專利名稱：血管生成素類似蛋白v及其制備方法,其多克隆抗體及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種功能性表達純化的新的多肽-血管生成素類似蛋白V，以及此多肽及其抗體的制備方法和其應用。
背景技術(shù)：
ANGPTLI、ANGPTLII、ANGPTLIII、ANGPTLIV及本發(fā)明中的ANGPTLV均為血管生成素類似蛋白基因家族中的成員，由這些基因編碼的蛋白均有相同的功能域，但這些成員的組織分布均有所不同，ANGPLTIII主要在肝中表達，ANGPTLIV主要在脂肪組織和肝中分布，而ANGPTLV主要在成人心臟組織中特異性表達(圖2顯示ANGPTLV在成人16個組織中的表達情況)，與此家族中的其它成員的分布有十分明顯的區(qū)別。由ANGPTLIII和ANGPTLIV兩個基因編碼的蛋白均為分泌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白均可抑制脂蛋白脂酶LPL的活性，為二型糖尿病相關(guān)基因。根據(jù)流行病學和臨床研究，高甘油三酯血癥是冠心病的一個危險因素，許多研究表明高甘油三酯狀態(tài)及富含甘油三酯的脂蛋白可能致動脈粥樣硬化，促進凝血并抗纖溶。
本發(fā)明的多肽ANGPTLV與ANGPTLIII和ANGPTLIV的同源性較高，含有血管生成素類似蛋白家族的序列特征，即其編碼的蛋白在N端有螺旋-螺旋區(qū)，在C端有纖維素原類似區(qū)域，其具有與ANGPTLIII和ANGPTLIV相似的生物學功能。它對脂蛋白脂酶具有抑制作用(圖3顯示血管生成素類似蛋白V對脂蛋白脂酶具有抑制作用)，在體內(nèi)脂類代謝中起著重要的作用，和其它蛋白一起調(diào)解著甘油三酯、總膽固醇和游離脂肪酸在血漿中的水平。其表達異常對于血漿中脂類代謝產(chǎn)生不良影響，并進而產(chǎn)生相關(guān)疾病，抑制該基因的活性將成為降脂的一個重要靶標。本發(fā)明的血管生成素類似蛋白V的抑制劑不僅適合于糖尿病患者的血脂障礙，而且也適合于代謝綜合癥特別是家族性的高血脂癥、血脂障礙性高血壓和肥胖相關(guān)的血脂障礙等患者。
由于如上所述血管生成素類似蛋白V蛋白是一種糖尿病相關(guān)基因，在脂類代謝中發(fā)揮重要作用，而且這些調(diào)節(jié)過程中涉及大量的蛋白，因而本領(lǐng)域中一直需要鑒定更多參與這些過程的血管生成素類似蛋白V蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新血管生成素類似蛋白V蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎(chǔ)。這種蛋白將構(gòu)成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥物的基礎(chǔ)，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的血管生成素類似蛋白V，并提供該蛋白的融合蛋白的構(gòu)建、表達、純化方法，同時還提供其多克隆抗體及其應用。
本發(fā)明提供的新的多肽-血管生成素類似蛋白V，具有SEQ.ID.NO.1所示序列。
本發(fā)明提供的功能性表達純化的血管生成素類似蛋白V，還包括其片段、類似物和衍生物。該多肽是人源的，它包含與血管生成素類似蛋白V一致的氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有與血管生成素類似蛋白V一致的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還提供含有編碼血管生成素類似蛋白V的多核苷酸的重組載體，特別是表達載體。此外，本發(fā)明還提供一種用該載體遺傳工程化的宿主細胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。本發(fā)明還提供含有編碼血管生成素類似蛋白V的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)血管生成素類似蛋白V的方法和一種包括培養(yǎng)所述宿主細胞和回收表達產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法(圖1顯示血管生成素類似蛋白V的GST融合蛋白的構(gòu)建，表達和純化過程)。具體步驟如下a.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的構(gòu)建用本發(fā)明的編碼的ANGPTLV-GST多核苷酸或變異體，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；b.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的表達在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
c.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的純化從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
重組蛋白可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
d.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的鑒定血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白走SDS-PAGE電泳，在分子量68kDa處得到一單一的條帶(圖1B顯示血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白走SDS-PAGE的情況)。做western檢測可見在分子量68kDa處亦有一單一的條帶(圖1C顯示血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白做western檢測的情況)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與ANGPTLV的N端15個氨基酸殘基完全相同。
還發(fā)明還提供針對本發(fā)明的多肽-血管生成素類似蛋白V的抗體，其制備方法，以及血管生成素類似蛋白V的模擬化合物、拮抗劑、激動劑或抑制劑。具體內(nèi)容如下用多肽合成儀合成血管生成素類似蛋白V特異性的多肽，將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，用上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，(兩周后)再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次；采用經(jīng)牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做酶連免疫測定兔血清中抗體的滴度(圖4顯示血管生成素類似蛋白V多克隆抗體的效價檢測)；用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG，將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與血管生成素類似蛋白V結(jié)合。
