專利名稱：兔抗人ATP7Bn33－629多克隆抗體的優(yōu)選與提取法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及早期基因診斷疾病的方法，具體的說(shuō)是對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃圆〉耐每谷薃TP7Bn33-629多克隆抗體的優(yōu)選與提取法。
背景技術(shù)：
肝豆?fàn)詈俗冃裕址QWilson病(WD)，是一種較常見的常染色體隱性遺傳病。致病基因?yàn)锳TP7B基因，編碼ATP7B蛋白。其發(fā)病與ATP7B基因突變導(dǎo)致ATP7B蛋白功能下降有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制迄今不清。由于基因突變?cè)斐傻鞍坠δ芨淖?，使金屬銅和銅藍(lán)蛋白前體的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致銅從肝臟經(jīng)膽管分泌到膽汁的量減少，而大量蓄積于肝臟、腎臟、腦和角膜，臨床上出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，表現(xiàn)為肝腎損害、錐體外系病變、智能障礙及角膜色素環(huán)等。盡管驅(qū)銅治療對(duì)本病有一定療效，但有賴于早期診斷和治療。由于本病早期癥狀通常不典型且表現(xiàn)多樣化，極易被誤診而延誤治療，故病殘率和病死率均很高，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此，只有進(jìn)行ATP7B蛋白功能的研究，從而揭示W(wǎng)D發(fā)病機(jī)制，才能從根本上解決WD的早期診斷和治療問題。
研究ATP7B蛋白的功能及其致病機(jī)制，高質(zhì)量的ATP7B抗體是必備條件。研究發(fā)現(xiàn)，ATP7B基因定位于13q14.3，編碼1466個(gè)氨基酸的ATP7B蛋白，它是一種膜蛋白，參與銅跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝過(guò)程，其N-末端有6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)，含有8個(gè)跨膜區(qū)，可轉(zhuǎn)運(yùn)銅透過(guò)細(xì)胞膜，因此，N-末端是該蛋白的主要功能區(qū)。由于ATP7B基因編碼區(qū)cDNA長(zhǎng)達(dá)4398bp，要制備涵蓋全長(zhǎng)編碼區(qū)的ATP7B抗體十分困難，所以目前國(guó)外學(xué)者制備的ATP7B抗體均為N端涵蓋數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)氨基酸的抗體或C端抗體，未包括主要功能區(qū)。此類抗體的敏感性雖然較高，但抗體的特異性不夠，限制了抗體使用的深度和廣度，如僅能用于免疫印跡或僅能用于免疫組化，并且容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，因此不是最佳ATP7B抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在ATP7B基因中優(yōu)選出一段編碼序列，并制備出多克隆抗體的提取方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是制備抗體，首先必須合成制備抗體的蛋白。選用哪一段蛋白來(lái)制備抗體及如何合成正確序列的蛋白是本發(fā)明的關(guān)鍵。由于ATP7B基因長(zhǎng)達(dá)4398bp，要制備全長(zhǎng)編碼區(qū)的ATP7B蛋白十分困難，也無(wú)必要；但如果僅合成N端數(shù)十個(gè)氨基酸的蛋白來(lái)制備抗體，可能導(dǎo)致抗體特異性不夠高。一種兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的優(yōu)選，其特征是針對(duì)ATP7B蛋白的功能區(qū)，選定涵蓋N端33至629位氨基酸的蛋白來(lái)制備抗體，包括了N端6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)重要跨膜區(qū)。
直接通過(guò)合成多肽來(lái)合成這么大片段且編碼正確的蛋白十分昂貴，也是不現(xiàn)實(shí)的，因此本發(fā)明選擇GST基因融合蛋白的方法來(lái)制備該目的蛋白片段。所述的GST基因融合蛋白，必須構(gòu)建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物。
本發(fā)明的兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的具體提取方法1、制備正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段新鮮肝臟組織來(lái)源于急性肝外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg肝臟組織，加入1mlTRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入150～250μl氯仿，用力上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000離心10～30分鐘；小心吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000離心5～15分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000g離心3～8分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀15～30分鐘。溶解沉淀后-80℃保存?zhèn)溆?。將此RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段。
2、引物設(shè)計(jì)及GST基因融合載體的選擇要保證長(zhǎng)達(dá)1791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段(目的基因片段)正確無(wú)誤，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。為了保證目的基因片段(ATP7B基因N端33-629氨基酸片段)與GST基因融合載體連接后，氨基酸編碼不發(fā)生移碼改變，在眾多的GST基因融合載體中，我們選擇了pGEX4T-1載體，并選用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI做為連接點(diǎn)。之所以選擇這2種內(nèi)切酶，是因?yàn)锳TP7B基因N端33-629氨基酸片段上沒有這2個(gè)切點(diǎn)，而且它們也是比較常見的限制性內(nèi)切酶。引物設(shè)計(jì)通常采用引物設(shè)計(jì)軟件，但在此處，我們不用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設(shè)計(jì)了6條引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切點(diǎn))1F 5’-gCggCCg_cATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切點(diǎn))2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用來(lái)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列。
