縮封閉液、顯色劑A、顯色劑B、終止液、半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等。
所述的濃縮洗滌液為磷酸緩沖液，封閉液為BSA-磷酸鹽緩沖液、顯色劑A為1％磷苯二胺(OPD)，顯色劑B為過氧化氫，終止液為2M硫酸。
上述乳腺癌相關(guān)蛋白TSP50可用于測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，可將此蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml，六個(gè)點(diǎn)作為曲線的橫坐標(biāo)，以O(shè)D492平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本試劑盒的使用方法如下用TSP50單克隆抗體0.1-5μg/ml包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，次日用1-5％的BSA進(jìn)行封閉，1-4小時(shí)后洗滌并加入不同濃度的TSP50蛋白，37-43℃作用0.5-4小時(shí)，然后加入兔抗TSP50多克隆抗體，37-43℃作用0.5-4小時(shí)，PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37-43℃作用0.5-4小時(shí)，PBST洗滌后加入顯色底物OPD，避光反應(yīng)5-10分鐘，用2MH2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD492值。
如上所述的單克隆抗體和多克隆抗體還可以與生色的、熒光的、生物素化的、放射性的或其他標(biāo)記偶聯(lián)。這些抗體可以用于免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)中的免疫標(biāo)記方法，用于放射免疫測(cè)定(RIA)或免疫酶測(cè)定(ELISA)，和任何類型的已知診斷試劑盒中，亦可用于定位或殺傷腫瘤。


圖1顯示了人TSP50的氨基酸序列，有下劃線部分為合成50肽部位圖2顯示了三株單克隆抗體的效價(jià)。A為1E9B11，B為3F7B11，C為2B11D9圖3顯示了兔抗人TSP50多克隆抗體效價(jià)圖4用ELISA方法檢測(cè)TSP50蛋白的表達(dá)。圖中所示為TSP50檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用無關(guān)蛋白GST作為陰性對(duì)照，證明此試劑盒的特異性，此試劑盒的敏感性可達(dá)10ng/ml。
具體實(shí)施例方式
除以上所述外，本發(fā)明還包括來自以下實(shí)施例的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，這些實(shí)施例應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的說明而不是對(duì)其范圍的限制。
實(shí)施例1TSP50單克隆抗體的制備1.取6-8周齡雌性的BALB/C小鼠6只，用抗原TSP50(50μg/只/次)，加佐劑(第一次用完全佐劑，以后用不完全福氏佐劑)腹腔注射，每間隔2-3周免疫一次，共免疫3-5次，最后一次免疫后5日取脾融合。
2.制備免疫小鼠脾細(xì)胞懸液。
3.取小鼠胸腺，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。
4.復(fù)蘇并培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞。
5.融合將骨髓瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞以1∶7的比例混合后，將1ml50％PEG逐滴加入混合細(xì)胞中，1分鐘內(nèi)加完，靜置1分鐘，然后加入無血清培養(yǎng)基5ml，5分鐘內(nèi)加完，另加25ml無血清培養(yǎng)液。800rpm，離心8分鐘，棄上清，加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液，混勻后加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，1周以后出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(cè)、篩選，挑取強(qiáng)陽性克隆進(jìn)行克隆化。
6.雜交瘤細(xì)胞的檢測(cè)及克隆化以TSP50蛋白包被酶標(biāo)板，濃度為5μg/ml，100μl/孔，4℃過夜；次日用1％BSA封板，37℃，1小時(shí)；棄去封閉液，加入雜交瘤待測(cè)上清，100μl/孔，37℃反應(yīng)2小時(shí)；用含0.1％Tween-20的PBS洗板3次；加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，100μl/孔，37℃，1小時(shí)；0.1％Tween-20的PBS洗板3次后加OPD顯色5分鐘，2M H2SO4終止反應(yīng)。選擇陽性細(xì)胞孔，取雜交瘤細(xì)胞，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化。之后再篩選、克隆化，至少連續(xù)克隆三次，取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。
