專利名稱：沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的抗體及其制備方法，具體的說是一種沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB是由沙門氏菌SP1-1 III型分泌系統(tǒng)分泌的一種由561個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，是一種肌醇磷脂酶，是目前沙門氏菌分泌的效應(yīng)蛋白中研究最多，功能最多樣化的一個蛋白。沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB首先作用于質(zhì)膜，激活SH3-鳥核苷酸交換因子(SGEF)，間接活化交換因子RhoG，從而進(jìn)一步激活肌動蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，促使沙門氏菌侵入宿主細(xì)胞。沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB能夠激活原癌基因Akt473的磷酸化，對細(xì)菌入侵介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，促進(jìn)宿主細(xì)胞的存活，為沙門氏菌在宿主細(xì)胞中的存活提供條件。同時，SopB通過招募RAB5和VPS34到SCV(Salmonella ContainingVacuole, SCV),促進(jìn)SCV在宿主細(xì)胞內(nèi)的形成和成熟，這對沙門氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活與復(fù)制具有重要的意義。此外，SopB能夠激活宿主細(xì)胞蛋白激酶Erkl/2，p38和JNK的磷酸化激活，調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等功能。雖然不同類型的沙門氏菌基因組間存在DNA水平的差異，但通過序列分析發(fā)現(xiàn)，在能夠引起人類疾病的五大類沙門氏菌(如表I所示)中除了鴨沙門氏菌基因組未測序以夕卜，SopB廣泛存在于其他不同類型的沙門氏菌中，而且蛋白序列高度保守，足見其功能的重要性。因此，SopB的功能研究將為揭示沙門氏菌的致病機(jī)理，以及尋找沙門氏菌性腸道疾病的治療靶點具有重要的意義。

表1.沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB在不同類型沙門氏菌中的分布
權(quán)利要求
1.一種沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，以沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB全長氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的從N末端第29位至第168位共計140個氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)序列為免疫原，采用常規(guī)多克隆抗體的制備方法制備抗血清； 步驟二，純化抗血清，即得沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1，克隆編碼沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB N末端第29位至168位共計140個氨基酸的蛋白的如SEQ ID NO:9所示的SopB29-168核酸片段； 步驟2，將步驟I得到的SopB29-168核酸片段和pSUMO表達(dá)載體分別酶切后構(gòu)建第一連接體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選pSUM0-SopB29-168重組質(zhì)粒；利用所得的pSUM0-SopB29-168重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)，融合蛋白的誘導(dǎo)，裂解，掛鎳柱，Ulpl酶切，純化后，得沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB29-168蛋白； 步驟3，以步驟2所得沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB29-168蛋白為免疫原，采用常規(guī)多克隆抗體的制備方法制備抗血清，利用HiTrap NHS-activated HP親和層析柱純化抗血清，即得沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟I中，所述克隆所用引物對具體為SEQ ID NO: 10所示的上游引物和SEQ ID NOill所示的下游引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述構(gòu)建的第一連接體系由I μ I BamHl和XhoI酶切后的pSUMO表達(dá)載體、7.5 μ I BamHl和XhoI酶切后的所述SopB29_168核酸片段、I μ IlOX連接酶緩沖液和0.5μ I T4DNA連接酶組成，連接條件是16°C連接過夜；所述篩選pSUM0-SopB29_168重組質(zhì)粒的過程為:將所述第一連接體系轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci中，使用含有34μ g/ml卡那霉素的LB平板，37°C下培養(yǎng)12-16h，隨機(jī)挑取4個單克隆接種于5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并用BamHl和XhoI雙酶切鑒定，選取重組質(zhì)粒測序，測序正確的即為所需的pSUM0-SopB29-168重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述培養(yǎng)的過程為:將所述pSUM0-SopB29-168重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)后，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆至5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜；將所得過夜培養(yǎng)物接種至IL含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)2.5-3h，至大腸桿菌BL21 (DE3)的OD6tltl值為0.6-0.8之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述融合蛋白的誘導(dǎo)具體為:在上述OD6c 值為0.6-0.8之間的大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑異丙基-B -D-硫代吡喃半乳糖苷，使誘導(dǎo)劑的終濃度為0.lmmol/L，在22°C下振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述裂解具體為:將上述IL誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)液離心收集菌體，用50ml第一裂解緩沖液重懸，所述第一裂解緩沖液的組成為50mmol/L Tris-HCl,內(nèi)含500mmol/L氯化鈉、20mmol/L咪唑、lmmol/L苯甲基橫酸氟和0.2 μ mol/L細(xì)菌蛋白酶抑制劑混合物cocktail3，pH值為8.0;將重懸后的菌液在(TC冰水浴中用功率為400w的超聲波進(jìn)行超聲破碎，間歇破碎90次，每超聲3秒，間隔7s ;將超聲波破碎后的菌液于13200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30min，收集上清液，所得上清液于0.45 μ m膜過濾后得到破碎的大腸桿菌上清液備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述掛鎳柱的過程為:取2ml專門用于組氨酸標(biāo)簽蛋白純化的鎳柱，輕微離心后，吸去上清液，鎳柱用等體積的所述第一裂解緩沖液洗滌兩次；將洗滌后的鎳柱加入所述用0.45 