本發(fā)明提供的血管生成素類似蛋白V的模擬化合物，其特征在于該化合物是模擬、促進、拮抗或抑制血管生成素類似蛋白V的活性的化合物。激動劑是指當與血管生成素類似蛋白V結(jié)合時，一種可引起該蛋白質(zhì)改變從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)活性的分子。激動劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合血管生成素類似蛋白V的分子。拮抗劑或抑制物是指當與血管生成素類似蛋白V結(jié)合時，一種可封閉或調(diào)節(jié)血管生成素類似蛋白VI的生物學活性或免疫學活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合血管生成素類似蛋白V的分子。
本發(fā)明還提供篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)血管生成素類似蛋白V的藥劑的方法。激動劑可提高血管生成素類似蛋白V以加強抑制脂蛋白脂酶、調(diào)解血液中游離脂肪酸等生物功能，而拮抗劑等阻止和治療與甘油三酯的分解有關(guān)的脂類代謝異常如糖尿病及其并發(fā)癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達血管生成素類似蛋白V的膜制劑與標記的血管生成素類似蛋白V一起培養(yǎng)，然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
血管生成素類似蛋白V的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。血管生成素類似蛋白V的拮抗劑可以與血管生成素類似蛋白V結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將血管生成素類似蛋白V加入生物分析測定中，通過測定化合物對血管生成素類似蛋白V和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與血管生成素類似蛋白V結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對血管生成素類似蛋白V分子進行標記。
還發(fā)明還提供針對本發(fā)明的血管生成素類似蛋白V及其GST融合蛋白與抗體的實際應用，包括在制備治療與血管生成類似蛋白V異常相關(guān)的藥物中的應用。具體內(nèi)容如下提供了診斷治療與血管生成素類似蛋白V異常相關(guān)的疾病的方法。包括檢測生物樣品中所述多肽或其編碼多核苷酸序列中的突變，或者檢測生物樣品中本發(fā)明多肽的量或生物活性。
抗血管生成素類似蛋白V的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的血管生成素類似蛋白V。與血管生成素類似蛋白V結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于制備針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如血管生成素類似蛋白V高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅血管生成素類似蛋白V陽性的細胞。本發(fā)明中的抗體可用于制備治療或預防與血管生成素類似蛋白V相關(guān)的疾病的藥物。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷血管生成素類似蛋白V的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還提供定量和定位檢測血管生成素類似蛋白V水平的方法。這些方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的血管生成素類似蛋白V水平，可以用作解釋血管生成素類似蛋白V在各種疾病中的重要性和用于診斷血管生成素類似蛋白V起作用的疾病。
本發(fā)明中的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質(zhì)譜分析。
抑制血管生成素類似蛋白VmRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
可以將本發(fā)明中的多肽及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于相關(guān)疾病的治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明中的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。血管生成素類似蛋白V以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的血管生成素類似蛋白V的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。


圖1為血管生成素類似蛋白V和血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的構(gòu)建，表達，純化。其中(A)表達GST-血管生成素類似蛋白V蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建過程，(B)表達和純化GST-血管生成素類似蛋白V的過程檢，(C)表達和純化GST-血管生成素類似蛋白V蛋白的Western檢測。
圖2為ANGPTLV基因在成人組織中的表達譜。圖中16個成人組織從左至右依次為心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎，胰腺，脾，胸腺，前列腺，睪丸，卵巢，小腸，結(jié)腸，外周血白細胞，G3PDH為陽性對照。
圖3為ANGPTLV對脂蛋白脂酶的抑制作用圖示。橫坐標為ANGPTLV相對濃度，縱坐標為相對酶活，以加入GST且未加ANGPTLV時體系中的LPL的酶的活性為100％。
圖4為制備的血管生成素類似蛋白V的多克隆抗體的效價檢測。血管生成素類似蛋白V多克隆抗體的效價為1∶10000。曲線A為抗體濃度與按比例稀釋血清的關(guān)系曲線。曲線B為本底濃度與按比例稀釋血清的關(guān)系曲線。橫坐標為按比例稀釋的血清，縱坐標為抗體在OD450時的濃度。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