7.制備腹水將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行凍存。同時(shí)取4～8周齡雌性BALB/C小鼠，于腹腔先注射液體石蠟0.5ml，3～14天后，接種雜交瘤細(xì)胞，每天觀察腹部大小分析腹水產(chǎn)生情況。將12號(hào)針頭插入產(chǎn)生腹水的小鼠左下腹部，用試管接取腹水，1500rpm/min離心5分鐘，吸取腹水凍存?zhèn)溆谩⒓?xì)胞沉淀中加入凍存液于液氮中凍存。
實(shí)施例2單克隆抗體的純化將含有單克隆抗體的腹水用50％硫酸銨沉淀一次，再用33％硫酸銨沉淀二次，然后透析除鹽，再用DEAE-纖維素層析法進(jìn)一步純化。
1)DEAE-纖維素活化取一定量的DEAE-纖維素加入50倍量的蒸餾水充分浸泡，室溫靜置30分鐘，輕輕將上1/3倒掉，浮于上清中的細(xì)小微粒隨之除去，加入20倍量的0.5N NaOH充分?jǐn)嚢?0分鐘，靜置于冰箱中浸泡1小時(shí)，棄上清液，用蒸餾水沖洗至中性，以0.5N HCl充分浸泡1小時(shí)，仍用蒸餾水洗至中性，用pH6.3、0.0175M的PB液在冰箱中充分平衡至少24小時(shí)以上。
2)裝柱一般用柱口徑為2cm，高50cm，將上述平衡好的纖維素用吸管一次加入柱內(nèi)，使柱內(nèi)上下均勻一致，打開下口調(diào)節(jié)流速以每分鐘20滴為宜。
3)上樣裝好柱后，以pH6.3、0.0175M的PB液充分沖洗，打開下口調(diào)好流速，當(dāng)柱面液體存留大約0.5cm高度時(shí)，關(guān)閉下口，將樣品用吸管沿柱壁周圍緩緩加入，加完后打開下口，樣品進(jìn)入柱內(nèi)后用pH6.3、0.0175M的PB液充分洗脫。
4)樣品收集樣品進(jìn)入柱內(nèi)開始洗脫并收集。收集時(shí)根據(jù)準(zhǔn)備若干試管，每管收集110滴。用20％磺基水楊酸檢查，凡含有蛋白的管，立即放入冰箱中，全部收集完后，蛋白部分放入透析袋濃縮。
實(shí)施例3免疫球蛋白的鑒定1.蛋白含量測(cè)定用紫外分光光度計(jì)測(cè)純化蛋白光密度值，計(jì)算蛋白含量。
2.免疫球蛋白亞類的測(cè)定將純化的抗體用pH7.4，0.01M的PBS稀釋至4μg/ml，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃過夜；次日棄去包被液，每孔加入200μl2％BSA-PBS，43℃封閉1小時(shí)；棄去封閉液，用洗滌液洗兩遍，加入各種兔抗鼠免疫球蛋白亞類的抗體，43℃孵育1小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗三遍，加入HRP-羊抗兔抗體，43℃孵育1小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗三遍，加入顯色液，室溫避光反應(yīng)10分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)OD492值。
3.效價(jià)測(cè)定將純化的免疫球蛋白進(jìn)行倍比稀釋，用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，方法同血清抗體效價(jià)測(cè)定。
實(shí)施例4TSP50多克隆抗體的制備1.免疫家兔1)制備油包水抗原乳劑5ml弗氏佐劑吸入到一支10ml注射器中，將等量抗原與卡介苗(終濃度為15～30mg/ml)放入到另一支10ml注射器中，兩個(gè)注射器用連通器進(jìn)行連接，抽吸混勻，直至混勻成乳白色，抽吸困難，滴入水面不散為止。
2)免疫動(dòng)物選用2～2.5kg的健康家兔，第一次用皮內(nèi)多點(diǎn)注射法，共注射抗原乳劑2ml(含抗原50mg/只)。三周后再次皮內(nèi)多點(diǎn)免疫，再隔兩周后于靜脈注射可溶性抗原100mg，此為強(qiáng)化免疫。
2.試血強(qiáng)化注射后7天耳靜脈取血，分離血清，用間接ELISA法測(cè)其效價(jià)，方法同小鼠血清抗體效價(jià)的測(cè)定。
3.采血選用一次全采血法，自頸動(dòng)脈無菌放血，分離血清，加入適量防腐劑，分裝小瓶，低溫冰箱保存。
4.IgG的提取用50％硫酸銨沉淀一次，33％硫酸銨沉淀兩次，然后用DEAE層析法把兔血清進(jìn)行純化。方法見抗體的純化。
5.效價(jià)的測(cè)定用間接ELISA法測(cè)定純化的IgG效價(jià)，方法與血清抗體效價(jià)的檢測(cè)相同。
實(shí)施例5用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體將辣根過氧化物酶8mg溶于1ml蒸餾水中，加入200μl，0.1M偏高碘酸鈉溶液，將混合液在室溫下靜置30分鐘。利用1mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)，使酶溶液在4℃下透析過夜。加入100μl，0.2M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)，以調(diào)節(jié)pH值為9.5。