μ m膜過濾后破碎的大腸桿菌上清液中，于4°C輕微旋轉(zhuǎn)混勻30min ;用5倍體積的所述第一裂解緩沖液潤洗三次后，將掛有SUM0-SopB29-168融合蛋白的鎳柱保存在I倍體積的50mmol/L Tris-HCl, pH值為8.0的緩沖液中，待用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述Ulp I酶切具體為:將pET28a-Ulpl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆至5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜；將所得過夜培養(yǎng)物接種至IL含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)2.5-3h，至大腸桿菌BL21 (DE3)的OD600值為0.6-0.8之間；在OD600值為0.6-0.8的大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入異丙基-B -D- 硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.lmmol/L,22°C下振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)12-16h ;將IL誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)液離心收集菌體，用50ml第二裂解緩沖液重懸，所述第二裂解緩沖液為pH值為8.0的50mmol/LTriS-HCl，內(nèi)含500mmol/L氯化鈉和20mmol/L咪唑；將重懸后的菌液在0°C冰水浴中用超聲波破碎，400W功率間歇破碎100次，每超聲3秒，間隔7s ;將超聲波破碎后的菌液于13200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30min，收集上清液，所得上清液用0.45 μ m膜過濾后得到Ulpl表達(dá)的破碎的大腸桿菌上清液備用；取2ml鎳柱輕微離心后吸去上清液，鎳柱用等體積的所述第二裂解緩沖液洗滌兩次；將洗滌后的鎳柱加入所述用0.45 μ m膜過濾后的Ulpl表達(dá)的破碎的大腸桿菌上清液中，于4°C輕微旋轉(zhuǎn)混勻30min ;用5倍體積的所述第二裂解緩沖液潤洗三次后，用pH值為8.0、內(nèi)含200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl作為緩沖液洗脫Ulpl蛋白酶；將所得Ulpl蛋白酶溶液按照體積比1:10的比例加入到所述掛有SUM0-SopB29-168融合蛋白的鎳柱溶液中，置于4°C冰箱中酶切過夜；所述純化過程為:將所得Ulpl蛋白酶酶切后的體系于4°C輕搖30min后于2000轉(zhuǎn)/分離心2min，收集上清液即獲得初步純化的SopB29_168蛋白；對初步純化的SopB29-168蛋白進(jìn)行陰離子交換層析,具體步驟為:首先用50mmol/L Tris-HCl、pH值為8.0的溶液平衡HiTrap Q HP陰離子交換柱，然后將上述初步純化的SopB29-168蛋白進(jìn)行掛柱，掛柱結(jié)束后用5倍體積、pH值為8.0的50mmol/L Tris-HCl緩沖液潤洗兩次，潤洗結(jié)束后用PH值為8.0、內(nèi)含150mmol/L氯化鈉的50mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫蛋白，最后將洗脫下來的蛋白進(jìn)行分子篩層析；所述分子篩層析的過程為:用20mmol/L pH值為7.6的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液平衡Superdex20010/300層析柱，上樣后用20mmol/L pH值為7.6的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集蛋白樣品；將洗脫下來的蛋白樣品采用SDS-PAGE電泳分離后，進(jìn)行考馬斯亮蘭染色鑒定，最后得到高純度的目標(biāo)蛋白為免疫原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述利用HiTrap NHS-activated HP親和層析柱純化抗血清具體為=HiTrap NHS-activated HP親和層析柱在使用前要進(jìn)行預(yù)處理，即首先用10_15倍體積的預(yù)冷的lmmol/L的鹽酸溶液沖洗HiTrapNHS-activated HP親和層析柱,然后在得到的SopB29-168蛋白溶液中按照體積比為10:1的比例加入？!1值為8.3的內(nèi)含211101/1的碳酸氫鈉和5mol/L氯化鈉的溶液,從而得到內(nèi)含終濃度為0.2mol/L的碳酸氫鈉和0.5mol/L氯化鈉的SopB29-168蛋白溶液；將所得含有碳酸氫鈉和氯化鈉的SopB29_168蛋白溶液按照體積比0.5:1的比例加入到HiTrap NHS-activated HP親和層析柱中，于4 偶聯(lián)過夜后,用兩倍體積的PH值為8.3的內(nèi)含0.5mol/L的乙醇胺和0.5mol/L氯化鈉的溶液置換掉pH值為8.3的碳酸氫鈉緩沖液；接下來依次用高pH值的溶液和低pH值的溶液輪流潤洗5次，所述高PH值的溶液為pH值為8.0的0.lmol/L Tris-HCl溶液，所述低pH值的溶液為pH值為4.0的內(nèi)含0.lmol/L醋酸鈉和0.5mol/L氯化鈉的溶液;至此，SopB29_168蛋白與HiTrapNHS-activated HP親和層析柱的偶聯(lián)完畢；將獲得的抗血清中加入終濃度為10mmol/L、pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液，得到抗血清溶液；用獲得的抗血清溶液掛偶聯(lián)了 SopB29_168免疫原蛋白的HiTrap NHS-activated HP親和層析柱；并用5倍體積的lOmmol/L、pH值為7.5內(nèi)含0.5mol/L氯化鈉的Tris-HCl溶液潤洗，潤洗完畢后用pH值為2.5的0.lmol/L甘氨酸鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫下來后迅速按照體積比為10:1的比例往甘氨酸鹽酸的洗脫液中加入濃度為500mmol/L的pH值為7.6的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)而獲得pH值接近中性的SopB多克隆 抗體溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體的制備方法，旨在提供一種特異性好、靈敏度高、可與沙門氏菌感染宿主細(xì)胞的過程中分泌的內(nèi)源性沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB發(fā)生特異性結(jié)合的兔源多克隆抗體的制備方法。以沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB全長氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的從N末端第29位至第168位共計139個氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)序列為免疫原，采用常規(guī)多克隆抗體的制備方法制備抗血清；純化抗血清，即得沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體。本發(fā)明的方法得到了沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的多克隆抗體，有利于對沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB的免疫印跡分析、免疫熒光染色激光共聚焦顯微觀察，以及人們對腸道致病菌感染機(jī)制的深入研究。
文檔編號C12N15/55GK103204936SQ20131002950
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者阮海華, 張振奇, 陶永清, 趙輝, 張坤生 申請人:天津商業(yè)大學(xué)