3、制備目的基因片段并連接到GST基因融合載體上以正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1R、1F和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增ATP7B基因N端97～1887cDNA序列。應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽(yáng)性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒。SalI和NotI雙酶切證實(shí)陽(yáng)性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析儀測(cè)序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了56個(gè)陽(yáng)性TA克隆才挑到了一個(gè)序列完全正確的克隆。應(yīng)用SalI和NotI雙酶切正確的TA克隆，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過(guò)SalI和NotI雙酶切回收的GST基因融合載體(pGEX4T-1)上并轉(zhuǎn)化。
4、含目的基因片段的GST基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST基因融合載體克隆，用5ml 2YT培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結(jié)果顯示GST基因融合蛋白片段大小正確，表達(dá)良好。
5、制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過(guò)柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin 4～15℃酶切過(guò)夜，第二天過(guò)柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS膠進(jìn)一步確認(rèn)目的蛋白的片段和純度并檢測(cè)蛋白濃度。
6、制備并純化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體(Rabbit anti-humanATP7Bn33-629 polyclonal antibody)ATP7Bn33-629目的蛋白與佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫家兔，1個(gè)月后從家兔的耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測(cè)ATP7Bn33-629多克隆抗體的滴度，此時(shí)為1∶2000。此后每7～14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，ELISA方法檢測(cè)抗體滴度。加強(qiáng)免疫3次后，ELISA方法檢測(cè)抗體的滴度達(dá)到了1∶16000。采用免疫印跡方法驗(yàn)證抗體的特異性，結(jié)果證實(shí)該抗體具有高度特異性，無(wú)非特異性條帶。上述結(jié)果提示該抗體的敏感性和特異性均很高。此時(shí)，從家兔心臟穿刺取血，離心收集抗體血清分裝，采用Immobilized ProteinAColumn(Pierce公司)純化抗體，檢測(cè)濃度并分裝，保存于-20℃。我們將該抗體命名為兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體(Rabbitanti-human ATP7Bn33-629 polyclonal antibody)。
7、兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的應(yīng)用
(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜30～60分種；兔抗人ATP7Bn33-629抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫?fù)u育2～6小時(shí)或4～8℃搖育過(guò)夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫?fù)u育45～90分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過(guò)氧化物底物顯色，壓片并沖片。結(jié)果見圖1。
(2)免疫熒光染色ATP7B表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4～8％多聚甲醛固定細(xì)胞，5～10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞30～60分鐘；兔抗人ATP7Bn33-629抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶紅色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應(yīng)30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘；封片鏡下觀察，結(jié)果見圖2。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體，含ATP7B蛋白N端的近600個(gè)氨基酸，涵蓋了其主要的功能區(qū)，即N端的6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)重要跨膜區(qū)，從而保證了抗體的高度特異性，有助于進(jìn)行ATP7B蛋白功能的研究及WD的早期快速基因診斷。同時(shí)本發(fā)明在優(yōu)選的基礎(chǔ)上提出了其制備的提取方法，故對(duì)于肝豆?fàn)詈俗冃圆〉脑缙诨蛟\斷有著極積的作用。


圖1是本發(fā)明抗體用于免疫印跡的結(jié)果照片。標(biāo)記1為不表達(dá)ATP7B蛋白的樣品；3和4為ATP7B蛋白陽(yáng)性表達(dá)的樣品。片段大小為163Kd，介于97Kd和220Kd之間。
圖2是本發(fā)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞(帶紅色熒光)與未轉(zhuǎn)染上ATP7B表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞相間生長(zhǎng)鏡下圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1針對(duì)ATP7B蛋白的功能區(qū)，選定涵蓋N端33至629位氨基酸的蛋白來(lái)制備抗體，包括了N端的6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)重要跨膜區(qū)。
實(shí)施例2選擇GST基因融合蛋白的方法來(lái)制備該目的蛋白片段，GST基因融合蛋白，必須構(gòu)建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物。
具體提取方法1、制備正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段新鮮肝臟組織來(lái)源于急性肝外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg肝臟組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5分鐘，4℃12000g離心15分鐘；小心吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入500μl異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管5次，置冰浴10分鐘，4℃ 12000g離心10分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入1ml 75％乙醇，振蕩，4℃ 7500g離心5分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀20分鐘，溶解沉淀后-80℃保存?zhèn)溆谩⒋薘NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段。