另一方面，將純化抗人TSP50抗體8mg溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，中，利用0.01M碳酸鈉緩沖液(pH9.5)在4℃下透析過夜。將得到的過氧化物酶與抗體進(jìn)行混合，在室溫下靜止2.5小時(shí)，加四氫硼酸鈉，在4℃下靜止2小時(shí)。將所得到的過氧化物酶標(biāo)記抗體，利用磷酸鹽緩沖液，在4℃透析過夜即得到酶標(biāo)抗體結(jié)合物，加等體積甘油-20℃保存，使用時(shí)選擇適宜的稀釋度。
實(shí)施例6TSP50蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒的使用方法試劑盒組成1.標(biāo)準(zhǔn)品乳腺癌標(biāo)志分子TSP50蛋白溶液400μl，其濃度為0.1mg/ml2.單克隆抗體小鼠抗TSP50單克隆抗體50μl，抗體濃度為0.1mg/ml，ELISA效價(jià)為1∶10003.多克隆抗體兔抗TSP50多克隆抗體50μl，抗體濃度為1mg/ml，ELISA效價(jià)為1∶10004.酶標(biāo)抗體羊抗兔IgG抗體50μl(購(gòu)自promega公司)，抗體ELISA效價(jià)為1∶1000試劑盒至少包括上述試劑，同時(shí)為了方便，也可裝入酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、濃縮封閉液、顯色劑A、顯色劑B、終止液、半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等。
所述的濃縮洗滌液為磷酸緩沖液，封閉液為BSA-磷酸鹽緩沖液、顯色劑A為1％磷苯二胺(OPD)，顯色劑B為過氧化氫，終止液為2M硫酸。
使用方法1.將各種濃縮液稀釋到應(yīng)用濃度，具體說即將濃縮清洗液稀釋100倍(檢測(cè)時(shí)濃度為0.01M)；封閉液稀釋10倍(檢測(cè)時(shí)BSA濃度為1％)2.配制不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋的洗滌液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml。
3.將純化的鼠抗TSP50單克隆抗體，用0.01M PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋至0.4μg/ml，包被96孔酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜。
4.棄掉抗原包被液，用1％BSA封閉，43℃，30分鐘。
5.棄封閉液，用0.1％ Tween20-PBS洗滌兩次，每次5分鐘。
6.加入不同稀釋度的TSP50蛋白，同時(shí)加入待測(cè)液體，100μl/孔，43℃，30分鐘。
7.用0.1％ Tween20-PBS洗滌三次，每次5分鐘。
8.加入兔抗TSP50多克隆抗體，100μl/孔，43℃，30分鐘。
9.用0.1％ Tween20-PBS洗滌三次，每次5分鐘。
10.加入羊抗兔IgG，100μl/孔，43℃，30分鐘。
11.用0.1％ Tween20-PBS洗滌三次，每次5分鐘。
12.加OPD顯色底物，室溫反應(yīng)5分鐘。
13.每孔加50μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)OD492值。
根據(jù)TSP50標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有待檢樣品可根據(jù)其OD492值從此標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到其對(duì)應(yīng)的值，此數(shù)值即為該樣品中TSP50的含量。
實(shí)施例7免疫組化檢測(cè)乳腺癌中TSP50的表達(dá)取乳腺癌及癌旁組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟入水，用0.3％H2O2-甲醇浸泡30-40分鐘，PBS洗滌三次，再用0.1％的凝膠封閉，30-60分鐘，棄去多余封閉液，加入TSP50多克隆抗體(亦可用單克隆抗體)，37℃ 1小時(shí)或4℃過夜，用PBS洗三次，每次5分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(如一抗用單抗則此處為HRP-兔抗鼠IgG)，室溫1小時(shí)，用PBS洗三次，每次5分鐘，加新鮮配制的DAB(0.5mg/ml)+H2O2(1μl/ml)，3-5分鐘，常規(guī)脫水、封片、鏡檢。
實(shí)施例8用TSP50抗體對(duì)TSP50進(jìn)行表位結(jié)構(gòu)分析用TSP50的單克隆抗體篩選噬菌體15肽庫(kù)(可購(gòu)買商品化肽庫(kù))，其具體方法為先將肽庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，然后加入到已包被了抗TSP50單克隆抗體的培養(yǎng)皿中進(jìn)行孵育，遞呈在噬菌體表面的能與抗體結(jié)合的小肽將與抗體牢固結(jié)合，將沒有結(jié)合的噬菌體洗滌掉，洗脫與抗體結(jié)合的噬菌體并進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體再投入下一輪篩選，如此反復(fù)3-4次，通過對(duì)肽庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增、淘洗和篩選，得到陽性克隆。