1.血管生成素類似蛋白V蛋白和ANGPTLV-GST融合蛋白的構(gòu)建，表達，純化通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的ANGPTLV-GST多核苷酸序列來表達或生產(chǎn)重組的蛋白(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼的ANGPTLV-GST多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組蛋白可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
ANGPTLV-GST的PCR擴增反應的條件(記引物1為SEQ.ID.NO.2，引物2為SEQ.ID.NO.3)引物1-5′-taggggtcgacgtacaaggtaactgtgtacatcattc-3′引物2-5′-ggggcggccgctcattatttaaaatatggattgtacattcttc-3′。此兩段引物的5’端分別含有SalI和NotI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，SalI和NotI酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒pGEX-4T-3(Pharmacia公司產(chǎn)品，Cat.No.27-4583-01)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-{AY169281}質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-{AY169281}質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、AdVantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 30s，60℃30s，72℃ 90s，共30個循環(huán)。用SalI和NotI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEX-4T-3進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含氨芐霉素(終濃度50μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pGEX-4T-3 AY169281)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌RosettaTM(NoVagen公司產(chǎn)品)。在含氨芐霉素(終濃度50μg/ml)和氯霉素(終濃度20μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌RosettaTM(pGEX-4T-3 AY169281)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用固化有谷胱甘肽的親和層析柱(Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品)進行層析，得到了純化的目的蛋白{血管生成素類似蛋白V}。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在分子量68kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與ANGPTLV的N端15個氨基酸殘基完全相同。
2.ANGPTLV-GST融合蛋白的多克隆抗體，ANGPTLV-GST融合蛋白多克隆抗體的制備及其效價測定多克隆抗體的生產(chǎn)可用血管生成素類似蛋白V直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。制備{血管生成素類似蛋白VI}的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohlerand Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產(chǎn)抗血管生成素類似蛋白V的單鏈抗體。
用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述血管生成素類似蛋白V特異性的多肽NH2-Met-Met-Ser-Pro-Ser-Gln-Ala-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Asn-Val-Cys-OH。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，方法參見AVrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與血管生成素類似蛋白V結(jié)合。
3.原核表達、分離并純化的血管生成素多肽V在體外的生物功能的檢測本發(fā)明采納兩種檢測手段1)比色測定法，方法參見張蓉，et al.華西醫(yī)大學報，1996；27106-110；2)同位素檢測法，方法參見Peter Nilssion-Ehle and Michaelc.Schotz，Journal of Lipid Research，1976；17536-541脂蛋白脂酶(LPL)存在于肝外組織毛細血管內(nèi)皮細胞表面。它主要催化血漿中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解，在CM及VLDL的降解中發(fā)揮重要作用。LPL的活性受多種因素影響，它的缺陷或活性降低可導致血漿CM及VLDL降解障礙，引起高甘油三酯血癥。測定LPL活性，對于探討高脂血癥、動脈粥樣硬化的發(fā)病機理及脂蛋白代謝有重要意義。
與以下具體實驗步驟有關(guān)的其它未列出的常用試劑及其配制方法請參考文獻DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1998年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
1)比色測定法a.材料兔肝素后血漿將健康成年家兔稱重，耳緣靜脈取血適量，制備未肝素化血漿，再沿耳緣靜脈按150u/kg注射肝素，15分鐘后再次沿靜脈取血，放置1-2小時后以2500r/min離心5分鐘，得肝素后血漿。
脂肪乳劑(Intralipid)購自華瑞制藥有限公司。
b.試劑游離脂肪酸(FFA)提取液按49∶49∶2(V/V)混合氯仿、正庚烷、甲醇。
pH8.3，0.1mol/LTris-HCL緩沖液準確稱取三羥甲基氨基甲烷(分析純)6.057g，用雙蒸水溶解并稀釋至500ml，2N HCL調(diào)pH至8.3。
銅試劑取0.5mol/L硝酸銅溶液10ml，加2mol/L三乙醇胺溶液5ml，用飽和氯化鈉溶液稀釋至100ml，用10％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.1。