2、引物設(shè)計(jì)及GST基因融合載體的選擇為了保證目的基因片段(ATP7B基因N端33-629氨基酸片段)與GST基因融合載體連接后，氨基酸編碼不發(fā)生移碼改變，在眾多的GST基因融合載體中，選擇了pGEX4T-1載體，并選用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI做為連接點(diǎn)，因?yàn)锳TP7B基因N端33-629氨基酸片段上沒有這2個(gè)切點(diǎn)，而且它們也是比較常見的限制性內(nèi)切酶。引物設(shè)計(jì)通常采用引物設(shè)計(jì)軟件，但在此處，不用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設(shè)計(jì)了6條引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切點(diǎn))1F 5’-gCggCCg_ccATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切點(diǎn))2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用來(lái)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列。對(duì)于1F和1R引物設(shè)計(jì)是有一定技巧的，在1F的5’端添加了SalI切點(diǎn)序列g(shù)TCgAC，其后的堿基序列與ATP7B基因N端33-36氨基酸片段一致，1R為反向序列，在其5’端添加了NotI切點(diǎn)序列g(shù)CggCCgC，其后的堿基序列與ATP7B基因N端625-629氨基酸片段一致，使目的基因片段可通過(guò)SalI和NotI雙酶切連到pGEX4T-1載體上。值得一提的是，在1F和1R引物的3’端均以A收尾，而不是常規(guī)的以G或C收尾，目的是為了做TA克隆時(shí)更容易挑到陽(yáng)性克隆。2R、3F、4R和5F引物設(shè)計(jì)遵從常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則即可。
3、制備目的基因片段并連接到GST基因融合載體上以正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1R、1F和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增ATP7B基因N端97-1887cDNA序列。應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽(yáng)性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒。SalI和NotI雙酶切證實(shí)陽(yáng)性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析儀測(cè)序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了56個(gè)陽(yáng)性TA克隆挑到了一個(gè)序列完全正確的克隆。應(yīng)用SalI和NotI雙酶切正確的TA克隆，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過(guò)SalI和NotI雙酶切回收的GST基因融合載體(pGEX4T-1)上并轉(zhuǎn)化。
4、含目的基因片段的GST基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST基因融合載體克隆，用5ml 2YT培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結(jié)果顯示GST基因融合蛋白片段大小正確，表達(dá)良好。
5、制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過(guò)柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin 4～15℃酶切過(guò)夜，第二天過(guò)柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS膠進(jìn)一步確認(rèn)目的蛋白的片段和純度并檢測(cè)蛋白濃度。
6、制備并純化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體(Rabbit anti-humanATP7Bn33-629 polyclonal antibody)ATP7Bn33-629目的蛋白與佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫家兔，1個(gè)月后從家兔的耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測(cè)ATP7Bn33-629多克隆抗體的滴度，此時(shí)為1∶2000。此后每7～14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，ELISA方法檢測(cè)抗體滴度。加強(qiáng)免疫3次后，ELISA方法檢測(cè)抗體的滴度達(dá)到了1∶16000。采用免疫印跡方法驗(yàn)證抗體的特異性，結(jié)果證實(shí)該抗體具有高度特異性，無(wú)非特異性條帶。此時(shí)，從家兔心臟穿刺取血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)純化抗體，檢測(cè)濃度并分裝，保存于-20℃。
7、兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的應(yīng)用(1)免疫印跡(請(qǐng)參閱圖1)2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜30～60分種；兔抗人ATP7Bn33-629抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫?fù)u育2～6小時(shí)或4～8℃搖育過(guò)夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫?fù)u育45～90分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過(guò)氧化物底物顯色，壓片并沖片。
(2)免疫熒光染色(請(qǐng)參閱圖2)ATP7B表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4～8％多聚甲醛固定細(xì)胞，5～10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞30～60分鐘；兔抗人ATP7Bn33-629抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶紅色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應(yīng)30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘；封片鏡下觀察。
權(quán)利要求
1.一種兔抗人ATP7Bn33-629多克隆體的優(yōu)選，其特征是針對(duì)ATP7B蛋白的功能區(qū)，選定涵蓋N端33至629位氨基酸的蛋白來(lái)制備抗體，包括了N端的6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)重要跨膜區(qū)。
2.一種兔抗人ATP7Bn33-629多克隆體的優(yōu)選，其特征是選擇GST基因融合蛋白的方法來(lái)制備該目的蛋白片段，所述的GST基因融合蛋白，必須構(gòu)建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物。