將所得陽性克隆用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行篩選，找到與TSP50競(jìng)爭(zhēng)與單克隆抗體結(jié)合的克隆，具體方法為用單克隆抗體包被酶標(biāo)板，BSA封閉后加入TSP50蛋白和所得噬菌體，同時(shí)以單獨(dú)加入TSP50蛋白孔為對(duì)照組，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的TSP50多克隆抗體，OPD顯色，測(cè)定OD492值，找到可與TSP50競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合的噬菌體并提取其DNA進(jìn)行測(cè)序，找出其保守序列，此保守序列即為理論上推斷的TSP50的表位，再通過計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)一步確定TSP50的表位結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例9用TSP50抗體對(duì)TSP50進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位研究將培養(yǎng)良好的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞接種到放有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)過夜，棄上清，用PBS洗二次，然后用4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用PBS洗三次，再加入冰浴的甲醇作用20分鐘，用1％BSA室溫封閉1小時(shí)后加入TSP50單克隆抗體(或多克隆抗體)，4℃過夜，次日用PBS洗三次后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體(或羊抗兔抗體，依據(jù)所擁一抗而定)，4℃作用2小時(shí)，將蓋玻片封至載玻片上后用共聚焦相差顯微鏡觀察TSP50在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。
實(shí)施例10TSP50單克隆抗體介導(dǎo)的藥用放射性核素131I對(duì)乳腺癌的體內(nèi)定位取雌性裸鼠，在其腹部乳腺兩側(cè)脂肪墊各注入0.2ml生長(zhǎng)良好的人乳腺癌傳代細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)8×106個(gè))，制備荷瘤鼠模型。
將用公知的Idogen或氯胺T法標(biāo)記了藥用放射性核素131I(亦可標(biāo)記99Tcm、123I及111In)的TSP50單克隆抗體1E9B11經(jīng)鼠尾血管注入。分別于24、48、60、72、84、96小時(shí)后用放免顯像方法檢測(cè)131I標(biāo)記抗體在荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像情況，結(jié)果表明經(jīng)動(dòng)脈注入放射性標(biāo)記的抗體后，顯像率為90.9％，48小時(shí)起在癌區(qū)集聚，96小時(shí)最為清晰，T/NT為6.2。
實(shí)施例11用TSP50抗體從TSP50蛋白提取物中親和純化TSP50蛋白(一)親和層析柱的制備(趙強(qiáng)等，北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)1990，22307)純化濃縮的TSP50單克隆抗體(或多克隆抗體)與PBS及結(jié)合緩沖液透析過夜，緩液數(shù)次。
按10-30g抗體/g載體的比例，根據(jù)需要交聯(lián)的量，稱取CNBr-sepharose4B，用1mM HCl浸泡，4℃，15分鐘，然后用1mM HCl抽濾、洗滌，以除去保護(hù)劑。用0.1M的碳酸鈉、碳酸氫鈉結(jié)合緩沖液快速?zèng)_洗至pH為中性，與抗體20g立即混合并加入適量結(jié)合緩沖液，搖床慢速攪拌，4℃過夜。抽濾并測(cè)定抽濾液中抗體含量。用0.1M的碳酸鈉、碳酸氫鈉結(jié)合緩沖液懸浮裝柱，洗至無抗體流出(OD280＜0.01)，測(cè)定流出抗體總量。用1M乙醇胺浸泡柱床，封閉剩余反應(yīng)基團(tuán)。用0.1M醋酸緩沖液及結(jié)合緩沖液循環(huán)洗柱二次，再用0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液洗柱，最后用0.01M PBS洗柱后即為待用狀態(tài)。
(二)親和層析純化TSP50蛋白取真核或原核表達(dá)的TSP50蛋白粗提物，緩慢加入親和柱中，待其全部進(jìn)入柱床后夾住親和柱出口使蛋白與柱作用30分鐘，以PBS洗至OD280＜0.01，再用2.5M NaCl洗至OD280＜0.01，最后用2倍柱床體積的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗下的蛋白液，并立即以1M NaHCO3液中和pH至中性。
實(shí)施例12TSP50單克隆抗體介導(dǎo)的藥用放射性核素131I對(duì)乳腺癌的治療作用取雌性裸鼠，在其腹部乳腺兩側(cè)脂肪墊各注入0.2ml生長(zhǎng)良好的人乳腺癌傳代細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)8×106個(gè))，制備荷瘤鼠模型。