顯色劑稱取二苯卡巴肼40mg，溶于10ml無水乙醇內(nèi)，臨用前加0.1mol/L乙醇胺溶液0.2ml即可。
棕櫚酸應用標準液(500μEq/L)精確稱取棕櫚酸(分析純)51.3mg，溶于100ml提取液中(此為貯存標準液)，臨用前用提取液稀釋4倍。
c.方法脂酶(LPL+HL)總活性測定管2.0ml酶促反應液中含脂肪乳劑10μl；pH8.3，0.1mol/L Tris-HCL緩沖液1.0ml；肝素后血漿0.1ml及雙蒸水0.89ml。上述反應液中省去雙蒸水，加入2mol/L Na/CL溶液1.0ml，則為HL活性測定管(LPL活性被抑制)。將上述各管反應液混勻，37℃水浴保溫60分鐘，分別加入提取液5.0ml，震搖后離心，取下層提取液5.0ml，加入銅試劑2.0ml，再次震搖后離心，取上層提取液2.0ml，加入顯色液0.4ml，混勻后放置15分鐘，30分鐘內(nèi)用分光光度計在550nm處比色。以同樣方法處理的標準罐作對照，計算各管FFA的生成量。
d.酶活性(FFAμEq/ml血漿*h) LPL活性＝脂酶總活性-HL活性2)同位素檢測反應體系0.2ml，包括0.1ml測定底物和0.1ml酶原。
0.1ml測定底物包括2mM甘油-三[9，10-3H]油酸(131kbeq/微mol)；189ng/ml L-a磷脂酰膽堿；14mg/ml小牛血清白蛋白；140mM Tris-HCL(pH8.0)；15％(V/V)甘油；10％(V/V)熱滅活胎牛血清(56度，30分鐘)；重組蛋白樣品0.1ml酶原血漿或組織勻漿測定流程a.反應體系配好后，在37度，孵化2小時b.加入1.05ml 0.1M碳酸鉀-硼酸緩沖液(pH10.5)和3.25ml甲醇-氯仿-正庚烷(141∶125∶100)，混合后劇烈震蕩15秒c.離心3,000g，15分鐘d.取1ml上清，與10ml液體閃爍液混合e.用beckmanLS6500液閃儀測定每管讀數(shù)序列表SEQ.ID.NO.1MMSPSQASLLFLNVCIFICGEAVQGNCVHHSTDSSVVNIVEDGSNAKDESKSNDTVCKEDCEESCDVKTKITREEKHFMCRNLQNSIVSYTRSTKKLLRNMMDEQQASLDYLSNQVNELMNRVLLLTTEVFRKQLDPFPHRPVQSHGLDCTDIKDTIGSVTKTPSGLYIIHPEGSSYPFEVMCDMDYRGGGWTVIQKRIDGIIDFQRLWCDYLDGFGDLLGEFWLGLKKIFYIVNQKNTSFMLYVALESEDDTLAYASYDNFWLEDETRFFKMHLGRYSGSAGDAFRGLKKEDNQNAMPFSTSDVDNDGCRPACLVNGQSVKSCSHLHNKTGWWFNECGLANLNGIHHFSGKLLATGIQWGTWTKNNSPVKIKSVSMKIRRMYNPYFKSEQ.ID.NO.2-5′-taggggtcgacgtacaaggtaactgtgtacatcattc-3′SEQ.ID.NO.3-5′-ggggcggccgctcattatttaaaatatggattgtacattcttc-3′。
權(quán)利要求
1.一種血管生成類似蛋白V，其特征在于具有SEQ.ID.NO1所示序列，以及包含與其一致的氨基酸序列的多肽或其保守多肽、生物活性片斷或衍生物。
2.一種含有編碼如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的多核苷酸的重組載體。
3.一種利用如權(quán)利要求2所述載體遺傳工程化的宿主細胞，以及含有編碼如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的多苷核酸的基因工程化宿主細胞。
4.一種如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的GST融合蛋白構(gòu)建、表達和純化方法，其特征在于具體步驟如下a.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的構(gòu)建用編碼的ANGPTLV-GST多核苷酸或變異體，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；b.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的表達在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；c.血管生成素類似蛋白V-GST融合蛋白的純化從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
5.一種針對如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的抗體。
6.一種如權(quán)利要求5所述的血管生成類似蛋白V的抗體的制備方法，其特征在于具體步驟如下用多肽合成儀合成血管生成素類似蛋白V特異性的多肽，將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，用上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次；采用經(jīng)牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做酶連免疫測定兔血清中抗體的滴度；用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG，將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。
7.一種如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的模擬化合物、拮抗劑、激動劑或抑制劑。
8.一種如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V及其GST融合蛋白抗體在制備治療與血管生成類似蛋白V異常相關(guān)的疾病的藥物中的應用。
9.一種如權(quán)利要求1所述血管生成類似蛋白V的mRNA的寡核苷酸以及核酶。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的血管生成類似蛋白V，以及該多肽及其抗體的制備方法和應用。本發(fā)明提供的新的血管生成類似蛋白V具有SEQ.ID.N01的序列。本發(fā)明還提供該蛋白V的GST融合蛋白及其構(gòu)建、純化方法，該蛋白V的抗體及其制備方法，該蛋白的抗體、模擬化合物、拮抗劑、激動劑或抑制劑在制備與該蛋白V異常相關(guān)的疾病的藥物中的應用。
文檔編號C12N5/10GK101041694SQ20061002366
公開日2007年9月26日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者張佳憶, 陳金中, 季朝能, 顧少華, 謝毅, 毛裕民 申請人:復旦大學