3.本發(fā)明的兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的具體提取方法(1)制備正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段新鮮肝臟組織來(lái)源于急性肝外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg肝臟組織，加入1mlTRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入150～250μl氯仿，上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000離心10～30分鐘；吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000離心5～15分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000g離心3～8分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀15～30分鐘；溶解沉淀后-80℃保存?zhèn)溆?。將此RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段；(2)引物設(shè)計(jì)及GST基因融合載體的選擇選擇了pGEX4T-1載體，并選用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI做為連接點(diǎn)；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列；共設(shè)計(jì)了6條引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切點(diǎn))1F 5’-gCggCCgcATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切點(diǎn))2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用來(lái)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列；(3)制備目的基因片段并連接到GST基因融合載體上以正常人全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1R、1F和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增ATP7B基因N端97-1887cDNA序列；應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽(yáng)性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒；SalI和NotI雙酶切證實(shí)陽(yáng)性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析儀測(cè)序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性；應(yīng)用SalI和NotI雙酶切正確的TA克隆，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過(guò)SalI和NotI雙酶切回收的GST基因融合載體(pGEX4T-1)上并轉(zhuǎn)化；(4)含目的基因片段的GST基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST基因融合載體克隆，用5ml 2YT培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，顯示GST基因融合蛋白片段大??；(5)制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過(guò)柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin 4～15℃酶切過(guò)夜，第二天過(guò)柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS膠進(jìn)一步確認(rèn)目的蛋白的片段和純度并檢測(cè)蛋白濃度；(6)制備并純化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體ATP7Bn33-629目的蛋白與佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫家兔，1個(gè)月后從家兔的耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測(cè)ATP7Bn33-629多克隆抗體的滴度，此時(shí)為1∶2000；此后每7～14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，ELISA方法檢測(cè)抗體滴度；加強(qiáng)免疫3次后，ELISA方法檢測(cè)抗體的滴度達(dá)到了1∶16000；采用免疫印跡方法驗(yàn)證抗體的特異性，結(jié)果證實(shí)該抗體具有高度特異性，無(wú)非特異性條帶；從家兔心臟穿刺取血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)純化抗體，檢測(cè)濃度并分裝，保存于-20℃。
4.兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗體的應(yīng)用，其特征是(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜30～60分種；兔抗人ATP7Bn33-629抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫?fù)u育2～6小時(shí)或4～8℃搖育過(guò)夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫?fù)u育45～90分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過(guò)氧化物底物顯色，壓片并沖片；(2)免疫熒光染色ATP7B表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4～8％多聚甲醛固定細(xì)胞，5～10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞30～60分鐘；兔抗人ATP7Bn33-629抗體其濃度為5μg/μl，1∶50～1∶150稀釋，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶紅色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應(yīng)30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘；封片鏡下觀察。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兔抗人ATP7Bn33－629多克隆抗體的優(yōu)選與提取法，該發(fā)明涉及到利用基因早期診斷疾病的方法。本發(fā)明的優(yōu)選是針對(duì)ATP7B蛋白的功能區(qū)，選定涵蓋N端33至629位氨基酸的蛋白來(lái)制備抗體，包括了N端的6個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)重要跨膜區(qū)等重要功能區(qū)。本發(fā)明在優(yōu)選的基礎(chǔ)上還提出了其制備方法，并根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸目的片段的GST基因融合蛋白來(lái)制備抗體。本發(fā)明所制備的抗體具有高度特異性和敏感性，有助于進(jìn)行ATP7B蛋白功能的研究及WD的早期快速基因診斷。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1634992SQ20041009718
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者吳志英, 王檸 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院