將用公知的Idogen或氯胺T法標(biāo)記了藥用放射性核素131I(亦可標(biāo)記99Tcm、123I及111In)的TSP50單克隆抗體1E9B11經(jīng)鼠尾血管注入。分別于1、3、5、7、14天后用CT的計(jì)算值觀察131I標(biāo)記抗體對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明90.3％的荷瘤鼠的腫瘤得以縮小，其中81.1％的荷瘤鼠其腫瘤縮小50％以上。
實(shí)施例13被動(dòng)接種TSP50抗體對(duì)乳腺癌荷瘤鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用取雌性裸鼠，在腹部乳腺兩側(cè)脂肪墊各注入0.2ml生長(zhǎng)良好的人乳腺癌傳代細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)8×106個(gè))，制備乳腺癌荷瘤鼠模型。將純化的TSP50單克隆抗體1E9B11及多克隆抗體分高(2mg/kg)、中(0.8mg/kg)、低劑量(0.2mg/kg)注射到荷瘤模型小鼠體內(nèi)，同時(shí)設(shè)兔IgG對(duì)照及生理鹽水對(duì)照，每周注射一次，21天后處死動(dòng)物，測(cè)量瘤體積變化并進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察被動(dòng)接種的TSP50抗體的抗腫瘤作用。結(jié)果如表1所示，大、中、小劑量單克隆抗體的抑瘤率分別為76.0％、65.4％、54.1％；多克隆抗體的抑瘤率分別為80.2％、75.4％、61.3％?？贵w組與生理鹽水組及兔IgG組比較瘤體積重量均有顯著性差異(P＜0.001)。
表1TSP50抗體的抗乳腺癌效果

*表示與0.9％NaCl組相比有顯著差異，p＜0.001Δ表示與兔IgG組相比有顯著差異，p＜0.00權(quán)利要求
1.一種針對(duì)人睪丸特異性蛋白50的單克隆抗體的制備方法，其特征在于它是利用人工合成的睪丸特異性蛋白50的小肽、原核及真核表達(dá)的睪丸特異性蛋白50的成熟蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。
2.一種針對(duì)人睪丸特異性蛋白50的多克隆抗體的制備方法，其特征在于它是利用人工合成的睪丸特異性蛋白50的小肽、原核及真核表達(dá)的睪丸特異性蛋白50的成熟蛋白免疫動(dòng)物而得到多克隆抗體。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所制備的抗體在睪丸特異性蛋白50相關(guān)性疾病進(jìn)行診斷的應(yīng)用。
4.將權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體用于檢測(cè)睪丸特異性蛋白50結(jié)構(gòu)與睪丸特異性蛋白50變異。
5.將權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體用于睪丸特異性蛋白50體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)分布的定位。
6.將權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體用于純化睪丸特異性蛋白50的用途。
7.將權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體用于制備與睪丸特異性蛋白50相關(guān)性疾病的治療藥物用途。
8.將權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體作為睪丸特異性蛋白50相關(guān)性疾病的被動(dòng)免疫制劑。
9.一種睪丸特異性蛋白50相關(guān)性疾病的診斷試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1-2或二者之一方法制備的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類用于臨床及科研檢測(cè)與乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的睪丸特異性蛋白50的生物試劑，公開了睪丸特異性蛋白50單克隆抗體及多克隆抗體的制備方法，本發(fā)明還提供了這些抗體或其衍生物在制備藥物和診斷試劑中的用途，包括有單克隆抗體及多克隆抗體，可用于臨床檢測(cè)惡性腫瘤患者的TSP50水平，從而對(duì)疾病進(jìn)行診斷并指導(dǎo)臨床治療及預(yù)測(cè)估計(jì)，亦可用于研究TSP50與腫瘤及各種疾病的關(guān)系。同時(shí)所述抗體或其衍生物亦可作為藥物用于TSP50相關(guān)疾病的治療。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1824789SQ200510016590
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者李玉新, 鮑永利, 徐浩鵬, 楊明, 劉洋, 烏垠, 孟祥穎, 單繼東, 張靖, 易靜雯 申請(qǐng)人:李玉新, 徐浩鵬, 鮑永利